毛细管电泳的基本原理及应用(8页).doc

-毛细管电泳的基本原理及应用摘要：毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。该技术可分析的成分小至有机离子、大至生物大分子如蛋白质、核酸等。可用于分析多种体液样本如血清或血浆、尿、脑脊液及唾液等，比HPLC分析高效、快速、微量。关键词：毛细管电泳 原理 分离模式 应用1概述 毛细管电泳 (Caillary Electrophoresis)简称 CE，是一类以毛细管为分离通道，以高压直流场为驱动力的新型液相分离分析技术。CE的历史可以追溯到 1967年瑞典Hjerten最先提出在直径为3mm的毛细管中做自由溶液的区带电泳(Capillary Zone Electro-phoresis，CZE)。但他没有完全克服传统电泳的弊端1。现在所说的毛细管电泳(CE)是由Jorgenson和Lukacs在1981年首先提出，他们使用了75mm的毛细管柱，用荧光检测器对多种组分实现了分离。1984年Terabe将胶束引入毛细管电泳，开创了毛细管电泳的重要分支: 胶束电动毛细管色谱(MEKC)。1987年Hjerten等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行。同年，Cohen 发表了毛细管凝胶电泳的工作。近年来，将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中，又发展了电色谱，扩大了电泳的应用范围。毛细管电泳和高效液相色谱（HPLC）一样，同是液相分离技术，因此在很大程度上HPCE与HPLC可以互为补充，但是无论从效率、速度、样品用量和成本来说，毛细管电泳都显示了一定的优势毛细管电泳（C E） 除了比其它色谱分离分析方法具有效率更高、速度更快、样品和试剂耗量更少、应用面同样广泛等优点外，其仪器结构也比高效液相色谱（HPLC）简单。 C E只需高压直流电源、 进样装置、 毛细管和检测器。毛细管电泳具有分析速度快、分离效率高、试验成本低、消耗少、操作简便等特点，因此广泛应用于分子生物学、医学、药学、材料学以及与化学有关的化工、环保、食品、饮料等各个领域2。2 毛细管电泳的设备和基本原理毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法3。毛细管电泳仪的基本组成如图1、1 所示 。熔融石英毛细管的两端分别浸在含有电解缓冲液的贮液瓶中，毛细管内也充满同样的电解缓冲液。在毛细管接收端之前安装在线检测系统。被分析样品可以从进样系统采用重力法、电迁移法、抽真空法等多种进样方式引入到毛细管的进样端。当样品被引入后,便开始在毛细管两端施加电压 。样品溶液中溶质的带电组分在电场的作用下根据各自的荷质比向检测系统方向定向迁移。CE中的毛细管目前大多是石英材料。当石英毛细管中充入 pH值大于 3的电解质溶液时 ,管壁的硅羟基(- SiOH)便部分解离成硅羟基负离子(- SiO-) ,使管壁带负电荷。在静电引力下 ,- SiO-会把电解质溶液中的阳离子吸引到管壁附近，并在一定距离内形成阳离子相对过剩的扩散双电层 (见图 24)。在外电场作用下 ,上述阳离子会向阴极移动。由于这些阳离子实际上是溶剂化的(水化的)，它们将带着毛细管中的液体一起向阴极移动，这就是 CE中的电渗流(EOF)。电渗流的强度很高，以致于所有进入毛细管中的样品，不管是阴离子、阳离子或中性分子，都会随着液体向阴极移动。因待测样品中正离子的电泳方向与电渗流方向一致，故最先到达毛细管的阴极端;中性粒子的电泳速度为零 ,迁移速度与电渗流速度相当；而负离子的电泳方向则与电渗流方向相反，但因电渗流速度约等于一般离子电泳速度的 57倍5，故负离子也将在中性粒子之后到达毛细管的阴极端。由于各种粒子在毛细管内的迁移速度不一致，因而使各种粒子在毛细管内能够达到很好的分离。3 毛细管电泳的分离模式根据分离原理不同，CE分离基本模式有6种，如表 1 所示。 表 1 毛细管电泳的分离模式和应用Tab. 1 Separation modes and application of CE以上各模式以毛细管区带电泳、毛细管凝胶电泳、胶束电动毛细管色谱这3种应用较多。4 毛细管电泳的应用4.1 CE在药物成分分析中的应用目前，CE在天然中草药分析领域中的应用主要集中在生物碱和黄酮及其甙类方面、蒽醌类分析也有报道。生物碱有类似于碱的性质，在pH < 7的缓冲液中利用 CZE 分离。纪秀红等6选取马钱子碱为内标物，在磷酸/甲醇缓冲溶液中 ,测定了小檗碱、巴马亭、药根碱的含量。黄酮类化合物大多是中性分子，主要采用 MECC 模式分离。LiYM7以SDS(十六烷基磺酸钠)为阴离子表面活性剂将黄芩中的 6 种主要的黄酮类化合物分离。李伟等8以磷酸盐为缓冲体系 ,利用 CZE模式分离、 测定了大黄提取液中离蒽醌化合物的含量。4. 2 CE在手性拆分中的应用CE因其高效、快速、选择性强的特点而成为目前最有效的手性拆分方法。各种CE分离模式皆可用于对映异构体分离，因此手性拆分成为 CE应用最活跃、 最独特的领域。其中，添加剂法只需向电泳缓冲液中加入合适的手性试剂，经过一定的分离条件优化即能实现手性分离。又因为可选择的添加剂种类很多，此法是 CE进行手性拆分的主要形式。目前 ,主要的手性添加剂有环糊精类（CDs)、冠醚类、大环抗生素、蛋白质等。仅环糊精一类就有-CD，-CD，-CD，HP-CD， CM-CD 等多种添加物质 ,其应用十分广泛。此外，其他种类添加剂的应用结合 MECC和 NACE 模式基本上能实现各种手性药物的拆分911。4.3 CE用于肽和蛋白分析CE在蛋白质分离分析中的应用主要包括肽和蛋白的鉴别分析、结构分析、微量制备，蛋白的定量测定、纯度检测、非均一性检测、定性和动力学研究。CE在肽和蛋白质的别分析中应用最多的是CZE测定肽谱， SDS-CGE测蛋白分子量及CE-MS直接测定分子量。用CZE还可测定蛋白的物理参数，如蛋白的有效尺寸、电荷和扩散系数。用CIEF测定蛋白等电点比平板凝胶电泳测等电点的方法简单，可直接监测。蛋白被酶解或化学裂解成肽片断，利用CZE的高分辨率分离后所得的电泳图称CE肽图。肽图是进行蛋白序列分析的第一步，随后可用CE进行微量制备，再测定各片断的氨基酸序列，即可得出整个蛋白的一级结构。CE的制备总量比高效液相色谱低，只适用于微量制备。对扩散系数小的生物大分子而言，CE比HPLC的分辨率高得多， 因此CE被用来作为收集非常纯的单一馏份的微量制备的手段。在有些情况下，CE定量线性范围可达(3个数量级)。4.4 CE用于糖类的分析近年来，毛细管电泳已成为分析单糖、寡糖、糖肽、糖蛋白等糖类化合物的有力武器，在糖型分析。方面也取得了较大的成功单糖的pKa6值一般大于11，故需选用强碱性的缓冲液（pH>11），使糖基上的羟基去质子而带负电荷， 直接进行电泳分离，用紫外（195nm）检测。也可以选用硼酸盐缓冲液，硼酸盐与糖基络合形成带负电荷的络合物以进行电泳分离，用紫外检测。简单单糖的分析方法也适于简单寡糖的分析12。多糖一般利用酸解或酶解的方法将其转化为寡糖后进行分析。糖蛋白经蛋白酶酶解后生成糖肽，糖肽的图谱被认为是糖蛋白的指纹图谱。糖肽的分离主要是基于其pKa值的不同而进行CE分离，并不是基于糖链结构的不同， 因此所选用的缓冲液的组成及其pH的选择尤为重要，其检测也是基于蛋白质的检测。糖脂既可以直接用CE分离，也可以用神经酰胺聚糖酶将糖链释放出来后进行分析。糖胺聚糖（GAG）类糖基的聚糖部分有透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素和肝素等，一般都含有重复的二糖单元，而且可用裂解酶降解成糖醛酸化酸性寡糖，这些寡糖既带电荷又有紫外吸收（232nm），因此很适合用CE进行分析。另外，CE在糖型分析方面也取得了较大的成功。在糖的检测方面，紫外分析是最早用于CE进行糖类检测的，但它的灵敏度相对不高，检出限一般只有106mol数量级。利用激光诱导荧光检测对糖类进行柱前高效荧光标记，可使检出限达到10-9mol水平。在改进检测系统的同时，中性糖类的极性标记也在不断改进与完善。其中一种极性标记物为8-氨基-萘-1，3，6-三磺酸，利用其可以快速高效地对均一寡糖和复杂多糖进行分离分析， 具有很高的分辨率。4.5CE在临床化学上的应用CE 在临床化学中的应用十分广泛, 所检测样品的来源可分为尿样、血浆血清、脑脊液、红细胞、其它体液或组织以及实验动物活体(invivo)试验。被分析的组分则包括肽类、各种蛋白、病毒、酶、糖类、寡核苷酸、DNA、小的生物活性分子、离子、药物及其代谢产物。具体应用可分为: 临床疾病诊断 临床蛋白分析、 临床药物监测、代谢研究、病理研究、同工酶分析、聚合酶链反应(PCR )产物分析、DNA 片断及序列分析等。所应用的CE 模式包括CZE、MECC、CGE、 CITP 和毛细管等电聚焦(CIEF)13.14。4.6CE用于检测非均一性(多样性, Heterogeneity)许多纯化蛋白, 甚至在它们的天然状态, 往往都不是单一分子片断, 而是由相关分子组成, 称为非均一性(多样性)。产生多样性的原因有: 氨基酸(AA )的序列不同, 如突变体的某位置AA 改变或AA 侧链改变; 后转译产生不同长度的多肽链; 糖蛋白不同程度的糖基化, 如存在不同数量的寡糖链, 寡糖链有不同的单糖组成、 序列及单糖之间的异构连接。 采用CZE, MECC, CIEF, CE-MS 可检测这些非均一性。用于心脏病的重组人组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(rtPA )含 4 个可能糖基。Yim 15用 CZE 和CIEF 研究了制备过程中 rtPA 不同糖基化程度引起的非均一性, 结果表明, CIEF方法要比CZE的好。还有用CZE 对人促红细胞生成素( rHuEPO )16、用MECC对重组人C2干扰素(IFN2C)17及CE-MS18研究蛋白的多样性。有关蛋白的非均一性在临床中的一些应用, 如人铁传递蛋白、血清蛋白的变异、异构酶的分析等。4. 7 CE用于农药残留量的分析对农药残留物的测定国外研究的较多。Lazer等19将飞行时间质谱和毛细管电泳仪联用，采用样品堆积技术进样对 Paraquat 和 Diquat 两种除草剂进行了分离，检测限低至 10- 17mol/L。Farran等20采用(乙腈) = 50 %的磷酸-硼砂缓冲液分离出两种苯氧羧酸类除草剂。Hinsmann 等21通过自动在线浓缩样品， 采用固相微柱以十二烷基硫酸钠(SDS)作胶束 ,添加少量乙腈 ,在13min内分离测定了水中的7种不同种类的农药。磺酰脲类化合物是一类相对较新的除草剂 ，因此这一类化合物在水和食品中的残留量的测定十分重要。Lipez Avila等22采用3mODS硅胶填充柱来分离这一类化合物 ,线性范围为1100mg/L。Mayer等报道了农药Cinosulfuron 及其副产物的毛细管电色谱的分离分析。游静等23对毛细管电泳在农药手性拆分的进展做了综述。4.8 CE用于纯度检测CE在国外分子生物学实验室及生物工程药厂里已广泛用作最有效的纯度检测手段。当蛋白的疏水性相近时, 它们在HPLC 柱中往往同时流出, 因此在对蛋白进行结构研究(包括N 端序列和肽谱)之前, 必须监测从HPLC 所得肽片断的纯度。快速CE 纯度检测可节约样品和节省序列测定所需时间。因CE 和RP2 HPLC 分离机理不同, 所以当用CE 检查由RP2HPLC 纯化制得的某一合成肽(一个峰, 纯度为 99.12% )时, 发现分出 6 个组分, 主峰纯度仅为50%。或许这就是部分基因工程产品用HPLC 检测纯度很高而实际生物活性却各批差异很大的一个原因。至于用CE 对药厂生产及QC 作纯度检测的应用实例比比皆是, 如对胰岛素、白细胞介素、人生长激素、粒性巨噬细胞菌落刺激因子(用CIEF )等的检测。纯度检测时用CE 可检测出多肽链上单个氨基酸的差异。CE 用于纯度检测可用CZE,MECC, SDS2 CGE, CIEF 多种模式。还有文献讨论了用不同方法(包括RP2 HPLC, IEC2 HPLC, SDS2PA GE 及CE)进行纯度检测的最有效的策略24。5 结 论作为一种蛋白质、多肽、核酸及其他生物分子分离和分析的重要技术，近20年来，毛细管电泳的机理探索和应用研究都取得了长足的进展，对毛细管电泳的研究， 使其分离效率和分析精度不断提高，也使其应用领域不断扩大，推动了生物技术的不断发展。毛细管电泳今后发展方向仍是继续提高分辨率、速度和检测器的选择性。同时，增加自动进样装置和使之微机化、商品化。另外，将它与质谱仪更好地结合，可对生物分子特性作出更快、更准确的分析，以进一步拓宽毛细管电泳在生物领域的应用范围。-第 7 页-