提取RNA及PCR步骤(4页).doc
-提取RNA及PCR步骤-第 4 页一、提取组织RNA1准备好冰盒、管(无RNA酶)、剪刀及镊子（需消毒，再用灭菌纯水和DEPC水洗净）、钻头、灭菌纯水等。2. 取出冻存管，剪取约放于EP管。3. 即刻加1ml trizol，剪碎至无可见微粒，静置5-10min4. 加0.2ml 氯仿，盖紧EP管，上下倾倒，混匀15s, 15-30静置2-3min5. 离心12,000g*15min, 2-86. EP管内分三层，取上层液相置于新EP管7. 加异丙醇，上下颠倒混匀，15-30静置10min8. 离心12,000g*10mim, 2-89. 弃上清（不用吸净残液），加1ml 75%乙醇清洗沉淀(乙醇用前需4预冷)10. 离心10000/7500g*5min, 2-811. 去上清（需吸净残液），干燥RNA(超净台内风干至白色变透明状，约1h以上), 加1012ul DEPC水解（约1h以上），测浓度，-80保存。PS：1.所用枪头、EP管、DEPC水、纯水、剪刀、镊子均需灭菌。2.75%无水乙醇用前需4预冷。3若最后提取出的RNA量多，可加30ulDEPC水溶解;若难以溶解，可置于55水浴加热。4破碎：取组织勿过多，否则难以破碎，亦难以提取RNA；一个样品破碎过后需清洗，顺序为：酒精棉球擦洗DEPC水洗拆分清理纯水洗棉球吸去钻头残液。5. 破碎仪的使用：打开前先保证已调于低档，将钻头浸没于样品中，切忌在空气中空转，从低到高慢调，同时上下轻移样品，注意力度控制，避免液体飞溅误伤；同时注意听破碎时的声音，若有尖锐声音发出，说明有异物卡住钻头，需停止查看。二、提取细胞RNA1. 细胞加1ml trizol 裂解5min, 15-302. 加0.2ml 氯仿，盖紧EP管，上下倾倒，混匀15s, 15-30静置2-3min其余步骤参见提取组织RNA的第5步开始PS：1. 新EP管需用无RNA酶EP管。2. 操作过程需时刻注意避免污染，EP管取放时勿碰到内壁及管口，每步操作前需适时擦拭双手及枪管。3RNA勿照紫外。4DEPC水量较关键，需保证RNA充分均匀融解，若可用肉眼看到白点，可多加至20ul。三、测RNA浓度：准备96孔板开盖，盖子朝天放加98ulEDPC预读（setting：OD值 260；选中区域；选“预读”） “Read” 结果复制拿出孔板，再加2ulRNA直接“READ” 复制结果（复制后的结果与软件上的不同，此为已经相减后的数据）重设条件（setting：OD值 260 280；选中区域；“Normal”；“Delete”；“OK”） “READ” 复制结果数据处理：CRNA(ug/ml)=“Normal”值预读值CRNA(ug/ul)=50(稀释倍数)*40（OD值）*1/1000* CRNA(ug/ml)=2* CRNA(ug/ml)VRNA=1ug（可变）/ CRNAVH2O=V（总体积由说明书得）VRNAPS：260/ C280的比值意义范围为1.82.0,小于可能是蛋白含量较多，大于可能是DNA含量较多2往孔板加液时，勿使枪头顶端碰触孔板内壁，以防损伤内壁包被液3. 样品多的话，不用分别加入，可先配总量，再分装四反转录PCR1加：1ul oligo(dT)1ng5ug 总RNA1ul 10mMdNTP混合物灭菌水（DEPC） 加至11ul（12-1）2混合物：放入PCR仪65， 5min结束后迅速移至冰上3加：4ul 5*buffer2ul DTT轻混匀PCR37， 2min4. 室温下加入1ul M-MLV轻混匀（防气泡）5PCR仪：37，50min + 70,15min + 4, 5minPS:1.冰上操作，严格遵守无RNA酶操作2加液时，枪头贴近液面快速打出液体，提离液面后放松五Q-PCR1. 加液：SYBR 5ul（ ROX （eppendorf AG PCR无需加此物）Primer 0.20.2ulcDNA H2O 2. 离心：A、8联管：样品对称离心打开离心机总开关打开盖子对称放入样品盖面上的白点对准机孔边的标签盖好按“启动” 转速升到“1100”左右按“停止” 等转速降至“60”左右开盖取出仪器复位B、96孔板：水平离心，3000rpm,3-5minPS：加液或转运样品时均需用到冰盒。3. 实时荧光定量PCR的使用（eppendorf AG PCR）：A仪器结构：上部为荧光检测仪，下部为热循环仪；银质模块，光源为LED；2个光电倍增管（CPM检测器）；4通道检测：520nm,550nm,580nm,608nm；B. 备注：运行前需预热15min,PCR仪可过夜运行。此仪器需3个月校正一次，用DDwater（去离子水）20ul，默认校正温度为60。默认热启动，每分钟升温8，可1次自检/15min。关于指示灯：闪烁表明在运行；亮绿灯表明在保温；亮桔灯表明在自检。软件登录密码为E/e；连续开启软件，间隔时间为1-2s；此仪器无需用ROX作为校正荧光。此程序可根据已完成循环的荧光信号（原始数据）进行数据分析，在反应结束前即可观察结果。设置条件时一般选择相对定量，即蓝色桶状图标；红色桶状图标为绝对定量。C软件操作：开启电脑开PCR仪双击软件图标口令“E/e” 点击软件界面上端菜单左2进入操作界面建立用户：点击上左6，选第一个，点击进入设置（选择管理员用户）等待指示灯由黄变绿进入界面“plate layout”进行设置，“Filter 520nm”: “SYBR”；“Sample Vol”:上样体积；“background”:“Axygen 8-strips”(80管)放入样品（记住安放顺序，盖紧盖子且勿污染盖面，轻放样品以防产生气泡或产生内壁残液）点住鼠标左键，选定样品区域，点击右键，选择“unkown”（相对定量），标记引物名称选定内参区域，点击右键，选择“Standard”（相对定量），标记内参名称转换界面进入“PCR Program”，设置反应体系（鼠标移至目标区域，点击右键，选“Insert”,插入所需项）；选中下方的 “TSP Heated Lid”及“Impulse”；“Temp.Mode”：“standard ”设置完后需保存，在点击“运行”反应体系：95 2min94 15s40*(荧)60 25s溶解曲线(点击鼠标右键“Insert” “Melting”)：95/94 15s60 15s荧 20min95/94 15sD结果分析：调节基线，选择阈值（标准：同样品两孔之间的阈值差值）取样品及其副孔的阈值平均值平均值-相应内参的阈值=相对值得出的最大相对值逐一去减其他的相对值得出的结果设为X，运用公式Power(2,x)得出最终的数据
