DNA提取过程及基本知识.ppt

第一部分,DNA 提取过程及原理,盐溶法（萃取） 1研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。 （从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA， 即核糖核蛋白。） 2利用DNA不溶于0.14mol/L 的NaCl溶液而RNA能溶于0.14mol/L 的NaCl溶液这一性质,将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品破碎细胞液中分开。,3 分离得到核蛋白后，还需进一步将蛋白等杂质除去。去除蛋白的方法有 3种： 用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除 去变性蛋白质。用这种方法处理时，蛋白质停留在水相和氯仿相中间，而 DNA则溶于上层水相，用两倍体积的95%乙醇溶液可将DNA钠盐沉淀出来。, 用 十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，从而使其与核酸分离 用苯酚处理，然后离心分层。DNA溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内， 吸出上层水相，加入两倍体积的95%乙醇即可得到白色纤维状DNA沉淀。,第二部分,核酸电泳,TAE是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量（TBE中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量），且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约10%，电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果，此外，回收DNA片段时也易用TAE缓冲系统进行电泳。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。,TBE的特点是缓冲能力强，长时间电泳时可选用TBE，并且当用于电泳小于1kb的片段时分离效果更好。TBE用于琼脂糖凝胶时易造成高电渗作用，并且因与琼脂糖相互作用生成非共价结合的四羟基硼酸盐复合物而使DNA片段的回收率降低，所以不宜在回收电泳中使用。 TPE的缓冲能力也较强，但由于磷酸盐易在乙醇沉淀过程中析出，所以也不宜在回收DNA片段的电泳中使用。,