MTT法检测细胞相对存活率(教学材料95页).ppt

实验八,MTT法检测细胞相对存活率（教材95页） 细胞凋亡诱导分析检测技术（教材162页）,MTT法检测细胞相对存活率（教材95页）,【方法与步骤】 （1）传代5104个/100ml 人子宫颈癌细胞HeLa于96孔板， 37C培养过夜； （2）每孔加入不同剂量的大蒜素（1、10、20 ml），每种剂量加三孔，以药物溶剂作对照， 37C培养0.5h； （3）于各孔加入10ml 5mg/ml MTT， 37C培养1h； （4）吸弃培养液，各孔加入100ml DMSO，振荡培养板， 37C培养10min； （5）用酶联仪测定光密度值（以空白调零），通过与对照组比较得到实验组的存活率。 【结果与观察】 （1）加MTT后，倒置相差显微镜下观察可见黄色的MTT被还原成紫蓝色颗粒，加DMSO后紫蓝色颗粒溶解； （2）各组OD值取平均值后，以下式计算存活细胞百分数： 存活细胞%=（OD实验/OD对照）100%,对照组,实验组,细胞凋亡诱导分析检测技术,Cell Death,细胞坏死初期，胞质内线粒体和内质网肿胀、崩解，结构脂滴游离、空泡化，蛋白质颗粒增多，核发生固缩或断裂。随着胞质内蛋白变性、凝固或碎裂，以及嗜碱性核蛋白的降解，细胞质呈现强嗜酸性，故坏死组织或细胞在苏木精/伊红染色切片中，胞质呈均一的深伊红色，原有的微细结构消失。在含水量高的细胞，可因胞质内水泡不断增大，并发生溶解，导致细胞结构完全消失，最后细胞膜和细胞器破裂，DNA降解，细胞内容物流出，引起周围组织炎症反应。,表15-2 细胞凋亡和细胞坏死的区别,图左，正常胸腺细胞；右，凋亡胸腺细胞（注意凋亡小体）,Ho.33342与PI荧光双染显示凋亡与坏死细胞（教材168页）,【方法与步骤】 （1）传代5104子宫颈癌细胞HeLa于含有盖玻片的24孔板， 37C培养过夜； （2）每孔加入5ml的大蒜素，以药物溶剂作对照， 37C培养0.51h； （3）加入PBS，洗细胞5min X 3次； （4）取出细胞爬片，加入50ml荧光染料Heochst 33342/PI混合液， 室温避光放置30min； （5）加入PBS，洗细胞5min X 3次； （6）用吸水纸吸取爬片上的液体，滴加5ml碱性甘油于载玻片上，将爬片上的细胞面向下盖于碱性甘油中，避免产生气泡，树胶封固后荧光显微镜观察。,【结果与观察】,在紫外光激发下，HeLa正常细胞发出柔和的蓝色荧光，凋亡细胞细胞核发出明亮的蓝色荧光，坏死细胞发红色荧光； 正常细胞核荧光均匀，而凋亡细胞核凝集的染色质发强蓝色荧光，周围可见带蓝色荧光的凋亡小体。,