PCR法获取目的基因.ppt
PCR法获取目的基因,农学112班 马晴晴 孙婷婷 张 娜 金漪倩 胡 斐 徐振鹏,PCR技术的定义及其发展历史 PCR技术的原理 PCR的反应体系和条件 PCR法获取目的基因 PCR技术的未来展望,PCR技术 多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),PCR技术即多聚酶链式反应，又称聚合酶链式反应。是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。 在生物学实验中做为基础存在，可以说是现代分子生物学研究中最重要的技术。,一、PCR技术的创建,1.Khorana等1971年提出在体外经DNA变性、 与适当引物杂交、再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 2.1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 3.1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术。 4.1988年，第一台PCR仪问世。 5.1989年美国Science杂志比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,二、 PCR技术的原理,1. PCR技术,在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧核苷酸,耐热性DNA聚合酶, 一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段的循环合成DNA，每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍。一般样品经过30次循环,可使基因的拷贝数达到数百万。,PCR原理 （1）类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于寡核苷酸引物的存在 （3）重复“变性-退火-延伸”的循环，可获得大量的新DNA链，而且这种新链又可成为下次循环的模板，从而指数级地获得大量DNA产物，数小时内可使目的基因的数量扩增数百万倍。,（2）PCR过程：由变性复性（退火）-延伸三个基本反应步骤构成 变性：94左右，使双链DNA模板解离成为单链； 复性：55左右，引物与模板DNA单链互补配对结合； 延伸：72左右，“模板-引物结合物”在DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，以靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成新的DNA链,2. PCR技术的特点,1）速度快，灵敏度高：经过30轮循环，理论上目的产物的 扩增量达230个拷贝（109拷贝）。 2）特异性：引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键；引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能减少非特异性扩增。 3）操作简便易行：只需要数小时就可以用电泳法检出1g基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。,三、PCR的反应体系和基本步骤,H2O 35L 10PCR反应缓冲液 5L 25mmol/L MgCl2 4L 4种dNTP 4L 上游引物（引物） 0.5L 下游引物（引物） 0.5L 模板DNA (约1ng) 0.5L Taq酶 0.5L,1 .反应体系组成成分（总体积：50 L）,模板DNA dNTP 引物 Buffer Mg2+,预变性,模板DNA dNTP 引物 Buffer Mg2+,TaqDNA聚合酶,94 5min,2. 基本程序,PCR排管,Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer Mg2+,循环仪,94 55 72 ,72 57 min,循环2535次,扩增出的目标基因,转移点样 进行电泳,扩增出的目的基因,3. PCR反应条件 循环参数 （1）预变性：94 5 min （2）变性：94 20 s-45 s 使双链DNA解链为单链 （3）退火：温度由引物的解链温度Tm决定，时间45 s左右。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合；降低温度 可增加反应的灵敏性。 （4）延伸：一般为72，时间由扩增片段长度决定。 （5）循环次数：主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35次 次数过多，导致扩增效率降低，错误掺入 率增加。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝数。 （6）延伸补齐：72 5 min10 min,PCR技术的注意事项,1.合理分隔实验室将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其他步骤严格分开。 2.吸样枪由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。 3.试剂分装所有的PCR试剂都应小量分装，-20保存，以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR试剂和PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存。 4.防止操作人员污染一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。,四、PCR法获取目的基因,由Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为Taq DNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时可以使用T载体克隆目的基因。,1. T载体克隆PCR获取的目的基因,具有3-5 外切酶活性的DNA 聚合酶（如pfu聚合酶），其扩增的PCR 产物是平末端, 要对这种平末端的PCR 产物进行克隆, 应首先对PCR产物的3末端进行加A的工作。工作程序如下,方案一 胶回收平末端 PCR产物，进入5l 10Tag DNA Polymerase Buffer、4种dNTP或dATP（终浓度为200nM）、2.5U Tag DNA Polymerase，加水至终反应体积为 50l，72 保温10min，纯化 PCR片段后进行TA克隆,方案二 PCR 反应（50l 反应体积）结束以后，加入1l 20mM dATP 和2.5U 的Tag 酶，72 保温10min ，然后进行直接进行TA克隆,2 .设计酶切位点克隆PCR获取的目的基因,3,5,限制性内切酶的识别序列,目的基因的PCR片段,3,5,限制性内切酶的识别序列,经限制酶切割得到的具有粘性末端的线性载体,经限制酶切割得到粘性末端,体外连接,获得目的基因的克隆,1 、不对称PCR 2 、反向PCR (reverse PCR) 3 、多重PCR（复合PCR） 4、 LP-PCR（Labelled primers) 5 、锚定PCR（anchored PCR, A-PCR） 6 、PCR固相分析法 7 、原位PCR 8 、反转录PCR（RT-PCR) 9、 荧光定量 PCR（real-time PCR),五、PCR的类型,荧光定位PCR技术（FQ-PCR）,FQ-PCR的工作原理是利用Taq 酶的5 3外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记的探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5端标以荧光报告基团，靠近3端标以荧光淬灭基团，两者之间构成能量传递结构。,当PCR反应每复制一个特异核酸片段，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物是一对一的关系，因此用荧光检测技术检测,出的荧光信号有无或强弱，即代表扩增产物有无或多少。由于荧光信号是代表扩增产物的有效特异信号,实现了仪器实时检测，为新的PCR定量原理创造了条件。,PCR技术的应用举例：,研究：基因克隆；DNA测序；分析突变；基因重组与融合；鉴定与调控蛋白质结 合DNA序列；转座子插入位点的绘图；检测基因的修饰；人类基因组工程：用散布重复序列产生DNA标志；遗传图谱的构建(检测DNA、 多态性或精子绘图)；物理图谱的构建；测序，表达图谱 法医：犯罪现场标本分析，DNA检测比对，DNA安保标记。 医疗：肿瘤：胰癌、结肠癌、肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、血液恶性肿瘤等癌症的筛查。 组织和群体生物学：遗传聚类研究；动物保护研究。 古生物学：考古与博物馆标本分析。 动物学：动物传染病的诊断等。 植物学：检测植物病原等。,PCR技术的未来展望,到2030年，由于基因技术的空前发展，一个人的全部基因组序列可能只需要1000美元就能得到。 基因定制，基因医疗，基因药物都不会再是设想，而将逐渐成为现实，而这一切，都建立于PCR技术所树立起来的基础之上。随着技术发展，个人基因信息也许会成为新的重要隐私。,谢谢！ 请老师和同学们批评指正。,
