植物生理学实验指导(45页).doc

-植物生理学实验指导-第 41 页植物生理学实验指导主编 张立军参编 （按姓氏汉语拚音） 樊金娟 郝建军 刘延吉 阮燕晔 朱延姝沈阳农业大学植物生理学教研室2004年1 月序实验课是提高学生动手能力，提高分析问题和解决问题能力的重要途径。植物生理学教研室的全体教师和实验技术人员经过多年的教改探索，认为实验课教学要注意基本实验技能的训练、要有助于提高学生的动手能力，有助于使学生熟悉实验工作；实验内容要有挑战性，能够吸引学生的兴趣。为此，我们在借鉴国外高校和国内其他高校的先进教学经验的基础上，提出了一系列提高实验课教学质量的改革措施，这些措施涉及到实验内容的设置、实验的设计、实验报告的写作，以及实验指导书的编写等多个方面。本学期的实验教学是我们实验教学改革探索的一部分。所有的实验都设计成研究型的，有适当的处理，并尽可能的设置重复。同学们能够通过实验解释一个理论或实际问题。在本次编写的实验指导中我们给出了大量的思考题，有的涉及实验中应注意的问题，有的涉及实验技术的应用，有的涉及实验方法的应用扩展；此外，我们还要求实验报告的形式类似于正式发表的科研报告，并附有写作说明，这有利于培养学生写作科研论文的能力。为了培养良好的科研习惯，对每个实验还都给出相应的记录方式。本学期是我们教研室首次按这项教学改革研究成果组织教学，希望广大同学配合，也希望相关专业老师、相关部门的领导及广大同学提出宝贵意见、以便使植物生理学实验教学改革更加完善。张立军2004 年1月30日附：参加教学改革人员： 刘延吉 郝建军 樊金娟 朱延姝 阮燕晔 康宗利 付淑杰 于洋 目 录Section 1（1h）植物生理学实验课简介1 教学目的2 教学要求和考核3 实验内容介绍4 实验室安全要求Section 2（6h）一、植物的光合速率测定-改良半叶法二、植物叶绿素素含量测定-丙酮提取法Section 3（6h）三、植物组织水势测定-小液流法四、植物根系活力测定-甲烯蓝法Section 4（6h）五、植物抗逆性鉴定-电导率仪法六、植物组织丙二醛含量测定Section 5（4h）七、植物组织硝态氮含量的测定Section 6（4h）八、植物呼吸酶活性测定 附录一、如何写实验报告二、简单常用的生物统计公式三、分光光度计的操作四、电导率仪的操作Section 1（1h）植物生理学实验课简介1教学目的植物生理学是一门实验科学，植物生命活动的基本规律和及其生理机制都是通过实验揭示的。所以掌握植物生理学的实验技术、基本原理以及研究过程对了解植物生理学的基本理论是非常重要的。本课程的主要目的有：(1) 直接验证一些植物生理学理论；(2) 熟悉植物生理学实验程序；(3) 学习如何提出问题及假设并用特定实验证实或解决；(4) 锻炼协同工作能力和独立工作能力；(5) 学习植物生理学实验报告和科研报告的写作。(6) 培养严谨的科研作风。（7）锻炼自学能力。2教学要求和考核选修本门课程的学生在上实验前必须熟悉实验室要求，每次实验前要对内容进行预习。实验课不得缺席。缺席者不得参加期末考试，成绩计为不及格。植物生理实验单独计成绩（100分）。考核包括平时表现（20分）、实验前作业（10分）、实验报告（30分）、实验后作业（10分）和期末考试（30分）五个部分。只要有一次不提交实验作业或不提交实验报告，不得参加期末考试，最终成绩计为不及格。期末考试覆盖植物生理学实验教学的全部内容。期末考试时间为1学时。平时表现包括是否按时到达实验室，是否预习实验内容，是否遵守实验室纪律，是否认真操作，是否做好实验记录，是否作风严谨，是否整洁，是否按要求值日，是否按时提交作业和实验报告。作业和实验报告都要标明同组同学姓名。作业指回答每个实验所给出的思考题。思考题分为两部分。一部分是实验前的预习题，另一部分是实验后的思考题。回答问题所涉及的知识不局限于本实验指导书，需要参考理论课教科书、其他实验指导书和网络资料。由于植物生理学理论教学和实验教学并不同步，因此作业要靠同学们自学完成。作业可由同组同学合作完成。但每个同学必须独立提交作业。预习作业在每次实验开始前提交，做为预习情况检查的一部分，由指导老师检查后再返回，预习作业不合格者不得参加实验。返回的预习作业完善后再与实验后作业本以及实验报告一并于实验后一周内由课代表统一提交。实验报告的写作见附录。实验报告在实验后的一周内提交。实验报告最好打印。同组同学可分享数据，但是所有的写作、图表绘制、数据计算和分析必须独立完成。如果发现雷同报告两次者，取消雷同报告者的实验课考试资格，最终成绩评定为不及格。实验报告成绩综合下列各个方面评定：（1） 是否提出问题和假设并清楚的进行阐述；（2） 是否清楚地叙述实验程序；（3） 实验数据是否清楚的既用表又用图表示；（4） 结果部分是否有语言描述；（5） 结论是否适当以及是否与测定数据有关；（6） 是否解释数据支持或否定假设的原因，或有没有解释实验是否解决所提问题；（7） 是否提出存在问题并做出解释，以及提出后续试验；（8） 实验报告是否简洁；（9） 实验报告是否组织良好；（10） 实验报告是否完整；（11） 实验报告语法和书写是否正确。3实验内容介绍全部植物生理学实验包括五个部分8个内容，涉及光合作用、呼吸作用、水分生理、根系生理、发育生理、抗性生理、衰老生理等，总计27学时。共上5次实验，section为 1 学时；Secton 2、Secton 3、Secton 4，各包括两个实验内容，各6 学时；Secton 5、Secton 6各一个内容，各 4学时。每次实验都设计成研究型实验，有处理，在可能的情况下都设有重复，实验结果需要整理分析。每个同学都要根据实验内容提出问题和假设，并写出类似科研报告的实验报告。4实验室工作和安全要求(1) 发生任何事故都必须立即报告；(2) 上实验课不要穿好衣服，最好穿实验服，在操作中注意防止腐蚀性物质损坏衣物；(3) 不准在实验室吃食品，不准喝水或饮料，不准吸烟，避免用手接触口鼻，防止有害物质的侵害；(4) 易燃物质必须远离火源；(5) 打坏的玻璃器具碎片必须小心的从地上、实验台上或水池中拾起放入垃圾筒中，以防伤害他人；(6) 随手关闭水龙头，特别是遇到停水的时候；(7) 在教师未讲解前不得擅动仪器设备，不得擅动实验室内与实验内容无关的仪器设备；(8) 保持实验台清洁，以最大限度的减少事故的发生；(9) 实验结束后，必须清洁自己所用的实验用具和实验台；(10) 离开实验室前需向指导教师报告，经老师检查实验用具清洁、摆放以及实验台卫生合格后，方可离开；(11) 离开实验室前将手清洗干净。(12) 每个班同学分组负责实验后的实验室清洁工作，包括清洁实验台、摆放实验用品、关闭仪器及电源、清理水池、检查水龙头是否关闭、拖地和倒垃圾。值日生清洁工作结束得到老师认可后方可离开。其他要求见实验室墙上的有关规章制度。第一次实验的第一内容是熟悉实验室墙上的各种实验室规章制度。Section 2（6h）一、植物的光合速率测定-改良半叶法光合作用是绿色植物特有的生理功能，是绿色植物吸收光能将CO2和H20合成为有机物质并释放O2的过程。光合作用及其有关过程的测定是植物生理学实验的重要组成部分。 光合作用是由原初反应、同化力形成和二氧化碳同化3个主要阶段组成。原初反应包括光合色素对光能的吸收、光能的传递和光化学反应，主要与叶绿素和其他光合色素有关；而同化力(ATP和NADPH2)的形成主要与膜的特性有关，二氧化碳同化除受同化力供应影响外，还受与暗反应有关酶活性的影响。光合作用强弱与环境条件变化密切相关。 光合速率是植物生理性状的一个重要指标，也是估测植株光合生产能力的主要依据之一。光合速率可根据植物对CO2的吸收量，O2的释放量或干物质(有机物质)的积累量来进行测定。随着光合作用研究的深入，光合作用测定技术的水平也在不断提高，方法和手段也越来越多。本次实验学习光合速率测定最经典的方法之一-改良半叶法。原理植物叶片的主脉两侧对称部分叶面积基本相等，其形态和生理功能也基本一致。用物理或化学方法处理叶柄或茎的韧皮部，保留木质部，以阻断叶片光合产物的外运，同时保证正常水分供应。然后，将对称叶片的一侧取下置于暗中，另一侧留在植株上保持光照，继续光合作用。一定时间后，测定光下和暗中叶片的干重差，即为光合作用的积累的干物质量。通过公式计算出光合速率。乘以系数后还可计算出C02的同化量。 材料、仪器、药品 1材料：任选户外一种植物。 2仪器及用品：(1) 剪刀；(2) 4块湿纱布；（3）带盖磁盘；(4) 30个小纸牌，去户外之前用铅笔编号（115；115）；(5) 镊子；(6) 打孔器；（7）铅笔；（8）记号笔；(9) 12个称量瓶；(10) 烘箱；(11) 分析天平；（12）干燥器。 3药品：5三氯乙酸。方法 1取样：在户外选择较绿和较黄的同种植物叶片各15片，要注意叶龄、叶色、着生节位、叶脉两侧和受光条件的一致性。绿叶和黄叶分别用纸牌编号（例如绿叶为1、2、315，黄叶为1、2、315）。增加叶片的数目可提高测定的精确度。 2处理叶柄：为阻止叶片光合作用产物的外运，可选用以下方法破坏韧皮部。(1) 环割法：用刀片将叶柄的外层(韧皮部)环割0.5cm左右。为防止叶片折断或改变方向，可用锡纸或塑胶套管包起来保持叶柄原来的状态。(2) 烫伤法：用棉花球或纱布条在90以上的开水中浸一浸，然后在叶柄基部烫半分钟左右，出现明显的水浸状就表示烫伤完全。若无水浸状出现可重复做一次。对于韧皮部较厚的果树叶柄，可用融熔的热蜡烫伤一圈。（3）抑制法：用棉花球蘸取5三氯乙酸或0.3mol/L的丙二酸涂抹叶柄一周。本实验统一使用三氯乙酸。注意勿使抑制液流到植株上。选用何种方法处理叶柄，视植物材料而定。一般双子叶植物韧皮部和木质部容易分开宜采用环割法；单子叶植物如小麦和水稻韧皮部和木质部难以分开，宜使用烫伤法；而叶柄木质化程度低，易被折断叶片采用抑制法可得到较好的效果。 3剪取样品：叶柄处理完毕后即可剪取样品，并开始记录时间，进行光合作用的测定。首先按编号次序（绿叶和黄叶交替进行）剪下叶片对称的一半(主脉留下)，并按顺序夹在湿润的纱布中（绿叶与黄叶分开保存），放入磁盘中，带回室内存于暗处。23h后，再按原来的顺序依次剪下叶片的另一半。按顺序夹在湿润的纱布中（绿叶与黄叶分开保存）。注意两次剪叶速度应尽量保持一致，使各叶片经历相同的光照时间。 4称干重：取12个称量瓶分别标上绿叶光照1、2、3，绿叶黑暗1、2、3，黄叶光照1、2、3，黄叶黑暗1、2、3，将各同号叶片照光与暗中的两半叶叠在一起，用打孔器打取叶圆片，分别放入相应编号的称量瓶中（即光下和暗中的叶圆片分开）。每5 个叶片打下的叶圆片放入一个称量瓶中，做为一个重复。记录每个称量瓶中的小圆片数量。打孔器直径根据叶片面积大小进行选择，尽可能多的打取叶圆片。注意不要忘记用卡尺量打孔器的直径。将称量瓶中叠在一起的叶圆片分散，开盖置于105烘箱中烘10min以快速杀死细胞，然后将温度降到7080，烘干至恒重(24h左右)。取后取出加盖于干燥器中冷却至室温，用分析天平称重。 5结果计算： W2-W1A×t光合速率(mgDW·m-2 s-1)= 式中 W2：照光半叶的叶圆片干重(mg)；W1：暗中半叶的叶圆片干重(mg)；A：叶圆片面积(m2)；t：照光时间(S)。 若将干物质重乘以系数1.5，便可得CO2的同化量，以mgC02·m -2S-1表示。实验记录1实验材料：植物名称：种植地点：发育时期：试验处理：植物的生长状况：取样部位及数量：2实验时间： 年 月 日 时 分 至 时 分3实验条件记录项目实验开始时实验结束时平均值时间温度光强风速二氧化碳浓度4测定数据记录重复叶圆片数量叶圆片总面积m2暗中半叶干重mgW1照光半叶干重mgW2光合速率mgDW·m-2 S-1绿叶123平均值标准差黄叶123平均值标准差5其他问题记载：实验前思考题（1） 通过光合作用测定你能够解决什么理论和实践问题？（2） 说明光合作用的生理意义及其测定光合作用的重要性。（3） 根据光合作用的反应方程式，光合作用涉及到二氧化碳、水、氧气、有机物质和光能的吸收，哪些因子可作为光合作用测定的指标？为什么？请简述各种光合作用测定方法的基本原理？比较各种方法的优缺点？（4） 为什么选择叶龄、叶色、着生部位和受光一致，以及主脉两侧对称的叶片？（5） 为什么将待测叶片编号？（6） 在改良半叶法中为什么要杀死韧皮部？（7） 三氯乙酸在本实验中起什么作用？为什么？ （8） 有三种杀死韧皮部的方法，各适用何种试材？（9） 在取样称重时，为什么将同号叶片的两个半叶叠在一起用打孔器打取叶圆片？（10）烘干时为什么样品放入称量瓶，在烘箱中不加盖，而从烘箱取出时需要加盖，并放入干燥器中？（11）如果将先取回的半片立即打孔取样烘干，对最后的测定数据将会产生什么样的影响？为什么？（12）在烘干过程中，为什么需要用105的高温10min杀死细胞？如若不然，将对实验数据产生什么样的影响？（13）测定时间过短对所测定的光合作用速率会产生什么样的影响？为什么？测定时间过长又会产生什么样的影响？为什么？（14）为使不同时间测定的数据具有可比性，你认为需要控制什么环境条件？为什么？（15）写出实验时间安排和操作流程图。实验后思考题（挑战题）（1）测定时间过长对不同光合产物输出类型植物的影响大小相同吗？（2）从原理上讲，改良半叶法还可用于何种植物生理生化指标的测定并需要做何修改？请说明之。二、植物叶绿素含量测定-丙酮提取法高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素(光合色素)吸收的。叶绿体色素由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。叶绿体色素的提取、分离和测定是研究它们的特性以及在光合中作用的第一步。叶片叶绿素含量与光合作用密切相关，是反眏叶片生理状态的重要指标。在植物光合生理、发育生理和抗性生理研究中经常需要测定叶绿素含量。叶绿素含量也是指导作物栽培生产和选育作物品种的重要指标。原理叶绿素不溶于水，溶于有机溶剂，可用多种有机溶剂，如丙酮、乙醇或二甲基亚砜等研磨提取或浸泡提取。叶绿色素在特定提取溶液中对特定波长的光有最大吸收，用分光光度计测定在该波长下叶绿素溶液的吸光度(也称为光密度)，再根据叶绿素在该波长下的吸收系数即可计算叶绿素含量。利用分光光计测定叶绿素含量的依据是Lambert-Beer定律，即当一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。其数学表达式为：A=Kbc式中： A为吸光度；K为吸光系数；b为溶液的厚度；c为溶液浓度。叶绿素a、b的丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别位于663、645nm处。叶绿素a和b在663nm处的吸光系数（当溶液厚度为1cm，叶绿素浓度为g·L-1时的吸光度）分别为82.04和9.27；在645nm处的吸光系数分别为16.75和45.60。根据Lambert-Beer定律,叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度（A663和A645）与溶液中叶绿素a、b和总浓度（a+b）（Ca、Cb 、Ca十b，单位为g·L-1），的关系可分别用下列方程式表示：A663=82.04Ca+9.27Cb （1）A645=16.76Ca+45.60Cb （2）解方程（1）和（2）得：Ca=12.7 A6632.59 A645 (3)Cb=22.9 A6454.67 A663 (4)Ca十b20.3 A6458.04 A663 (5) 从公式（3）、（4）、（5）可以看出，只要测得叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度，就可计算出提取液中的叶绿素a、b浓度和叶绿素总浓度（a+b）。在652nm处，叶绿素a和b的吸光系数相同，因此提取液中叶绿素的总浓度（a+b）也可通过测定溶液在波长652nm处的吸光度（A652）求得，其计算公式为： A652×100034.5Ca十b （6） 式中：34.5为叶绿素a和b在波长652nm处的吸光系数。 但Inskeep等（1985）认为叶绿素a和b吸光系数相等时的波长位于吸收光谱斜率很陡的位置上，因此仪器波长很小的偏差都可能导致很大的测定误差。 所测定材料的单位面积或单位重量的叶绿素含量可按下式进行计算：C×VA×1000 叶绿素含量（mg·g-1或mg·dm-2）= （7） 式中：C为叶绿素浓度（mg·L-1）或mg·dm-2）；V为提取液总体积（ml）；A为取样鲜重（g）或取样面积（dm-2）。材料、仪器、药品 1材料：植物绿色叶片。在本实验中利用光合速率测定实验中取回室内的绿色半叶和黄色半叶为试材。 2仪器：(1) 分光光度计；（2）天平；(3) 研钵；(4) 滤纸；(5) 漏斗；(6) 5ml移液管；(7) 打孔器；（8）滴管；（9）剪刀；（10）25ml容量瓶；（11）毛刷；（12）擦镜纸。方法 1取样：用毛笔或毛刷清除叶片表面的灰尘，用打孔器从绿叶和黄叶上各打取0.25dm-2的叶圆片，立即称重，剪碎后放入研钵中。（在正规实验中应各重复3次，本实验为减少丙酮向环境中的排放，故不设重复）。注意取样时要避开大的叶脉。如果需要计算叶片干样叶绿素含量，另取一份相同样品置于烘箱中烘干，用于测定干重。2研磨提取：向研钵中加入80%丙酮2.5ml，以及少许CaCO3 (中和酸性，防止叶绿素酯酶分解叶绿素) 和石英砂，研磨成匀浆，再加入3ml 80%丙酮，继续研磨至组织变白，在暗处静止35min后，用一层干滤纸过滤到25ml容量瓶中，用滴管吸取80%丙酮将研钵洗净，清洗液也要过滤到容量瓶中，并用80%丙酮沿滤纸的周围洗脱色素，待滤纸和残渣全部变白后，用80%丙酮定容至刻度。3读取吸光度：取厚度为lcm的洁净比色皿，注意不要用手接触比色皿的光面，先用少量色素提取液清洗23次，注意清洗时要使清洗液接触比色皿内壁的所有部分，然后将色素提取液倒入比色皿中，液面高度约为比色皿高度的4/5，将撒在比色皿外面的溶液用滤纸吸掉（注意不能擦），再用擦镜纸擦干擦净。将比色皿放入仪器的比色皿架上，注意不要将溶液撒入仪器内。第一个位置放盛有80%丙酮的比色皿，做为空白对照。将仪器波长分别调至663、645、652nm处，以80%丙酮做为空白对照调透光率100%，分别测定溶液在上述三个波长下的吸光度。每个样品重复测定3次。注意，每次在转换波长时，都要用80%丙酮调透光率100%。 4结果计算：将645、663、652nm处测得的吸光度代入公式（3）、（4）、（5）、（6）中计算叶绿素a、b浓度和总浓度。再将叶绿素a、b浓度和总浓度代入公式（7）中求出所测材料单位重量或单位面积的叶绿素a、b含量和总含量。实验结果记录1实验材料：植物名称：种植地点：发育时期：试验处理：植物的生长状况：取样时间：取样部位及数量：2测定地点：3测定时间： 年 月 日 时 分 至 时 分4测定条件记录： 5数据记录及结果记载：表1 测定数据记录及计算结果重复光密度叶绿素含量 mg/g FW 或mg/dm2645nm652nm663nmchlachlbChla+b公式（5）Chla+b公式（6）Chla/chlb绿叶123平均值标准差黄叶123平均值标准差 注：本实验中由于数值都来自同一样品，所以平均数和标准差计算只做为练习。6其他问题记载：实验前思考题（1）通过叶绿素含量测定你能够解决什么理论和实践问题？（2）说明叶绿素的生理意义以及叶绿素含量测定的重要性？（3）请简述各种叶绿素含量测定方法的基本原理？比较各种方法的优缺点？（4）为什么取样时避免打取主脉，样品中含有叶脉，对测定数据会产生什么样的影响？（5）为什么叶绿素提取液用80%丙酮而不用100%的丙酮？（6）在研磨提取叶绿素时为什么向研钵中加入少量石英砂和CaCO3？（7）在强光下提取叶绿素对测定结果会有什么样的影响？为什么？ （8）在用分光光度计测定叶绿素提取液的光密度时，为什么要用80%丙酮将仪器的透光率调到100%？如果用蒸馏水调100%对测定数据会有什么影响？（9）为什么在测定时需要洗净比色皿？洗净的比色皿在倒入提取液时为什么还要用提取液洗2-3遍？（10）在使用分光光度计时，为什么每改变一次波长，就需要重新调零和调透光率100%？（11）什么是吸光系数？在本实验中叶绿素的吸收系数的单位是什么？（12）为使不同时间测定的数据具有可比性，你认为需要控制什么环境条件？为什么？（12） 写出实验时间按排和操作流程图。（13）写出光合速率测定和叶绿素含量测定实验的统一时间安排和实验流程图。实验后思考题（挑战题）（1）叶片中的类胡萝卜素和花色素是否影响叶绿素含量测定？为什么？（2）如果你不知道叶绿素的吸收系数，但有叶绿素的纯品，如何测定样品中的叶绿素含量？（3）根据你所掌握的知识，如何提纯叶绿素？如何检验叶绿素的纯度？（4）能否根据物品上的绿色残迹分析出植物的种类？为什么？（5）如果实验室中没有我们通常用的厚度为1cm的比色杯，只有1.5cm的，若用其测定叶绿素含量，在结果计算时需要用对计算公式做何种改变？（6）比较你用波长652nm、波长645nm以及663nm测定的叶绿素总量，是否有差异？若有差异分析其原因？Section 3（6h）三、植物组织水势测定-小液流法植物的水分代谢包括植物体从外界吸收水分、植物体内水分运转以及植物通过表面向外界散失水分。这种水分运动的动力是相邻部位的水势差。水势是以压力单位表示的水的化学势，代表水的能量水平。植物组织的水势愈低，吸水能力愈强，反之则愈弱。因此水势是研究植物与环境的水分关系的重要指标。在栽培生产上水势也是了解植物体内水分状态，制订灌溉计划的重要指标。水势的测定有多种方法，可分为气态平衡法和液态平衡法。前者要求精密的仪器设备，灵敏度高，如热电偶温湿度计法；后者要求设备简单，操作方便，但灵敏度低，如小液流法和折射仪法。小液流法亦称比重法或着色法，是水势测定的最经典方法之一。该方法是前苏联学者夏尔达科夫(Chardakov)提出的，经过多次改进，成为一个简单而实用的方法。原理水的流向是：是从高的势流向低的势（人往高处走水往低处流） 在恒温恒压下，由植物组织与外界溶液组成的体系的水势包含有植物组织的水势和溶液的渗透势。如果植物组织的水势低于外液的渗透势，则植物组织吸水而使外液浓度变大；反之，植物组织失水而使外液浓度变小；若二者相等，则外液浓度不变，此时外界溶液的渗透势等于植物组织的水势。同一种溶液浓度不同，比重亦不同。当两个不同浓度的溶液相遇时，稀的溶液由于比重小而上浮，浓的溶液比重大而下沉。当把浸过植物组织的溶液滴回到原浓度的溶液中时，液滴会发生下降、上升或基本不动几种情况。如果液滴下降，说明浸泡液的渗透势高于植物组织的水势；若液滴上升，说明浸泡液的渗透势低于植物组织的水势；如果液滴不动，则表示植物组织与浸泡液的水分交换处于动态干衡中，浸泡液的渗透势等于植物组织的水势。浸泡液的渗透势依据范特荷夫公式计算： 一iCRT式中：为渗透势，单位为MPa；i为范特荷夫系数或等渗系数，对于不解离的蔗糖溶液为1.0，对于NaCl溶液为2.0；C为浸泡液的摩尔浓度；R是理想气体常数，0.0082；T是绝对温度。浸泡液的液滴不动时，植物组织的水势（MPa）w一iCRT 材料、仪器、药品 1材料：高浓度NaCl处理的以及没有处理的对照小麦幼苗叶片。2仪器：(1) 5ml试管8支；(2) 10ml刻度试管8支；(3) 细滴管810支；（4）移液管8支；(5) 试管架1个；(6) 打孔器(0.5 cm2左右)1个或刀片1个；(7) 镊子、解剖针、滤纸。 3药品：（1） 甲烯蓝粉末；(2) 蔗糖溶液，浓度为lmol·L-1。方法1准备器具：将试验所需要试管和滴管洗净烘干。2配制不同浓度的蔗糖溶液：测定植物组织水势时所用的溶液，一般最常用的是蔗糖溶液。但也可用无机盐溶液，以9份NaCI与1份CaCl2混合而成的平衡溶液较好。为简便，亦可用纯CaCl2溶液。本实验采用蔗糖溶液。取洁净干燥的10ml刻度试管8支编号（甲组），将1mol的蔗糖溶液稀释成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mol·L-1的8种浓度。按下表配制不同浓度的蔗糖溶液。配制好的溶液要充分混匀。蔗糖系列浓度溶液配制试管号123456781mol蔗糖加入量ml12345678加蒸馏水量ml98765432蔗糖浓度mol/L0.10.20.30.40.50.60.70.8 3准备浸泡液：取洁净干燥的5ml试管8支编号（乙组），从甲组中依次取出0.10.8 mol的蔗糖溶液1ml，分别加入乙组的各个试管中，盖上盖防止蒸发，放到试管架上，做为浸泡液。 4向浸泡液中加待测样品：取10个待测小麦叶片，用毛刷清洁叶表面，将基部和项部切掉。所有叶片放在一起，用刀片切成0.3cm左右的切段，分别放入浸泡试管（乙组）中，每个试管中的叶切段数量要一致，并且每个试管中来自每个叶片的切段数量相同，以保证各个试管中的样品水势尽可能的一致，将叶片切段全部浸没在溶液中，盖上盖子。5溶液平衡：叶切段浸泡30min，期间轻轻摇动试管数次，以加速水分平衡。 6平衡情况检测：叶切段浸泡30min后，用解剖针分别放入少许甲烯蓝粉末在乙组每个试管中，使溶液着色，但甲烯蓝粉末不宜加过多。将浸泡液充分混匀。用细滴管吸取有色溶液少许，插入相应浓度的甲组试管中，使滴管尖端位于溶液中部，然后轻轻挤出1小滴有色溶液，小心抽出滴管(注意勿搅动溶液)，放回相应的浸泡试管中。观察有色小液滴的升降情况并做好记录。如果有色液滴下降，则说明叶片组织吸水，叶片组织的水势小于该浓度溶液的渗透势；如果有色液滴上升，表示浸过组织的溶液浓度变小(即植物组织中有水分排出)，说明叶片组织的水势大于该浓度溶液的渗透势；如果有色液滴静止不动，说明叶片组织与外液的水分交换达到动态平衡，叶片组织的水势等于该浓度溶液的渗透势；如果在前一浓度中下降，而在后一浓度中上升，则植物组织的水势取两种浓度溶液渗透势的平均值。7结果计算：将确定的蔗糖溶液浓度带入公式 一iCRT中计算植物组织的水势。实验结果记录1实验材料：植物名称：种植地点：发育时期：试验处理：植物的生长状况：取样时间：取样部位及数量：2测定地点：3测定时间： 年 月 日 时 分 至 时 分4测定条件记录 5实验数据记录有色浸泡液小滴在原浓度溶液中的运动情况记载液滴表现蔗糖浓度 mol/L样品水势MPa0.10.20.30.40.50.60.70.8盐处理对照液滴表现为上升、静止不动或下降，用“”“”“”表示。6其他问题记载：实验前思考题(1) 通过水势测定你能够解决什么理论和实践问题？(2) 说明水分的生理意义以及水势测定的重要性？(3) 请简述各种水势测定方法的基本原理？比较各种方法的优缺点？(4) 在取样时，为什么将所取叶片全部叠在一起用切成切段，然后分别放入不同的试管并保证每个试管中来自每个叶片的切段数量一致？(5) 在本实验中蔗糖起什么作用？(6) 为什么实验中所用的试管、滴管都要洗净烘干？(7) 叶切段在蔗糖溶液中保持时间长短对测定结果会产生什么影响？为什么？(8) 浸泡液数量多少对实验有什么影响？(9) 为什么向浸泡叶切段的蔗糖溶液中加入甲烯蓝溶液？又为什么不能多加？(10) 在用滴管从浸泡液中取溶液前为什么要充分混匀？（11）为什么从滴管中挤出液滴时要轻轻挤压？(12) 有色液滴为什么会在原浓度溶液中上升、下降或静止不动？(13) 在测定时为什么要在试管上加盖以防止水分蒸发？(14) 为了使不同时间测定的数据具有可比性，你认为需要控制什么环境条件？为什么？(15) 写出实验时间按排和操作流程图实验后思考问题题（挑战题）(1) 你认为在实验的那一步最容易产生误差？为什么？(2) 什么溶液可代替蔗糖作为浸泡液？选择浸泡溶液的标准是什么？(3) 从原理上讲，小液流法还可用于何种生理活动的测定？请说明其原理。(4) 从理论上讲，浸泡液的浓度变化还可以用何种方法检测？请说明原理。四、植物根系活力测定-甲烯蓝法 植物的根系是吸收水分和矿质营养的主要器官，又是物质合成和转化的器官，因此根系的生长发育状况和活力直接影响植物体的生命活动。在植物营养和环境生理研究中常需测定根系活力。本实验学习用甲烯蓝法测定根系表面积和根系活力。原理 根据沙比宁等的理论，认为植物根系对溶质吸收最初具有吸附的特点，并假定此时被吸附物质是以单分子层形式均匀地覆盖在根系表面，因此可以根据根系对某种物质的吸附量来测定根的吸收面积。一般常用甲烯蓝作为被吸附物质，其被吸附的数量可以根据供试溶液浓度的变化用比色法准确地测出。现已知lmg甲烯蓝成单分层时可覆盖1.1m2的面积，据此可求出根系的总吸收面积。当根系在甲烯蓝溶液中已达吸附饱和而仍留在溶液中时，根系的活跃部分能把原来吸附在表面的物质吸收到细胞中去，因而可继续吸附甲烯蓝。从后一个吸收量求出活跃吸收面积，可作为根系活力的指标。材料、仪器、药品 1材料：用高溶度NaCl处理的以及没有处理的对照小麦幼苗根系，在取样时应十分小心，以免将根系折断或损伤。 2仪器：(1) 分光光度计；(2) 小烧杯6个；(3) 吸水纸；(4) 10或25ml量筒1个(依根系大小而定)；(5) 移液管lml和10ml各1支；(6) 10ml试管16支；（7）试管架1个。3药品：(1) 0.075mg/ml 甲烯蓝溶液；（2）0.01mg/ml 甲烯蓝溶液。方法 1绘制甲烯蓝溶液的标准曲线：取7支试管，编号，按下表配制标准溶液。甲烯蓝标准溶液配制试管号12345670.01g甲烯蓝加入量ml0123456加蒸馏水量ml10987654甲烯蓝溶液浓度mg/ml0.0.0010.0020.0030.0040.0050.006把各试管中的溶液混匀后，利用分光光度计测定在波长660nm下的吸光度，测定时以1号试管(蒸馏水)为空白对照调透光率100%。然后，以甲烯蓝系列浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 2测定体系体积：取待测小麦5株，将根系洗净控干后，浸在事先装有一定体积水的10ml或25ml量筒里(或用体积计)，用排水法测定根系体积。3测定根系活力：（1）取3个小烧杯编号，各加入0.075mg/ml甲烯蓝溶液5ml（每杯中溶液量约10倍于根系的体积），从每个烧杯中取出0.5ml溶液，分别加入到3个10ml试管中，稀释15倍，混匀，在660nm下测定吸光度，从标准曲线中查出对应的浓度，然后计算出0.075mg/ml溶液的甲烯蓝的精确含量。记住，取洁净的比色皿，在比色时先用少量溶液清洗比色皿数次。（2）从量筒中取出根系，用滤纸把水吸干，勿伤根系。然后放入第一个盛有甲烯蓝溶液的小烧杯里，浸1.5min之后立即取出，将根系上多余的甲烯蓝液控回到原烧杯中去，再放入到第二个小烧杯中浸1.5min，取出后，同样控净溶液，再放到第三个小烧杯中浸1.5min，取出控净溶液。 （3）从上述浸过根系的3个小烧杯中，分别取出甲烯蓝溶液lml，分别放入三支试管中，稀释10倍，摇匀，用分光光度计在660nm波长下读取吸光度。在标准曲线上查出相应的浓度，最后算出每杯溶液中剩余甲烯蓝的毫克数。 4结果计算：测定数据填入表36，并按下列公式求出根的吸收面积。 总吸收面积=（ C1C1）×V1+(C2C2)×V2×1.1 活跃吸收面积=(C3C3)×V3×1.1活跃吸收面积（m2）×100