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-多酚氧化酶-第 4 页多酚氧化酶的酶学性质及其应用摘要：本文论述了多酚氧化酶的酶学性质和它对果蔬类食品的影响，以及如何利用它的酶学性质加以控制。关键词：多酚氧化酶 性质 抑制0引言多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。由于其检测方便，是被最早研究的几类酶之一。自1883年Yoghid发现日本漆树液汁变硬可能和某种活性物质相关，1938年Keilin D.和Mann G.研究了蘑菇多酚氧化酶的提取和纯化，得到多酚氧化酶并将这类酶称为polyphenol oxidase。多酚氧化酶又称儿茶酚氧化酶，酪氨酸酶，苯酚酶，甲酚酶，邻苯二酚氧化还原酶，是六大类酶中的第一大类氧化还原酶1。 1多酚氧化酶的结构特性多酚氧化酶是一种含有Cu2+离子的结构蛋白，可以催化酚类上的羟基，使之转化为醌或催化多酚类变为氧合醌。因为醌类具有较强的电化学性质，会发生自动氧化、蛋白质的亲核聚合反应及一些二级反应，而这些反应都会导致酶促褐变反应的发生2。多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：单酚单氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶catechol oxidse,EC.1.10.3.2)和漆酶(laccase,EC.1.10.3.1)。在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。2 多酚氧化酶的来源和制备2.1多酚氧化酶的来源 多酚氧化酶普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。2.2多酚氧化酶的制备制备马铃薯丙酮粉：取50g去皮切丁的马铃薯与60mL丙酮（-20）混合 粉碎抽滤，滤渣用-20 的丙酮冲洗至白色室温下晾干。PPO粗提液的制备： 5g马铃薯干粉与40mL粗酶提取液混合搅拌1min 静止1hr，4离心（4，15000rpm，15min）过滤取上清，即得PPO粗提液， 粗酶提取液为4.2g+1000mL0.2M PB。PPO纯化之盐析：PPO的纯化常采用盐析法。盐析主要是利用酶蛋白在高浓度的盐溶液中溶解度减小而析出的原理。硫酸铵由于价廉、溶解度大，且能使蛋白质稳定，故是最常用的盐析剂。 粗酶制剂加入等体积饱和(NH4)2SO4静置1hr，4离心 （4，17000rpm，10min）收集沉淀加15mL0.2MPB溶解再次离心（条件同前）收集上清，即得PPO粗酶制剂取4mL粗酶制剂于冷冻干燥机上冻干，得PPO干粉3。3多酚氧化酶的催化机理多酚氧化酶(PolyphenolOxidase，PP0)是从真菌到植物乃至哺乳动物体内都广泛存在的一类铜蛋白，它能有效催化多酚类化合物氧化形成相应的醌类物质。在茶儿茶素氧化PPO底物儿茶素(eatechin)类能和许多金属离子络合，Cu2+离子形成的配位物中的配位数为4或6，可以从配位体的配位键来阐明PPO的催化生化机理。PPO的多肽链通过自身的折叠卷曲，形成具有一定构象的高级结构。Cu2+与多肽链上的氨基酸残基以配位键相连。主要有HisHis和CysHis残基作为铜离子的配基，形成具有特定立体结构的活件部位4。当邻苯二酚基和底物存在时，由于其“靠近”及“定向”效应，使多肽链和底物的空间构象发生改变，相互契合，从而使底物进入活性中心，邻苯二酚基上的二个羟基与多肽链上的氨基酸残基以氢键相连，形成酶与底物的复合物，由于复合物的不稳定性，多肽链构象发生扭曲，氢键断裂，H被附着在多肽链上，酶与底物不再契合，两者都同时发生构象转变，于是产物脱离了活性部位成为邻醌。邻醌可发生一系列次生氧化作用，形成了多种氧化产物。酶又通过脱氢作用，发生构象回转，恢复以前的天然构象，重新成为具有催化能力的蛋白质。4多酚氧化酶的生理功能高等植物组织发生褐变主要是PPO活动的结果。PPO催化单酚羟基化为邻二酚，二羟酚氧化为邻醌。醌聚合并与细胞内蛋白质的氨基酸反应，结果发生黑色或褐色色素沉淀，最终导致水果、蔬菜等经济作物营养丢失和经济损失。PPO作为一种氧化还原酶还在光合作用中发挥作用。如调节叶绿体中有害的光氧化反应速度，参与其中电子传递；PPO还可促进伤口的愈合5。也可增加植物对病原体的抗性。如烟草对炭疽病、黄瓜对黑星病、苹果对轮纹病、棉苗对枯萎病菌、水稻对自叶枯病菌和细菌性条斑病以及番茄对小昆虫的抗性等。PPO与水果和作物的褐变有关，为了防止水果褐变保持水果的新鲜性，生产上运用多种方法来降低水果中的PPO含量，例如涂以抗坏血酸、柠檬酸为主剂的复合护色剂等6。5多酚氧化酶活性的抑制食品发生酶促褐变大多是不利的，甚至会带来严重的不良后果 ，对食品中的酶促褐变通常是要防止的。人们通过对PPO研究发现许多条件能影响酶促褐变的发生。必需具备的条件有三个：底物(多酚类物质)、氧和多酚氧化酶。这三个条件缺一不可7。有些果蔬如桔子、柠檬、西瓜等，由于不含多酚氧化酶 ，所以不会发生酶促褐变。但是如前所述，PPO分布广泛，酶促褐变也很普遍，因此控制褐变的发生条件，从而控制、抑制褐变显得十分重要。实际操作中从食品中除去PPO的底物(多酚类物质)不仅困难，而且不现实。因此比较有效的是抑制PPO活性，其次是防止与氧接触8。5.1作用于酶辅基的抑制剂PPO是以铜元素做为辅基的一种蛋白质，因此，它能被金属络合物所抑制，如氰化物、氟化物、CO、二乙基二硫氨基甲酸钠(DIECA)、巯基苯噻 、二琉基丙醇、叠氮化物、甲基黄原酸钾等，其中有些物质也可以与PPO催化所产生的醒类物质发生反应9。乙二胺四乙酸或其钠盐、焦磷酸钠、多聚磷酸盐等也可以络合金属离子，用作抗褐变剂时一般与其它物质配合使用10。上述抑制剂对不同来源(叶绿体、线粒体和可溶性)PPO的作用存在明显差异.线粒体和可溶性PPO的脱氢活性能被甲基黄原酸钾、硫脲和DIECA抑制，而相应的叶绿体PPO则不被黄原酸盐所抑制，仅在一定程度上受到DIECA的作用;DIECA对经基化活性的抑制作用可因添加一二酚(咖啡酸、儿茶酸原和儿茶酚)而完全丧失.抗坏血酸也可以络合PPO的辅基，因而可直接作用于此酶11。5.2作用于酶蛋白的抑制剂以无或亚硫酸盐是预防果蔬酶促褐变最常使用的物质，它们对PPO多酚系统的作用比较复杂，既可直接作用于酶本身，降低它对单酚和二酚类的催化反应活性，又可与第一步反应生成的醌类物质发生不可逆的结合，形成无色物质;对亚硫酸盐作用的深入研究发现，其对PPO不可逆抑活的直接原因是它能与酶蛋白发生键连，修饰了蛋白质结构12。用多肽酶的激活剂处理可以抑制PPO活性，是因为多肽酶可破坏PPO蛋白质.根据此机理，琥珀酸2，2二甲基酰肼可阻止蘑菇的酶促变色，同时，该多肽酶的激活剂还能和PPO作用的底物结合，也可减轻褐变.无花果蛋白酶能抑制果实褐变也是由于其对PPO有分解作用13。蜂蜜能抑制苹果片和葡萄汁褐变的原因是所含的低聚肽(分子量约600Da)对PPO有抑制作用。4已基间苯二酚作用于PPO，化学性质稳定，无毒、无致癌性、也无致突变性，它已被推荐用于防治果蔬产品酶促褐变，具有良好的应用前景。5.3竞争或非竞争性抑制剂苯甲酸和一些取代肉桂酸是甜樱桃、苹果、梨、杏、葡萄和马铃薯PPO最具竞争性的抑制剂，Ki值依次增加的顺序是肉桂酸<p香豆酸<m香豆酸<o香豆酸<苯甲酸，表明PPO有不同的底物和抑制结合位点.芳香酸抑制剂直接需要在苯环上或在共扼位置上有一个游离梭基，开链酸至少有两个共扼乙烯基团.甲基化既可降低抑制作用，又可降低Ki值，因此，抑制剂苯核上甲基化或轻基化均能影响催化位点的竞争性14。6前景调节PPO表达是未来研究热点一方面因为受伤或衰老会导致黑色素的形成，负调节PPO能大量提高作物的质量；另一方面PPO的过度表达能减少害虫对作物的侵害，或通过影响植物蛋白形成抗营养机制，或在毛状体渗出液中通过它启动聚合作用捕获昆虫15。因此负调节PP0表达或调节PPO使其过度表达在生产及应用方面都具有很好的前景及重要的实际意义。参考文献：1 胡春和;多酚氧化酶的研究现状J.中国高新技术企业,2009,(03):73-75.2 张莉;陈乃富;多酚氧化酶的酶学性质及其应用研究J.安徽农学通报,2006,(12):29-30+34.3 孔龙，霍瑞贞多酚氧化酶催化反应的抑制动力学及机理J.应用化学,1994,(04):.4 蓝虹云,雷福厚,黄道战,吴健,胡仲义多酚氧化酶催化单宁的氧化聚合反应研究J.湖北化工,2002,(02):12-14. 5 王曼玲,胡中立,周明全,宋运淳植物多酚氧化酶的研究进展J.植物学通报,2005,(02):215-222.6 韩涛,李丽萍果蔬多酚氧化酶的抑制及褐变的防治因素J.北京农学院学报,1999,(04):88-93.7 韩涛，李丽萍.果实和蔬菜中PPO的作用.北京农学院学报，1998，13(2):117一1248 胡瑞波,田纪春小麦多酚氧化酶研究进展J.麦类作物学报,2004,(01):81-85.9 贺立红, 宾金华 高等植物中的多酚氧化酶.植物生理学通讯,2001(37): 340-34610黄明，彭世清植物多氧化酶研究进展J广西师范大学学报(自然科学版)，1998，16(2)：657011 刘文山;肖凯军;郭祀远;苹果多酚氧化酶的提取及其抑制作用的研究J.现代食品科技,2006,(04):82-84+155.12李荣林固定化多酚氧化酶的化学性质研究J茶叶。1998，24(1)13雷东峰，冯怡，梅建生烟草中多酚氧化酶(PPO)的特征J西北植物学报2004，24(1)：1611614 伍红,霍瑞贞.蘑菇多酚氧化酶的性质及其催化反应动力学的研究J.广州化学,1994,(3):24-29.15 邹承鲁;李文杰;多酚氧化酶作用机制的研究 .有机溶剂对于多酚氧化酶接触邻位双酚氧化的影响J.生理学报,1957,(04):403-410.