生物工艺学教案及讲稿 9.10.11.12(14页).doc

-生物工艺学教案及讲稿 9.10.11.12-第 12 页第九讲 培养基的设计及优化教学内容：4-3 培养基的设计及优化 §4- 3-1 培养基成分选择的原则 §4-3-2 培养基的优化 §4-3-3 培养基设计时注意的一些相关问题 目的要求：1. 掌握培养基成分选择的一些基本原则 2. 掌握和了解培养基优化中基本方法 3. 了解培养基设计时注意的一些相关问题 教学重点和难点：1、培养基成分选择的一些基本原则 2、培养基的优化的常用方法 教学方法：课堂讲授为主，自学结合 内容提要及课时分配：1、培养基成分选择的原则（30）2、培养基的优化（50）3、培养基设计时注意的一些相关问题（20）主讲教师： 授课班级：生物08班 授课日期： 2010.10.9 导入新课：4.3 培养基的设计及优化工业化发酵生产中，发酵培养基的设计和优化是十分重要的，因为培养基的成分对产物浓度、菌体生长都有重要的影响。实验设计方法发展至今可供人们根据实验需要来选择的余地也很大。选择培养基成分，设计培养基配方，虽然有一些理论依据，但最终的确定是通过实验的方法获得的。4.3.1培养基成分选择的原则在考虑某一菌种对培养记得总体要求时，在成分选择时应该注意一下几个方面的问题。4.3.1.1 菌体的同化能力小分子物质能够通过细胞膜进入细胞内进行代谢。大分子物质则需要相应的水解酶才能利用。由于微生物来源和种类的不同，能分泌的水解酶系不一样，所以利用的的物质也不一样，所以必须要充分考虑微生物的同化能力。葡萄糖是几乎所有微生物都能利用的碳源，因此在选择培养基时一般优先加以考虑。工业生产中一般采用淀粉水解糖糖化过程，得到的糖液称为淀粉水解糖。目前淀粉水解糖的制备方法分为酸法、酸酶法和双酶法，其中以双酶发制得的糖液质量最好。许多有机氮源都是很复杂的大分子蛋白质。有些微生物缺乏蛋白分解酶，不能直接分解蛋白质必须将有机氮源水解后才能被利用。4.3.1.2 代谢的阻遏和诱导在配制培养基考虑碳源和氮源时，应该根据微生物的特性和培养的目的，注意快速利用的碳（氮）源和慢速利用的碳（氮）源的相互配合。对于快速利用的碳（氮）源，当菌体利用葡萄糖时产生的分解代谢产物会阻遏或抑制某些产物合成所需酶系的形成或酶的活性，即发生葡萄糖效应4.3.1.3 合适的C、N 比培养基中碳氮比对微生物生长繁殖和产物合成的影响极为显著。氮源过多，菌体生长旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累；氮源不足，菌体繁殖量少，从而影响产量。碳源不足，容易引起菌体的衰老和自溶碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。微生物在不同的生长阶段，其对碳氮比的最适要求也不一样。4.3.1.4 pH的要求pH对于微生物的生长是一个极为重要的环境因子，在配制培养基培养基选取营养物质时，也要考虑其代谢后对培养体系pH缓冲体系的影响，保证整个发酵过程中的pH处于较为适宜的状态。4.3.2 培养基优化4.3.2.1试验设计 在工业化发酵生产中，发酵培养基的设计是十分重要的，因为培养基的成分对产物浓度、菌体生长都有重要的影响。实验设计方法发展至今可供人们根据实验需要来选择的余地也很大。 单因素法（One at a time） 单因素方法的基本原理是保持培养基中其他所有组分的浓度不变，每次只研究一个组分的不同水平对发酵性能的影响。优点是简单、容易，结果很明了，培养基组分的个体效应从图表上很明显地看出来，而不需要统计分析。这种策略的主要缺点是：忽略了组分间的交互作用，可能会完全丢失最适宜的条件；不能考察因素的主次关系；当考察的实验因素较多时，需要大量的实验和较长的实验周期。但由于它的容易和方便，单因素方法一直以来都是培养基组分优化的最流行的选择之一。 均匀设计 (Uniform design) 均匀设计是我国数学家方开泰等独创的将数论与多元统计相结合而建立起来的一种试验方法。这一成果已在我国许多行业中取得了重大成果。均匀设计最适合于多因素多水平试验，可使试验处理数目减小到最小程度，仅等于因素水平个数。虽然均匀设计节省了大量的试验处理，但仍能反映事物变化的主要规律。正交实验设计（Orthogonal design） 正交设计就是从“均匀分散、整齐可比”的角度出发，是以拉丁方理论和群论为基础，用正交表来安排少量的试验，从多个因素中分析出哪些是主要的，哪些是次要的，以及它们对实验的影响规律，从而找出较优的工艺条件。正交实验不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式即回归方程，从而无法找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值。而且对于多因素多水平试验，仍需要做大量的试验，实施起来比较困难。4.3.2.2 正交实验设计正交实验设计的的实质就是选择适当的正交表，合理安排实验、分析实验的一种实验方法。具体可以分为以下几个步骤：(1)明确实验目的，确定评价指标；(2)挑选因素，确定水平；(3)选正交表，进行表头设计；(4)明确实验方案，进行实验，得到结果；(5)对实验结果进行统计分析；(6)进行验证实验，作进一部分析。正交实验分析方法：直接对比法直接对比法就是对试验结果进行简单的直接对比。直接对比法虽然对试验结果给出了一定的说明，但是这个说明是定性的，而且不能肯定地告诉我们最佳的成分组合。显然这种分析方法虽然简单，但是不能令人满意。直观分析法 直观分析法是通过对每一因素的平均极差来分析问题。所谓极差就是平均效果中最大值和最小值的差。有了，就可以找到影响指标的主要因素，并可以帮助我们找到最佳因素水平组合。4.3.2.3响应曲面分析法 响应曲面法是一种有效的统计技术，它是利用实验数据，通过建立数学模型来解决受多种因素影响的最优组合问题。通过对RSM的研究表明，研究工作者和产品生产者可以在更广泛的范围内考虑因素的组合，以及对响应值的预测，而均比一次次的单因素分析方法更有效。现在利用SAS软件可以很轻松地进行响应面分析。 实验分析具体见教材P1144.3.2.4 培养及设计在发酵过程优化控制中的作用和地位对于分批发酵（流加发酵）过程的优化控制应当分为两个阶段，而且个阶段的控制重点应当有所侧重。第一阶段：控制菌体的生长，在菌体生长阶段找出影响产物分泌酶系的主要因素，并加以控制使菌体长好后处于最佳的产物合成阶段；第二阶段：控制产物的合成，在产物形成阶段找出影响反应速度变化的主要因素并加以控制，使产物的形成速度处于最佳或底物的消耗最经济。4.3.3 培养基设计时注意的一些相关问题4.3.3.1 原材料及设备的预处理4.3.3.2 原材料的质量4.3.3.3 发酵特征的影响4.3.3.4 灭菌第十讲 灭菌教学内容：5 灭菌 §5-1 灭菌的方法 §5-2 培养基的湿热灭菌 目的要求：1. 掌握灭菌的几种方法 2. 培养基的湿热灭菌分批灭菌和连续灭菌 教学重点和难点：1、培养基的分批灭菌 2、培养基的连续灭菌 教学方法：课堂讲授为主， 内容提要及课时分配：1、掌握灭菌的几种方法（20）2、培养基的湿热灭菌分批灭菌（30）3、培养基的湿热灭菌连续灭菌（20）作业：1.培养基灭菌的方法有哪些？2.分批灭菌与连续灭菌各自的优缺点有哪些？主讲教师： 授课班级：生物08班 授课日期： 2010.10.12 导入新课：5. 灭菌生物化学反应过程发生染菌后会产生各种不良后果：由于杂菌的污染，使生物化学反应的基质或产物消耗，造成产率的下降；由于杂菌所产生的某些代谢反应，或染菌后发酵液的某些理化性质的改变，是产物的提取变得困难，造成收得率降低或产品质量下降；污染的杂菌可能会分解产物而使生产失败；污染的杂菌大量繁殖，会改变反映介质的pH值，从而使得生物化学反应发生异常变化；发生噬菌体污染，微生物细胞被大量裂解而使生产失败。5.1灭菌的方法灭菌是用物理或化学方法杀死或除去物料或设备中一切有生命物质的过程，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。应用的范围有：培养基灭菌；气体除菌；设备机管道灭菌。常用的灭菌方法有以下几种。5.1.1化学试剂灭菌法：甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等；适用范围：环境、皮肤及器械的表面消毒5.1.2.射线灭菌法：电磁波、紫外线或放射性物质；适用范围：无菌室、接种箱5.1.3.干热灭菌法：常用烘箱，灭菌条件：160下保温1h ，适用范围：金属或玻璃器皿5.1.4.湿热灭菌法：利用饱和蒸汽灭菌，条件：121，30min ；适用范围：生产设备及培养基灭菌5.1.5.过滤除菌法：利用过滤方法阻留微生物；适用范围：制备无菌空气 5.2 培养基的湿热灭菌湿热灭菌原理：蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝时会放出大量的冷凝热，很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。 灭菌条件：121，30min。 灭菌不利方面：同时会破坏培养基中的营养成分，甚至产生不利于菌体生长的物质5.2.1 微生物的死亡速率与理论灭菌时间 生物热死动力学（对数残存定律） dN/dt =- kN N：活菌体个数（个）, t : 灭菌时间（min）,k：比死亡速率常数（min-1）dN/dt: 菌受热死亡速率(个/min),Ln N/N0 = - k t N= N0 e- k t 以菌的残留数Ln N/ N0的对数与时间t 作图，得出一条直线，其斜率为- k.（P122 图5-1）反应速率常数k。 k与菌种的特性有关：相同温度下，微生物越耐热， k值越小；相同温度下，微生物越不耐热，k值越大。k与灭菌温度有关：选择即能达到灭菌要求，又保证营养成分不被破坏的温度。微生物种类：不同的微生物k值不同。初始菌量：在保持N值不变的前提下，t 与初始菌量N0的对数成正比。培养基成份：油脂、蛋白质增加微生物的耐热性。传热与混合状况：影响受热均匀度。培养基中固体颗粒的存在影响热穿透。蒸汽中空气的存在降低蒸汽分压和灭菌温度。pH：酸性pH下可加快微生物热死速率 高温对培养基成分的有害影响及其防止： 消除高温有害影响的措施：（1）采用特殊加热灭菌法(连续灭菌方法）（2）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；（3）对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；（4）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌5.2.2培养基的分批灭菌将配制好的培养基同时放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程，也称实罐灭菌。过程包括：升温、保温和冷却三阶段。各阶段对灭菌的贡献： 20%、75%、5%。5.2.3培养基的连续灭菌将培养基在发酵罐外通过连续灭菌装置进行加热、保温和冷却而进行灭菌。 连续灭菌的流程与设备（1）配料预热罐，将配制好的料液预热到7090，以免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声；（2）连消塔，用高温蒸汽使料液温度很快升高到灭菌温度（126132）；（3）维持罐，使料液在灭菌温度下保持57min。因为：连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的；（4）冷却管，使料液冷却到4050后（冷水喷淋），输送到预先灭菌过的罐内。 间歇灭菌与连续灭菌的比较 优 点缺 点连续灭菌1.高温短时灭菌，培养基营养成分损失少。2.发酵罐占用时间缩短，利用率高。 1.设备复杂，操作麻烦，染菌机会多。2.不适合含大量固体物，料的灭菌。间歇灭菌1.设备要求低，不需另外加热、冷却装置。2.操作要求低，适合小批量生产规模3.适合含大量固体物料的灭菌1.培养基的营养物质损失大，灭菌后培养基 质量下降2.发酵罐的利用率较低3.不适合大规模生产的灭菌第十一讲 空气的除菌教学内容：5. 灭菌 §5-3 空气的除菌 §5-3- 空气的除菌 目的要求：1. 掌握空气除菌的预处理设备及作用 2. 了解空气过滤除菌的设备和方法 教学重点和难点：1、空气除菌的预处理设备及作用 2、无菌检测及发酵废气废物的安全处理教学方法：课堂讲授为主，自学结合 内容提要及课时分配：1、空气的除菌预处理（70）2、空气的过滤除菌（30）作业：1.叙述发酵用无菌空气的质量标准2.空气预处理流程中有哪些设备，各设备的作用是什么。主讲教师： 授课班级：生物08班 授课日期： 2010.10.14 导入新课：5.3 空气的除菌5.3.1 发酵用无菌空气的质量标准空气中微生物(包括细菌、酵母、霉菌和病毒) 含量一般为103-104个/米3。一般附着在空气中的灰尘上或雾滴上。 灰尘粒子的平均大小约0.6m左右，空气除菌主要去除空气中的微粒(0.6-1m）。发酵对空气无菌程度的要求。一般要求1000次使用周期中只允许有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为N=10-3。 美国联邦宇航局等级标准：100级（直径小于0.5微米粒子数少于3.5个/L）发酵用的无菌空气要达到以下标准：连续提供一定流量的压缩空气；提供一定压强的连续空气；进入过滤器之前，空气的相对湿度70%，以防止空气过滤介质的受潮；进入发酵罐的空气温度可比培养温度高10-30；提供一定洁净度的压缩空气。5.3.2空气的预处理 目的：提高压缩前空气的洁净度；去除压缩后空气中的油和水。 采风塔 收集空气 粗过滤器 拦截空气中较大的灰尘以保护空气压缩机，同时也起到一定的除菌作用，减轻总过滤器的负担。 空气压缩机 提供动力，使空气克服随后各设备的阻力。克服输送过程中过滤介质的阻力并维持一定的气流速度。压缩后空气温度显著上升，压缩后的高温空气能引起过滤介质的炭化或燃烧增大发酵罐的降温负荷增加培养液水分的蒸发一般用列管式冷却器进行冷却。 空气储罐 消除压缩空气的脉动；消除压缩机排出空气量的脉冲，维持稳定的空气压力。利用重力沉降作用除去部分油雾。紧接空压机安装。有些装有冷却管。 冷却器 空气压缩机出口气温一般在120左右，必须冷却；潮湿地域和季节，空气含水量较高，为避免过滤介质受潮而失效，冷去还可以达到除湿的作用。冷却降温后的空气湿度增大，会使过滤介质受潮失效。 气液分离设备 除去空气中的水和油，保护下面的过滤介质。旋风分离器利用离心力进行沉降，对于10mm以上的微粒分离效率较高。丝网分离器利用惯性进行拦截，分离效率较高，能除去25mm的细小颗粒。 空气加热设备 压缩空气经过旋风分离器与除去了空气中的液滴、雾沫。通过将空气加热，在进入总过滤器之前把空气的相对湿度从100%降低到70%以下。将除油水的空气加热（温差在1015°C 左右），降低相对湿度（达50%60%）后，输入过滤器。用列管换热器。5.3.3 空气的过滤除菌（一） 辐射杀菌、（二） 热杀菌、（三） 静电除菌、（四） 过滤除菌 5.3.3.1空气过滤除菌的原理与介质 过滤除菌的种类绝对过滤：过滤介质的滤孔小于细胞和孢子。深层介质过滤：介质的孔隙一般大于微生物细胞。 深层介质过滤的原理 微粒随气流通过滤层时，由于滤层纤维的层层阻碍，使气流出现无数次改变运动速度和方向的绕流运动，引起微粒与滤层纤维间产生惯性冲击、拦截、布朗扩散、重力沉降、静电引力等作用把微粒滞留在纤维表面上，实现过滤的目的。 空气过滤除菌介质纤维状或颗粒状过滤介质：棉花：常用，有弹性，纤维长度适中。玻璃纤维：直径小，不易折断，过滤效果好。活性炭：要求质地坚硬，颗粒均匀。缺点：体积大，装填费时费力，松紧度不易掌握，空气压降大。纸类过滤介质超细玻璃纤维纸 36张叠在一起使用，过滤效率高，压降小。缺点：强度不大（特别是受潮后）。发酵生产中制备无菌空气的大致过程 空气 空压机 贮气罐 冷却 除油水 加热 空气预处理 总过滤器 分过滤器 无菌空气 空气过滤第十二讲 种子的扩大培养教学内容：6. 种子扩大培养 §5-4 无菌检测及发酵废气废物的安全处理 §6-1 种子制备工艺 §6-2 种子质量的控制措施 目的要求：1. 掌握种子的制备工艺流程 2. 了解无菌检测及发酵废气废物的安全处理办法 3. 了解种子质量的控制措施 教学重点和难点：1、种子的制备工艺流程 2、无菌检测及发酵废气废物的安全处理教学方法：课堂讲授为主 内容提要及课时分配：1、无菌检测及发酵废气废物的安全处理（30）2、种子的制备工艺流程（50） 3、种子质量的控制措施（20） 作业：1.种子扩大培养的目的是什么？2.何谓种子接种龄、接种量，不适宜的接种龄和接种量各会产生什么后果？主讲教师： 授课班级：生物08班 授课日期： 2010.10.14 导入新课：5.4 无菌检测及发几哦废气废物的安全处理5.4.1 无菌检测工业生产中，为明确责任、跟踪生产进度、及早发现染菌，一般在菌种制备、发酵罐接种前后和培养过程中都按时取样、进行无菌检测。对发酵液的无菌检测有三种方式：无菌试验、镜检、试剂盒。无菌实验有肉汤培养法、双碟法、斜面培养法等。空气系统的无菌检测主要考察过滤器是否失效，检测两侧的压降。5.4.2 发酵废气废物的安全处理目前国内发酵行业普遍采用的方法是将排气途径碱液处理后排向大气。发生噬菌体污染后，虽经碱液处理，吸风口出尚有噬菌体存在，这些噬菌体又能于通过过滤除去，可以在空气预处理流程中，将储罐紧靠空压机，空气在储罐存留一段时间可达到杀灭噬菌体的作用。6. 种子扩大培养种子扩大培养的概念：种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过三角瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。 发酵工业生产过程中的种子的必须满足以下条件：（1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；（2）生理形状稳定；（3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；（4）无杂菌污染； （5）保持稳定的生产能力6.1 种子的制备过程实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。6.1.1 实验室种子的制备实验室种子的制备一般采用两种方式：对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法。6.1.2 生产车间种子制备 实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。 种子罐级数的确定 种子罐的作用：主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，取决于：菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度；所采用发酵罐的容积。一级种子罐扩大培养 二级发酵二级种子罐扩大培养 三级发酵三级种子罐扩大培养 四级发酵 确定种子罐级数需注意的问题： 种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会； 种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会； 虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。 接种龄与接种量种龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。 通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适。时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；种龄太短，造成发酵前期生长缓慢。接种量：是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。 接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。 种子质量的判断 细胞或菌体菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等）。单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态； 霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。 .生化指标种子液的糖、氮、磷的含量和pH变化。 产物生成量在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。 酶活力种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联6.1.3 影响种子质量的因素影响种子质量的因素有：培养基、培养条件、种龄、接种量、培养时间和冷藏时间等。 培养基种子培养基要满足以下要求：（1）营养成分适合种子培养的需要 ；（2）选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基；（3）营养上要易于被菌体直接吸收和利用；（4）营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高；（5）营养成分要尽可能与发酵培养基相近。培养条件（1）温度 温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响。（2）湿度 制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量有较大的影响。（3）通气量 在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外，有足够的通气量可以提高种子质量。