基因工程复习附答案(26页).docx

-基因工程复习附答案-第 26 页质粒名称和大小、复制启动子、多克隆酶切位点MCS、选择标记基因16°C连接，37°C酶切凝胶电泳pH8.0带负电1. 基因工程：又称遗传工程，是通指重组DNA技术的产业化 设计和应用的流程。 强调基因克隆、载体构建、遗传转化、性状表达与产品提取及纯化等全部过程。2. 基因操作技术：利用遗传重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，将包含目的基因、特殊载体在内的各种必需元件的DNA分子经过改造和重组后，转入另一受体生物细胞内。3. 基因：DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列。4. 核酸：由许多核苷酸单位通过3，5-磷酸二酯键连接起来形成的不含侧链的具有方向性的长链状化合物。5. 顺反子（基因同义词）：在反式构型中不能互补的各个突变型在染色体上所占的一个区域称为一个顺反子。是一个必须保存完整才具有正常生理功能的遗传物质最小单位。6. 突变子（muton）：突变单位，基因内部有许多突变位点，突变后产生变异的最小单位。（最小的突变单位为1个碱基对bp）7. 重组子（recon）：重组单位，基因内部有多个重组单位，不能由重组分开的最小单位。一个基因不是一个突变单位，也不是一个重组单位。8. 断裂基因（split gene）：指基因内部被一个或更多不翻译的编码顺序即内含子所隔裂。基因都可划分为转录区（转录起始点至转录终止子的区域）和调控区（位于转录起始点5上游，包括核心启动子、上游启动元件及增强子等序列）结构基因并非都是连续的，原核生物基因是连续的，而真核生物的基因是断裂的9. 内含子（intron）：在成熟mRNA的片段中未反应出的DNA区段；10. 外显子（extron/exon）: DNA序列中被转录成为mRNA中的片段。基因中能变成核苷酸序列的是外显子，内含子不能。11. 核小体（nucleosome）：在真核生物中，双螺旋的DNA分子围绕一蛋白质八聚体进行盘绕，从而形成特殊的串珠状结构。核小体结构属于DNA的高级结构。核小体是染色体的基本结构单位。12. 重叠基因（overlapping gene）：两个或两个以上的基因共有一段DNA序列的现象。13. 转座子（Transposon）：又名转位子、跳跃基因（jumping gene）是一类DNA序列，它们能够在基因组中通过转录和逆转录，或在内切酶（Nuclease）的作用下，在其他基因座上出现。转座子的发现，证明了基因组并不是一个静态的集合，而是一个不断在改变自身构成的动态有机体。14. 同源重组： 是指发生在DNA同源序列之间的重组。 15. 位点特异性重组：指发生在特异序列之间的重组，仅见于噬菌体的基因组整合到细菌染色体中的过程。 16. 转座重组：是指不依赖于序列间的同源性而使一种DNA顺序插入另一种DNA顺序中的重组，因此转座是一种可在染色体的不同区段或不同染色体之间广泛发生的重组。又称为复制重组。17. 基因组：是指细胞内遗传信息的携带者DNA的总体。18. 组蛋白（histones）：是指染色体中的碱性蛋白质，其特点是富含二种碱性氨基酸（赖氨酸和精氨酸）。19. PCR（Polymerase Chain Reaction）：聚合酶链式反应的简称。PCR技术是一种在体外高效快速扩增特定基因或DNA序列的方法。20. 电泳：带电颗粒在电场作用下向着与其电荷相反的电极移动的过程。21. 载样缓冲液（loading buffer）：待电泳的样品在点样前与之相混合的一种缓冲液。22. 载体（vector）：能携带外源基因进入受体细胞的运载工具，且有完整的复制（及转录）功能的DNA大分子。23. 克隆载体（cloning vector）：主要是对目的基因克隆，有复制子即可24. 表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体，既有复制子，更要有强启动子25. 穿梭载体（shuttle vector）：既可在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达26. 质粒（plasmid）：存在于微生物染色体外的小型环状双链DNA分子，基因工程技术中应用最广泛、功能最强大、最易操作的载体。不相容性：同一细胞内不能同时存在两种质粒27. 穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）：由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种不同的寄主细胞存活和复制的质粒载体28. Ampr（氨苄青霉素抗性）29. Tetr（四环素抗性）30. MCS：载体上供外源基因插入的、具有多个RE单一酶切位点的片段，一般为人工拼接而成31. 回文结构（palindrom）：以切割序列正中作为轴心，反转对称；同一单链以中心轴对折可形成互补双链。32. 平末端：在识别序列的对称轴上进行切割；33. 粘（黏）性末端：在识别序列的两个对称点切割，产生末端带有单链尾巴的切口；34. 同裂酶：不同的RE有相同的识别特点，但切割位点不一定相同;35. 同尾酶：不同RE识别不同序列,但切割后能产生相同的粘性末端，可以连接起来; 36. 酶单位（U）：在最适反应条件下1小时完全消化lg标准DNA所需的酶量为1个单位37. 星活力：RE在酶切反应条件改变后识别特异序列的特性降低的一种现象38. DNA连接酶（DNA ligase）：催化双链DNA中相邻碱基的5磷酸和3羟基间磷酸二酯键形成的酶39. DNA聚合酶：催化dNTP聚合成DNA的酶，主要用于DNA的体外合成、探针标记等40. 基因重组：DNA分子间（目的基因和载体）发生共价连接形成重组DNA分子的过程。41. 转化：是指感受态的宿主细胞捕获（重组）DNA 分子的过程42. 感受态细胞（competent cells）：处于能摄取外界DNA分子的生理状态的细胞1. 绝大多数原核生物的DNA都是共价封闭的环状双螺旋。2. 根据重复程度，可以将DNA重复序列分为三种类型：单一或轻度重复序列、中等重复序列、高度重复序列。3. 组成染色体的化学成分：DNA、蛋白质，RNA。4. 蛋白质含量约为DNA的二倍，RNA含量很少,还不到DNA量的10%。5. 组成染色体的蛋白质分为组蛋白和非组蛋白。6. 染色体外DNA：线粒体DNA、叶绿体DNA、质粒DNA7. CTAB（溴化十六烷三甲基铵），可与多糖、变性蛋白质等结合，提取核酸时除去多糖、脂类等杂质8. pUC18，拷贝数可达500-700个；携带抗氨芐青霉素基因，转化细菌后含pUC18能生长；还携带细菌lacI和lacZ基因编码，使菌落呈现蓝色；如果在lacz 中间插入外源DNA，破坏半乳糖苷酶活性，生长的菌落就呈白色，作为选择重组子的标记。9. 聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高于琼脂糖凝胶电泳10. 载体按功能分为克隆载体、表达载体、穿梭载体；按来源分为质粒载体、噬菌体载体、柯斯质粒载体、真核细胞克隆载体；按受体细胞分为原核生物载体、真核生物载体、植物基因工程载体、动物基因工程载体11. 具有三种不同的构型：SC型（共价闭合环形DNA）、OC型（开环DNA）、L型（线性DNA）12. -半乳糖酶可分解无色的化合物X-gal产生不溶性的蓝色分解物，MCS在无外源基因插入时不影响lacZ¢基因表达；插入了外源基因的MCS影响lacZ基因表达，无-半乳糖酶产生。因此在含X-gal的琼脂平板上，含非重组质粒的菌菌落是蓝色的、重组菌菌落是白色的13. 型限制性内切酶的应用价值最大。型酶只具限制活性，无甲基化修饰活性；对DNA的切割要求严格的序列作为靶位点，切割精确；此类酶作用时只需要Mg2+参与，无需ATP14. DNA连接酶主要类型有T4噬菌体DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶、T4噬菌体RNA连接酶基因工程（Gene engineering）遗传工程（Genetic engineering）转基因技术（Transgene technology）基因操作技术（Gene opertation/Gene manipulation）分子克隆（Molecular cloning）基因克隆（Gene cloning）基因重组（Gene recombination）突变子（muton）重组子（recon）断裂基因（split gene）内含子（intron）外显子（extron/exon）核小体（nucleosome）重叠基因（overlapping gene）转座子（Transposon）内切酶（Nuclease）同源重组（homologous recombination）位点特异性重组（site-specific recombination）PCR（Polymerase Chain Reaction）Taq-DNA聚合酶（Thermus aquaticus)多克隆位点（Multiple cloning sites，简称MCS）分离纯化核酸的原则和要求：应保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染。核酸制备时的注意事项：尽量简化操作步骤，缩短提取过程。尽量减少化学（化学试剂等）、物理（机械剪切力、高温等）和生物（核酸酶等）因素对核酸的影响。如果提取的是DNA，则需要抑制DNase活力，同时还要防止机械张力拉断。金属离子螯合剂（如EDTA或柠檬酸钠）、去垢剂（如SDS）、蛋白变性剂（如苯酚、氯仿）都也可使DNase失活核酸制备中常用酶DNase：降解DNARNase：降解RNA蛋白酶K：去除蛋白质溶菌酶：溶解细胞壁（尤其是革兰氏阳性菌）核酸的保存保存温度： -70 长期保存的良好温度 -20 也可较长时间保存 4 短期保存保存介质： TE缓冲溶液-最常用，首选；水-短期保存可用质粒DNA提取溶液组成：葡萄糖、EDTA、溶菌酶葡萄糖：增加溶液黏度，防止菌体沉淀和DNA机械损伤EDTA：抑制DNAase，有利于溶菌酶作用溶菌酶：水解细胞壁（尤其是G+菌）溶液组成：NaOH、SDSNaOH：溶解细胞、核酸在pH12或3时会因H键解离而变性，0.2mol/LNaOH会使溶液pH至12.6SDS：溶解膜蛋白破坏细胞膜、使蛋白质变性沉淀溶液组成：KAc（pH 4.8）使溶液pH回至中性，质粒DNA复性高浓度K盐的存在，置换了SDS上的Na盐而形成PDS，有利于大分子染色体DNA、RNA以及蛋白质凝聚而沉淀。溶液I要加RNAase（如果提取的是RNA，则应该加DNAase），葡萄糖让DNA重悬（可加溶菌酶，蛋白EK，破壁）溶液II：碱变性，让细胞裂解，让蛋白质，基因组DNA变性溶液III：酸复性，醋酸钾，蛋白质，基因组DNA复性不了，只有质粒DNA复性可能问题及解决办法1、DNA样品不纯混有多糖、蛋白等重新纯化DNA有金属离子残留增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）DNA溶解前有乙醇残留重新沉淀DNA，让乙醇充分挥发2、 DNA降解材料不新鲜或反复冻融新鲜避免反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性可增加裂解液中螯合剂的含量操作过于剧烈，DNA被机械打断细胞裂解后的操作应尽量轻柔外源核酸酶污染所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌反复冻融将DNA分装保存于缓冲液中3、 DNA提取量少实验材料不佳或量少尽量选材新鲜破壁或裂解不充分延长处理时间和强度沉淀不完全低温沉淀、延长沉淀时间、加辅助物促进沉淀洗涤时DNA丢失洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒PCR的反应体系标准的PCR反应体系组成4种dNTP混合物 各200mol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12gTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L实操的PCR反应体系组成反应体系（50ml）：（注意顺序）无菌双蒸水 （待定）ml 5.5引物（10 mM） 1ml+1ml模板DNA 1mg（待定，参考量0.5mg左右） 52´PCR MasterMix 12.5ml总体积 25mlPCR编程1. 预变性 94，4min-3min2. 变性 94，45sec-45s3. 退火 55，50sec-45s4. 延伸 72，1min-1min5. 重复2-4步骤，30次循环6. 最后延伸 72，8min-5min7. 保温 4-20。C保存备用影响PCR的因素（一）PCR体系各成分的影响：1、模板：模板是待扩增的核酸；单、双链DNA均可；不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类；一般100ng DNA模板/100L；模板浓度过高会导致反应的非特异性增加2、引物浓度：引物是与靶DNA特异性结合的寡核苷酸片段引物浓度一般为0.1-0.5mol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。3、Taq-DNA聚合酶（Thermus aquaticus)： 0.5-2.5 U/50l多则反应特异性下降，少则影响产量4、dNTP：dNTP浓度取决于扩增片段的长度，一般为20-200mol/L；四种dNTP浓度应相等；浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。5、Mg2+：Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶的影响很大；一般浓度范围为0.5-2mmol/L；浓度过低会使Taq酶活性丧失、产量下降；浓度过高影响反应特异性；Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。6、缓冲液：维持PCR反应体系的pH; 一般含有10-50mM Tris-HCl(pH 8.3-8.8)、50mM KCl和适量浓度的Mg2+； 可增加产量、利于退火，但盐浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活性。7、其他因素：在反应体系中加入一定浓度的添加剂如甘油、二甲基亚砜、液体石蜡等，可提高扩增效率与特异性。（二）反应参数的影响：1、变性：使双链DNA解链为单链；变性温度取决于DNA模板的GC含量，55%的一般为94-95，45秒，55% 需要更高变性温度；在循环开始前会在94，预变性3-10min使模板DNA完全解链；循环程度中变性一般为94，30-60秒。2、退火：使变性模板DNA与引物复性；退火温度高低与时间的长短取决于引物的长度和GC含量；一般为37-55，1-2min，具体的退火温度可通过设计序列实验来摸索（如利用梯度PCR来设计一系列退火温度）。3、延伸：即寡核苷酸引物的延长；在Taq DNA聚合酶的最适反应温度下进行；一般为70-72，30-60sec;具体延伸时间取决于扩增片段长度，如： 500bp，20sec 500-1200bp,40sec4、循环次数：主要取决于模板DNA的浓度；一般为25-35次，通常取30次；次数过多扩增效率降低、错误掺入率增加。影响电泳分离的因素生物分子本身的性质：带电荷越多、分子越小、形状越接近球形，电泳迁移速度越快电场强度：电场强度越大 ，电泳速度越快支持介质：筛孔大小、带电性质缓冲液：pH、黏度琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理DNA分子在碱性环境中（pH8.0-8.3）带负电荷（磷酸基团），外加电场作用下向正极泳动，不同的DNA分子，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。影响因素DNA分子大小：分子量越大，迁移速度越慢DNA的分子构型：超螺旋>线性>开环闭合环状所加电压：3-5V/cm电场方向：如脉冲电泳核酸染料：常用染料溴化乙锭（EB），嵌入碱基对中，可降低DNA的迁移率电泳缓冲液：常用缓冲液TAE、TBE、TPE电泳缓冲液：在电泳过程中维持合适的pH；使溶液具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移。TAE：缓冲容量最低，不宜长时间使用；对高分子质量的DNA分辨率略高；对超螺旋DNA分辨率略高；线状dsDNA片段在TAE中比在另两者中迁移速率快10%；适用于回收DNA片段的电泳。TBE：缓冲容量高，但成本也略高；对小分子量DNA（1kb）分辨率略高；不宜用于回收DNA片段的电泳。TPE：缓冲容量高，但成本也略高；不宜用于回收DNA片段的电泳。电泳操作步骤制胶-放入缓冲液-点样-电泳-观察结果（一）制胶1. 称一定量的琼脂糖，加入电泳缓冲液，加热溶解；2. 准备制胶模具，加梳子；3. 倒胶，胶厚一般为0.3-0.5cm；4. 冷却凝固，取出梳子，凝胶置于电泳槽中；5. 加入电泳缓冲液，液面高于胶面1mm注意事项：控制好琼脂糖加热溶解时间控制好倒胶时的温度控制好胶的厚度控制好梳子高度、宽度注意电泳仪器及缓冲液的使用太短，不溶解；太长，水分蒸发多；低于45 ，凝固；高于60 ，使制板变形；太薄，上样量小，易裂；太厚，不易取出梳子，浪费；梳齿与胶板之间有一定空隙；根据上样量选择梳子宽度。配胶与电泳槽中缓冲液最好同批次；电泳槽中缓冲液使用次数不宜太多。（二）点样DNA样品与载样缓冲液混匀；吸取混合液，加入样品孔中。载样缓冲液：待电泳的样品在点样前与之相混合的一种缓冲液。作用：增加样品密度保证DNA沉入加样孔内使样品带有颜色易于点样其中的染料在电场中以可预测的泳动速率向阳极迁移，可参考来判断DNA的电泳情况注意事项：控制好样品与载样缓冲液比例：参考说明书，一般为5LDNA+1Lloading buffer；控制好上样量：控制好枪头的深度：按照载样缓冲液说明书，按比例混匀样品与载样缓冲液体，样品量不能大于上样孔容积，否则样品溢出，交叉污染。一般样品投入量达50100ng/带即可观察到清晰结果，而对于珍贵DNA样品则上样量达电泳的最低分辨率510ng/带也可。而对于一定量的DNA，当电泳时采用较薄的梳子制胶，则电泳时DNA条带相对较窄，观察较清晰；而随着电泳时间的延长，由于DNA分子本身有一定的扩散，电泳条带也会变浅 ；太浅，样品不易进入孔内；太深，容易损坏样品孔。（三）电泳设置好电压，接通电源；根据指示剂迁移位置，判断是否终止电泳；切断电源，取出凝胶，观察结果。注意事项：电极要正确连接，点样孔在负极；电压一般采用1-5v/cm（两极间距离），大片段DNA可略低，防止拖尾；小分DNA可略高些，缩短电泳时间；控制好电压： 电压高，时间短，条带不整齐不清晰； 电压低，时间长，条带相对清晰整齐；控制好电泳槽内缓冲液的量（没过胶1mm）： 太多，电流加大，凝胶发热；（四）检测观察切断电压，取出凝胶；观察结果、拍照、记录。目前通用方法，用核酸染料对核酸进行染色，通过紫外光进行直接（肉眼）或间接（凝胶成像仪）观察，或利用相应检测设备捕捉荧光信号，进行数据处理（荧光定量PCR仪）核酸染料溴化乙锭（EtBr,EB）:成本较低，致癌剂GoldView :成本较低，毒性有争论SYBR GreenI：昂贵，据说是目前毒性最低的染色剂的使用方法染胶法：制胶时添加，灵敏度最高染样品法：与核酸样品混合点样，灵敏度最低后染法：电泳完毕后将胶放入染色液中染色一段时间，缓冲液冲洗，灵敏度较高常见问题及解决方法（一）DNA条带模糊：DNA降解：避免核酸酶污染电泳缓冲液陈旧：经常更换电泳条件不当：电压不应超过20V/cm，温度30；DNA上样量过多：减少凝胶中DNA上样量DNA变性：电泳前勿加热（二）DNA条带弱或无DNA带：DNA的上样量不够：增加DNA的上样量DNA降解：避免DNA的核酸酶污染DNA跑出凝胶：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度；检测时光源不合适：如EB染色的DNA，应用短波长（254nm）的紫外光源检测 （三）DNA带缺失：小的DNA带跑出凝胶：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度分子大小相近的DNA带混在一起，没有分离开：增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度DNA变性：电泳前请勿高温加热DNA链DNA链巨大，不适于常规电泳：脉冲电泳载体的基本条件：具自主复制能力；如质粒具有复制起始点ori具有供外源DNA插入的单一RE酶切位点； 如：MCS具有合适的选择标记基因，筛选重组；抗药基因如：氨苄青霉素抗性某些表达载体还具有外源基因的转录和表达能力（除复制子外还有启动子）较小的分子量，可容纳较大的外源DNA片段，又可在受体细胞内扩增较多的拷贝数在细胞内稳定性高，可以使重组体稳定传代而不易丢失表达载体与克隆载体相比还需具备的条件一个强启动子及其两侧的调控序列;有SD序列（mRNA上与核糖体结合的部位）且该序列与起始密码于ATG之间要有合适的距离（约10bp左右）在克隆基因与启动子之间有正确的阅读框架（方向、核苷酸数量）外源基因下游有转录终止子噬菌体作载体的原因：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增可克隆大分子DNA酶切操作过程：根据RE说明书，建立酶切反应体系加样：依次加入水、缓冲液、DNA、酶 混匀一定温度下保温一定时间终止反应电泳检测酶切结果影响限制性酶切反应的因素（一） DNA样品纯度及分子结构DNA提取过程残留的污染物如：蛋白质、乙醇、EDTA、SDS以及高浓度的盐等会抑制酶的活性：解决办法：加大酶的用量、加大反应总体积、延长反应时间DNA分子的构型对酶活影响也很大：线性DNA分子比超螺旋质粒DNA更易切割 PCR产物往往要加保护碱基才可正常切割（二） DNA甲基化程度从普通大肠杆菌分离出来的质粒DNA，由于甲基化，难酶切（三） 酶切反应温度大多数RE的最佳反应温度是37°C实际操作中常采用水浴锅，但由于离心管底部与顶部温度不同，反应体系会蒸发，引起酶反应条件改变，可能会造成酶产生星活力；酶反应时间较短（2h左右)时可在水浴锅内进行，如时间较长，最好在培养箱内进行反应（四） 缓冲液每一种RE都具有相应的反应缓冲液；反应缓冲液可能相同也可能不同（盐浓度、缓冲液成分不同）；同一公司RE的相同的缓冲液一般可以通用，不同公司的一般不能；若不同RE使用相同缓冲液，可在同一酶切体系中同时进行双酶切；反之，则只能在第一个RE酶切完成后，进行酚抽提、乙醇沉淀，再进行另一个RE的酶切（五） 操作注意事项新购回的RE应该分装成小份，于-20保存，避免反复冻融由于操作中DNA样品与RE的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性要注意酶切时加样的次序：水、缓冲液、DNA，最后才加酶液取用RE时要将其放在冰浴内，防止失活注意要更换枪头，防止RE污染酶切反应中所使用的枪头、离心管等都要是洁净无菌的，使用时用镊子夹取，不直接用手去拿，严防手上杂酶污染；当样品在保温反应时，盖子要盖紧，防止水汽进入，增加反应体积，还要防止标签脱落；样品酶切期间或完毕后取样电泳前要离心2秒钟（保温时样品会有水汽冷凝至管盖及管壁上）。影响连接反应的因素（1）连接酶用量：平末端连接：1-2个单位黏性末端连接：0.1个单位（2）反应温度：连接酶最适反应温度为37该温度会致黏性末端间碱基配对不稳定；常用连接温度在：15-26（3）载体DNA和目的DNA之间比例一般为1：3（4）DNA末端特性：黏性未端连接效率高于平末端连接平末端可采用加大酶、底物浓度，延长连接时间等方式重组DNA技术步骤目的基因的获取-载体的选择和构建-外源基因与载体的连接-DNA导入受体菌-重组体的筛选-克隆基因的表达基因转移（重组DNA导入宿主菌）（1）物理方法裸DNA直接注射（基因枪）微粒轰击电穿孔：利用脉冲电场提高细胞膜的通透性使细胞膜上形成纳米大小的微孔，可将DNA转移到细胞中。该方法简便、转染效率稳定、可广泛运用于细胞的基因转移显微注射：在显微镜下，将DNA由细胞玻璃针直接注入细胞，可以将DNA直接注入核内，有助于基因的整合与表达。适用于细胞的基因转移（2）化学方法钙盐转化法：氯化钙转化法（原核表达体系采用） 冰冻！磷酸钙共沉淀法（真核表达体系采用）（3） 生物方法Ti质粒-土壤根瘤菌Ri质粒-发根土壤根菌逆转录病毒(Rv)载体腺病毒(Ad)载体腺相关病毒(AAv)载体单纯疱疹病毒(HSv)载体嵌合病毒载体操作步骤（一）感受态细胞的制备受体菌的培养取适量4离心10分钟弃上清,用冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液重悬菌体，冰浴后4离心弃上清,加冷CaCl2 二次重悬,冰浴,即为感受态细胞悬液，贮存于-70可保存半年。（二）转化取感受态细胞悬液置冰上，加入DNA摇匀,冰上置30分钟，42水浴中热击2min，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟 加入预热液体培养基,混匀，37振荡培养1小时左右，取适量涂布于含选择性抗生素的筛选平板适温培养对照：取未转化感受态细胞分别涂布筛选平板（含筛选抗生素）和空白平板注意事项：（1）用于制备感受态的细胞要保证：较好的生长状态： 如：不要多次转接、用70或-20甘油保存的菌种而不是的培养菌适宜密度，过高或不足均会影响转化效率： 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制（2）用于转化的质粒要求：质量：主要是超螺旋DNA浓度，与转化效率在一定范围内成正比 ：浓度过高或过低均会降低转化效率，一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。 （3）试剂的质量: 所用的试剂均需是最高纯度，用超纯水配制,分装保存于干燥的冷暗处。（4）防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿是新的,并经高压灭菌处理,且注意防止污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。质粒DNA转化常见问题问题一：转化后无克隆产生原因：感受态细胞低效抗生素使用错误转化后立即涂板忘记温浴对策：使用高效率的感受态细胞（106以上）复查质粒抗性，使用正确的抗生素转化后温浴45min左右让抗性基因得以表达问题二：实验结果出现假阳性或假阴性原因：未加诱导剂、显色剂或其失效抗生素失活，敏感菌亦能生长用于制备感受态的菌株退化对策：检查平板是否含有诱导剂显色剂以及是否新鲜,否则重新制备新鲜平板 复查抗生素的抗性用于制备感受态的菌株，传代次数不能太多（20代以内为佳）重组子的筛选和鉴定根据载体遗传标记检测抗药性筛选法：四环素、氨卞青霉素筛选pBR322质粒营养缺陷型筛选法：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子显色筛选法：蓝白斑筛选pUC质粒根据克隆DNA序列检测限制性酶切图谱法：如：质粒3593bp；目的片段830bp；则：重组质粒4.4kb；PCR检测：以重组质粒为模板PCR可得到830bp的条带核酸分子杂交：应用放射性标记的特定的DNA或RNA作探针（已知序列），与待测的核酸序列进行杂交探针只能与互补的特异核酸特异结合，通过检测放射性杂交信号来定位待测序列。DNA测序：最可靠的检测方法；测序服务已商业化，可很方便地进行。根据外源基因表达产物检测蛋白质生物功能检测：如：纳豆激酶具有溶纤活性，在纤维蛋白平板上会出现溶纤圈。免疫检测：利用外源基因表达蛋白相应的抗体来检测聚丙烯酰胺凝胶电泳： 如：外源表达蛋白分子量约为27kd目的基因的扩增和表达目的基因的扩增： 通过重组菌的增殖即可达到目的基因的表达： 表达体系的选择 表达载体构建 重组菌的培养和发酵 表达产物的分离纯化原核表达体系（大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌）优点：成熟的克隆及表达体系 繁殖迅速，培养代谢易于控制 易于进行遗传操作和高效表达不足：不宜表达真核基因组DNA 不能加工表达的真核蛋白质 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 很难表达大量可溶性蛋白真核表达体系（酵母、昆虫、哺乳动物细胞）优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累缺点：操作技术难、费时、经济一、不同生物种类基因组的结构特点1、病毒基因组的结构特点（1）病毒基因组大小相差较大（2） 病毒基因组可以由DNA组成，也可以由RNA组成，组成病毒基因组的DNA和RNA可以是单链的，也可以是双链的，可以是闭环分子，也可以是线性分子。（3） 多数RNA病毒的基因组是由连续的核糖核酸链组成，但也 有些病毒的基因组RNA由不连续的几条核酸链组成。（4） 基因重叠 （5） 病毒基因组的大部分是用来编码蛋白质。 （6）病毒基因组DNA序列中功能上相关的蛋白质的基因或rRNA的基因往往丛集在基因组的一个或几个特定的部位，形成一个功能单位或转录单元。（7）除了反转录病毒以外，一切病毒基因组都是单倍体，每个基因在病毒颗粒中只出现一次。 （8）噬菌体（细菌病毒）的基因是连续的 2、细菌染色体基因组结构的一般特点（1）细菌的染色体基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成细菌的染色体相对聚集在一起，形成一个较为致密的区域，称为类核（nucleoid）。（2）具有操纵子结构 （3）在大多数情况下，结构基因在细菌染色体基因组中都是单拷贝。 （4）不编码的DNA部分所占比例比真核细胞基因组少得多。（5）具有编码同工酶的同基因（isogene）例如，在大肠杆菌基因组中有两个编码分支酸（chorismicacid）变位酶的基因，两个编码乙酰乳酸（acetolactate）合成酶的基因。（6）和病毒基因组不同的是，在细菌基因组中编码顺序一般不会重叠，即不会出现基因重叠现象。（7）在DNA分子中具有各种功能的识别区域如复制起始区OriC，复制终止区TerC，转录启动区和终止区等。这些区域往往具有特殊的顺序，并且含有反向重复顺序。（8）在基因或操纵子的终末往往具有特殊的终止顺序,它可使转录终止和RNA聚合酶从DNA链上脱落。 3、真核生物基因组的特点（1）真核生物基因组DNA与蛋白质结合形成染色体（2）真核细胞基因转录产物为单顺反子。一个结构基因经过转录和翻译生成一个mRNA分子和一条多肽链。（3）存在重复序列，重复次数可达百万次以上。（4）基因组中非编码的区域多于编码区域。（5）大部分基因含有内含子，因此，基因是不连续的。（6）基因组远远大于原核生物的基因组，具有多复制起点，而每个复制子的长度较小。二、 基因组DNA的提取（1） 培养细菌，离心，弃上清（2） 加入10%SDS和蛋白酶K，混匀，37温育1h（溶解细菌、消化蛋白质，如为G+菌还应加入溶菌酶）（3） 加入CTAB-NaCl溶液，65温育20min（选择性沉淀和去除细胞壁碎片、多糖和残余的蛋白）（4） 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,混匀，离心（去除CTAB的蛋白-多糖复合物，使蛋白质变性、分离，DNA因为不溶于有机相而留在水相中）（5） 取上清，再加入等体积氯仿/异戊醇，混匀，离心5min（DNA仍留在水相中）（6） 取上清，加入1倍体积的异丙醇（沉淀DNA）（7） 用70%的乙醇洗涤沉淀（洗去盐、CTAB等），离心，弃上清,务必要晾干DNA（8） 沉淀用TE（ddH2O）溶解，备用（9） 用紫外分光光度计检测DNA浓度与纯度：OD260/OD280比值应为1.7-1.9； 1 OD260 50g/ml dsDNA 40g/ml ssDNA （10） 所得细菌基因组DNA应在-20保存备用标出质粒的元器件以及各自的功能和作用名称大小（1） Ori 复制启始子/复制子（2） Mcs 多克隆位点（n个酶切RE位点）（3） P- 启动子（两个相反方向的话，可以防止基因插反）（4） Apr 抗性基因，一般为两种：氨苄青霉素抗性基因，四环素抗性基因（5） Lacz 筛选标记基因，一般有两种：抗生素和蓝白斑筛选（插了是白色的，没插是蓝色的）（6） 调控序列：调控启动子（7） 名称大小调控蛋白（开关）P-启动子基因终止子抗性基因Ori 复制启始子/复制子Mcs 多克隆位点（n个酶切RE位点）Lacz 筛选标记基因P26乳糖操纵子中CAP的正性调节作用机制（CAP促进基因表达）（很大可能要考）缺乏乳糖时，I基因阻遏蛋白与操纵序列结合阻止RNA聚合酶结合阻止结构基因转录没有葡萄糖时：CAMPCAMPCAP复合物与操纵子的CAP位点结合激活RNA聚合酶活性结构基因转录表达CAP与CAMP结合后，可结合到乳糖操纵子的CAP位点，促进转录CAMP环状磷酸腺嘌呤第二信使细胞信号调节蛋白第一信使