免疫组化实验步骤(7页).doc
-免疫组化实验步骤-第 7 页石蜡切片免疫组化实验步骤石蜡切片步骤按照晓峰整理的步骤进行（From 徐晓峰、朱老师的“石蜡切片”方案）：1）材料的准备在本实验室条件下推荐使用FAA（50% ethanol, 5% acetic acid, 3.7% 甲醛）固定材料。 FAA固定液（100ml），室温保存 ：无水乙醇 50ml冰醋酸 5ml37%甲醛 10ml水 35ml第一天：组织固定用FAA固定，详见“石蜡切片”protocol。第二天：脱水 Solution time number of changes50% ethanol 60 minutesone60% ethanol 60 minutesone*70% ethanol 60 minutesone以上所有步骤中每换好一步乙醇均置于4冰箱等待，并不时轻摇。* 组织可在70% ethanol 4可存放几个月第三天：进一步脱水和浸蜡以下所有步骤在4进行并不时轻摇Solutiontimenumber of changes85% ethanol60 minutesone95% ethanol 60 minutesone以下所有步骤在室温进行并不时轻摇Solutiontimenumber of changes100% ethanol 30 minutestwo100% ethanol 60 minutestwo25%二甲苯, 75% ethanol 30 minutesone50%二甲苯, 50% ethanol 30 minutesone75%二甲苯, 25% ethanol+番红 30 minutesone100%二甲苯60 minutestwo100% 二甲苯 + 1/4 volume Paraplast Plus (paraffin) chipsovernight(不要摇动) 准备工作：60预热plus蜡片（Paraplast Plus） 石蜡可反复融凝而去气泡第四天：浸蜡 2将材料置于42直至蜡块完全熔化。再加1/4体积的蜡块至完全熔化后移至60。几个小时后换上新鲜熔好的蜡液，过夜。第五天：浸蜡 3换蜡两次（Paraplast Plus）第六天：浸蜡 4换蜡两次（Paraplast Plus）第七天：浸蜡 5换蜡两次（Paraplast Plus）准备工作：60预热Regular蜡片（Paraplast Regular）第八天：包埋（包埋块可长久保存） 第九天及之后：开始切片，切片应包括自己的片子及正负对照等。事先打开烘片机至37度，在涂有多聚赖氨酸的玻片上加12ml的蒸馏水。切好的片子轻至于加水的玻片上。待所有片子准备完之后盖上盖子，烘片过夜。用自来水及双蒸水清洗免疫组化专用塑料，放在烘箱烘干待用。第二天：开始脱蜡（From 徐晓峰、朱老师整理的“石蜡切片”protocol）Solutiontimenumber of changes100%二甲苯10 minutestwo100% ethanol1-2 minutestwo95% ethanol1-2 minutesone90% ethanol1-2 minutesone80% ethanol1-2 minutesone60 % ethanol1-2 minutesone30 % ethanol1-2 minutesonewater1-2 minutesonePBS(PH=7.4)5 minutesone PBS(PH=7.4)5 minutesone（用新买来的免疫组化塑料小盒，每一步只需加入试剂220250毫升）抗原修复：在切片还浸入酒精时，可以事先将煮锅清洗干净，用蒸馏水洗12遍，最后加入0.01M柠檬酸钠缓冲液(PH=6.0)，煮沸(保持在95度左右)，将过完PBS的片子让入煮沸的锅中，煮片1015 min。然后将电磁炉关闭，自然冷却锅中切片（千万不要把片子拿出来，放在缓冲液中一起自然冷却至室温！） 将片子浸入PBS（PH=7.4）5 min。 重复一遍。封闭：在抗原修复时可以事先配制封闭液，用PBS（PH=7.4）配制3% BSA的封闭液。将PBS中的切片放入封闭液中，室温放置30分钟1小时。杂一抗： 在封闭时可先剪好与切片大小相当的封口膜，并准备加有少量水的塑料大盒，用卫生纸垫在塑料大盒中附带的塑料板上。用封闭液稀释一抗(GFP兔多抗以1:100稀释，其它一抗需要另外尝试)。将稀释完的一抗加在片子上，每张片子保证不少于100ul，用封口膜封上，检查是否有汽泡，轻轻赶走气泡。将片子放在塑料大盒中，盖上塑料盖子，放入冰库过夜。杂二抗： 事先配制好TBS(PH=7.4)缓冲液，用TBS（PH=7.4）缓冲液稀释带有碱性磷酸酶(AP)标记的抗兔二抗，比例为1:200。将塑料大盒从冰库中拿出，浸入TBS（PH=7.4）缓冲液中洗一抗，5min，重复3次，在洗一抗的过程中准备封口膜。将片子上的残余缓冲液倒去（但片子必须保持湿润！）每张片子加不少于100ul的二抗稀释液，盖上封口膜，放入塑料大盒中，室温放置11.5小时。洗二抗并显色 用TBS(PH=7.4)缓冲液洗二抗，5min,重复3次。同时在暗处配制显色液（40ul溶液A+40ul溶液B+720ul水，可根据实际切片数量按比例配制显色液），剪切封口膜。将片子至于暗处，倒去缓冲液，每张片子加不少于100ul的显色液，轻轻盖上封口膜，放于暗处进行显色。每隔15分钟左右看一下片子是否开始显色(根据经验，加入显色液30min1小时会开始显色,但是需要根据不同蛋白表达强弱，把握显色时间)。发现显色之后需加蒸馏水终止反应，再盖上盖玻片进行观察并拍照。试剂：1. 0.01M PBS（PH=7.4）: 购买的小包装粉末，溶于1L水中，待粉末溶解后调PH值至7.4。2. TBS: 2.4g Tris, 8.8g NaCl溶于1L水中，调PH值至7.43. 0.01M 柠檬酸钠缓冲液(PH=6.0)： 2.94g 柠檬酸三钠2H2O溶于1L蒸馏水中，用固体柠檬酸调PH至6.04. 3%BSA封闭液 7.5g BSA溶于250毫升PBS(PH=7.4)中。
