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-微生物的能量代谢-第 13 页微生物的能量代谢 微生物进行生命活动需要能量，这些能量的来源主要是化学能和光能。那么自然界的能量是怎样转变成微生物可利用的形式?能量是如何被利用的?这些都是微生物能量代谢的基本问题。 一、细胞中的氧化还原反应与能量产生 物质失去电子称为氧化，含有氢的物质在失去电子的同时伴随着脱氢或加氧。物质获得电子称为原，在获得电子的同时可能伴随着加氢或脱氧。可见氧化和还原是两个相反而偶联的反应，二者不能分开独立完成，即一物质的氧化必然伴随着另一物质的还原，称为氧化还原反应，可以表示为： AH22H+2e+A（氧化) B+2H+2eBH2(还原） AH2+B A+BH2（氧化还原) 在氧化还原反应中，凡是失去电子的物质称为电子供体；得到电子的物质称为电子受体。如还伴随有氢的转移时则称为供氢体和受氢体。上式中AH2就是电子供体(或供氢体)，B是电子受体(或受氢体)。实际上，生物体内发生的许多反应都是氧化还原反应。生物氧化是物质在生物体内经过一系列连续的氧化还原反应逐步分解并放出能量的过程。其中有机化合物的氧化还原反应是生物氧化的主要形式，在此过程中都包含有氢和电子的转移，称为脱氢作用。 各种基质给出电子而被氧化和接受电子而被还原的趋势是不同的，这种趋势称为基质的还原势(reductionpotential)，用E0'，表示，以伏(V)或毫伏(mV)为单位。在电化学上还原势以基质H2作参比而测定，因而各种物质的还原势可以相互比较。按规定还原剂(电子供体)写在反应式的左边。在pH：7时，氢和氧的还原势分别为： 2H+2eH2 E0'=-421mV 1/2O2+2H+2e- H2O E0'=+816mV 在细胞内进行的氧化还原反应中，电子从最初供体转移到最终受体，一般都需经由中间载体(电子传递体) 全反应过程的净能量变化决定于最初供体和最终受体之间还原势之差。 表2-3列出了生物的一些常见氧化还原系统中电子载体的标准电位E0'值。在分解代谢中，电子供体一般就是指能源，当电子供体与电子受体偶联起来发生氧化还原反应时能释放出能量，两个相偶联(氧化一还原分子对，或称O-R对)的反应之间还原势相差愈大，释放的能量就愈多。 中间电子载体有两类：一类是游离的，一类是牢固地结合在细胞膜中的辅酶上。表中所列辅酶NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和NADP+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)就是细胞中常见的游离电子载体，它们是氢原子载体，能携带一个质子和两个电子，在反应中另一个质子(H+)来自溶液。NAD+ +2e-+2H+产生NADH+H+，为简略起见一般将NADH+H+书写为NADH。尽管NAD+和NADP+具有相同还原势(320mV)，但在细胞中前者直接用于产能反应(分解代谢)，后者主要用于合成反应。 二、高能化合物和ATP的合成 基质通过氧化还原反应产生的能量可以转变为高能化合物，供细胞用于作功。高能化合物是在水解过程中能够释放大量自由能的有机物分子。自由能以C表示，生化反应中自由能的变化表示为GO'，负值说明反应中有自由能释放，并且反应能自发进行，这时称为产能反应；正值说明反应不能自发进行，需外界能量，称为吸能反应。生物学中表示能量的单位最常用的是千卡(kcal)和千焦耳(kJ)，lkcal等于4184kJ。如果没有高能化合物则在一般氧化作用中会以放热的方式而浪费能量。 (一)细胞中的高能化合物 许多高能化合物最少含有一个高能磷酸键。有些化合物虽具有磷酸键，但所含能量不够高，不算高能化合物。高能磷酸化合物水解时释放的自由能大于293kJmol。例如，葡萄糖-6磷酸水解时仅放出125kJmol自由能，而磷酸烯醇丙酮酸可释放619kJmol自由能，几乎为前者的5倍，所以葡萄糖6磷酸(磷酸酯)不算高能化合物，而磷酸烯醇丙酮酸(磷酸酐)则是。表2-4列举了细胞中常见的高能磷酸化合物。 上列诸化合物中，ATP是最常见的高能磷酸化合物，在生物新陈代谢中起重要作用。 (二)细胞合成ATP的途径 ATP含3个磷酸基，其中2个磷酸以高能健(符号代表)相联。当细胞需要能量时，ATP末端磷酸基水解，产生一分子ADP、一分子无机磷酸(P1)并释放能量。ATP的化学结构式如图2-1所示。 微生物产生ATP有3种方式，即底物水平磷酸化、呼吸链(或氧化)磷酸化和光合磷酸化。 1底物水平磷酸化 这种磷酸化的特点即在底物氧化过程中生成含高能磷酸键的化合物,通过相应酶的作用将此高能磷酸根转移给ADP生成ATP。这种类型的氧化磷酸化方式在生物代谢过程中普遍发生，其通式可写成： XP+ADPX+ATP 碳水化合物是微生物最常用的能源，但蛋白质、类脂和核酸也可用作能源。碳水化合物在氧化过程中可以提供大量电子。图2-2为底物水平磷酸化常见过程的简化图式。甘油醛3磷酸被磷酸化，并氧化成1，3-二磷酸甘油酸，这一高能磷酸化合物将其C-1磷酸传给ADP而产生ATP。有关过程将在第二节详细阐述。 2氧化磷酸化 通过呼吸链产生ATP的过程称为电子传递水平磷酸化或氧化磷酸化。这种磷酸化的特点是当由物质氧化产生的质子和电子向最终电子受体转移时需经过一系列的氢和电子传递体，每个传递体都是一个氧化还原系统。这一系列氢和电子传递体在不同生物中大同小异，构成一条链，称其为呼吸链。流动的电子通过呼吸链时逐步释放出能量，该能量可使ADP生成ATP。在呼吸链中，氢和电子传递体主要由各种辅酶和辅基组成，呼吸链的这些酶系定向有序地、又是不对称地排列在真核微生物的线粒体内膜上，或排列在原核微生物的细胞质膜上。原核生物和真核生物呼吸链含有类似的基本的氧化还原载体，就目前所知，呼吸链中最重要的中间电子传递体成员是泛醌(CoQ)和细胞色素系统。 泛醌及其衍生物是一类分子量较小的酯溶性氢载体。在电子传递链中，由于其结构上的改变起氧化还原剂的作用(图2-3)。存在于微生物中的主要是泛醌和萘醌。 细胞色素都是含有铁卟啉基团的电子传递蛋白，有多种，以细胞色素a、b和c等表示，并有a1、a2b1、b2等之分。在所有真核生物的线粒体中发现的细胞色素类型是相同的，而细菌所含的细胞色素类型有很大差异。例如，大肠杆菌有细胞色素a1、a2、b1和o；枯草芽胞杆菌含有细胞色素a、a3、b、c和c1。以英文小写字母区别的各种细胞色素，其转移电子的顺序并非按字母顺序进行，而是cytbcytccyta。呼吸链的最末端细胞色素a称为细胞色素氧化酶(cytochrome oxidase)，它将电子转移给氧分子。 电子传递水平磷酸化是经由呼吸链进行的。底物氧化时脱下的氢和电子首先交给NAD+生成NADH+H+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，或交给NADP+生成NADPH+H+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)，后者经过转氢酶的作用也可以将氢转给NAD+生成NADPH+H+。也有的底物将脱下的氢和电子交给FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)或FMN(黄素单核苷酸)生成FADH2或FMNH2。然后NADH+H+或FADH2以及其它还原型载体上的氢原子以质子和电子的形式进入呼吸链，顺序传递至最终电子受体，同时偶联有ATP的产生。图2-4表示一条呼吸链的作用过程。电子传递磷酸化的效率通常用PO来表示，PO代表每消耗一个氧原子所形成的ATP数。真核生物如酵母菌为3，而细菌大约只可达到1。 3光合磷酸化 光合磷酸化是将光能转变为化学能的过程。在这种转化过程中光合色素起着重要作用。微生物中蓝细菌、光合细菌以及嗜盐细菌的光合色素的光合磷酸化特点均有所不同。 (1)蓝细菌。蓝细菌进行光合作用是靠叶绿素。和高等植物一样，蓝细菌在光合作用中还原C02的电子是来自水的光解，并有氧的释放，把这类光合作用称为放氧型光合作用。属非环式光合磷酸化(图2-5)，其特点是有由光合色素组成的I与两个光反应系统。蓝细菌中的非环式电子传递，不但能产生ATP，而且还能提供NADPH+H+。系统I的光合色素为叶绿素P700，它吸收光能后释放电子，电子通过铁还蛋白将NADP+还原为NADPH +H+。系统的P680吸收光能后释放电子，经质体醌(一种醌类衍生物)、细胞色素b、细胞色素f、质体蓝素等传递体，最后将电子交给系统I的P700。系统失去的电子以水的光解所放出的电子来补充。在整个电子传递过程中有ATP产生。 (2)光合细菌。光合细菌包括紫细菌和绿细菌，它们是在厌氧条件下靠细菌叶绿素进行光合作用。细菌叶绿素是光合细菌的光反应色素，它也具有镁卟啉环的中心结构，但侧链不同于叶绿素，目前已发现有a，b，c，d和e5种。绿硫细菌的光反应中心色素主要是细菌叶绿素c，d和e。而在紫细菌中光反应中心色素主要为细菌叶绿素a。光合细菌在光合作用中还原C02的电子是来自还原型无机硫、氢或有机物，没有氧气的释放，称为非放氧型光合作用。其光合磷酸化的方式为环式光合磷酸化(图26)。首先，细菌叶绿素吸收光能处于激发状态，放出高能电子。电子通过铁氧还蛋白、COQ、细胞色素b和细胞色素c的电子传递系统，最后返回细菌叶绿素。在电子传递过程中产生ATP。 (3)嗜盐细菌。其光合系统较一般光合细菌更简单，它不含细菌叶绿素，也不存在电子传递链，只具有唯一的色素蛋白，这就是存在于质膜中的细菌视紫红质(bacteriorhodopsin)，它是由视黄醛以烯醇式碱基与蛋白质的赖氨酸残基通过共价键相连而构成。当光照时，视黄醛放出H+到细胞膜外，失去H+的视黄醛又从细胞质内获得H+，在光照下又被排出。如此反复进行，形成膜内外质子梯度，当膜外的H+通过膜中的H+-ATP酶返回时，合成ATP。所以细菌视紫红质具有光驱动质子泵的作用。再加上H+-ATP酶就构成了最简单的光合磷酸化体系(图2-7)。 三、微生物细胞中能量的释放和利用 根据最终电子受体性质的不同，微生物产生能量的方式有3种，即发酵、有氧呼吸和无氧呼吸。 (一)发酵作用(fermentation) 在生理上，发酵作用是不需要分子态氧(02)作电子受体的氧化作用，为厌氧代谢，在此过程中电子供体和受体都是有机物分子。作为基质的有机物质只是部分碳原子被氧化，所形成的某些中间产物又作为受氢体接受氢而形成新的产物。酒精发酵和乳酸发酵就是这类作用的典型代表。发酵产生ATP的机制主要是底物水平的磷酸化，即由底物氧化而产生的高能磷酸键被转移到ADP分子上形成ATP。微生物的发酵作用最常见于糖类的厌氧降解作用中，特别是葡萄糖的代谢。而一般工业发酵的含义则较广泛，凡是利用微生物进行生产的过程，无论是在有氧条件下还是无氧条件下，统称为发酵。发酵是厌氧微生物在生长过程中获能的一种主要方式。但这种氧化不彻底，只释放出一部分能量，大部分能量仍贮存在有机物中。例如，酵母菌利用葡萄糖进行酒精发酵时，一分子萄萄糖仅释放出2257kJ的能量，其中约有627kJ贮存在ATP中，其余能量(2257-627=163kJ)以热散失，而大部分能量仍贮存在产物酒精中。 有些兼性厌氧菌在无氧条件下也能进行发酵作用，这时若通人氧气则会发生呼吸作用对发酵作用的抑制，这一现象首先是由巴斯德发现的，称为巴斯德效应。在利用酵母菌发酵生产酒精时若通人02，则发酵作用减慢，表现为酒精的产量下降。 (二)有氧呼吸(respiration) 即呼吸作用。是指微生物氧化底物时以分子氧作为最终电子受体的氧化作用。通过有氧呼吸可将有机物彻底氧化并释放出贮存在有机物中的大量能量。其中一部分转移到ATP中，另一部分则以热的形式散出。例如，一分子葡萄糖在有氧条件下完全氧化成CO2和H20时可放出2875810的自由能，其中约有1 254kj贮存在ATP中，其余以热的形式散出，因此，有氧呼吸的特点是必须有氧气参加，底物氧化彻底，产能量大。有氧呼吸是需氧和兼性厌氧微生物在有氧条件下进行的生物氧化方式。化能异养微生物以有机物如葡萄糖、淀粉、纤维素等作为呼吸底物；而化能自养菌是以无机物作为呼吸底物，如氢细菌、硫细菌和硝化细菌分别利用氢气、含硫无机物(H2S，S，S203-)、氨或亚硝酸等作为被氧化的底物。底物氧化时脱下的氢和电子经呼吸链传递，最终将它们交给分子氧生成水，同时释放出大量的能量，完成了有氧呼吸过程。 (三)无氧呼吸(anaerobic respiration) 化合物氧化脱下的氢和电子经呼吸链传递，最终交给无机氧化物的过程称为无氧呼吸。与有氧呼吸不同的是，在这个过程中并没有分子氧参加，而是以无机氧化物如N03-、N02-、S042-、S203-或C02等代替分子氧作为最终电子受体。与有氧呼吸相同的是，无氧呼吸过程中底物氧化脱下的氢和电子也经过细胞色素等一系列中间传递体,并伴随有磷酸化作用产生ATP，底物也可被彻底氧化。但与有氧呼吸相比，因最终电子受体为无机氧化物，一部分能量转移给它们，因此生成的能量不如有氧呼吸多。例如，一分子葡萄糖以KN03作为最终电子受体进行无氧呼吸时仅放出1 7932kJ的自由能，其余能量则转移于所生成的N02-中。 进行厌氧呼吸的微生物主要是厌氧菌和兼性厌氧菌，它们的活动可以造成反硝化作用(也称为脱氮作用)、脱硫作用和甲烷发酵作用等。 (四)能量的消耗 微生物进行的一切生理活动需要消耗能量，生长时需要消耗能量，不生长时因维持生命状态也需要消耗能量。微生物产生的能量主要用于以下几个方面： 1生物合成消耗能量 微生物合成的ATP主要用于蛋白质、核酸、脂类和多糖等各种细胞物质和各种贮藏物质的合成，使微生物得以生长和繁殖。并且细胞内的核酸、蛋白质等大分子是处于不停的降解与合成状态的，用于这些大分子再生和转换的能量称为维持能量。 2一些其他生命活动消耗能量 微生物对营养物质的主动吸收、维持细胞渗透压、鞭毛运动、原生质流动以及细胞核分裂过程中染色体的分离等都需要消耗能量。 3生物发光消耗能量 到目前为止，在细菌、真菌和藻类中都发现有可发光的菌种存在。生物发光现象实质上是将化学能转变为光能的过程。该过程必须具备有发光素和发光素酶。 4有些ATP以热的形式散失 在需要ATP的合成反应中，ATP水解时释放出的能量并非完全被利用，有些是以热的形式散失了。例如在进行微生物培养时，常表现出培养物自升温现象。因此，在发酵工业上常需降温设备来解决这个问题。微生物的分解代谢 复杂的有机物质，通过一系列分解代谢酶系的催化，产生能量(ATP)和小分子物质的过程称为分解代谢。微生物可利用的有机物营养种类很多，不同有机物的分解途径各异。己糖是各种多糖的主要单位，是代谢作用的一个关键环节。 一、己糖的分解 对于大多数异养型微生物来说，己糖是最重要的碳源和能源，也是微生物细胞壁、荚膜和贮藏物的主要组成成分，尤其是葡萄糖和果糖，可以直接进人糖代谢途径逐步分解成各种中间代谢产物，并释放出能量。 (一)糖酵解和三羧酸循环 葡萄糖在有氧条件下的分解过程主要经过4个阶段。即：糖酵解一生成乙酰辅酶A+三羧酸循环一进入呼吸链产能。许多好氧微生物都是通过这条途径将葡萄糖彻底氧化为C02和H20，并获得能量。糖酵解(glycolysis)从字面上理解即糖发酵裂解的意思。糖酵解可以通过不同途径，最一般的是EM途径(Embden-Meyerhof Pathway)，也称己糖二磷酸途径。这条途径是生物界所共有的，在微生物中广泛存在于许多好氧菌、兼性好氧菌和厌氧菌中。1糖酵解的EM途径 是指在不需要氧的条件下一分子葡萄糖经转化成1，6-二磷酸果糖后,在醛缩酶催化下，裂解并由此生成2分子丙酮酸的过程。葡萄糖经EM途径降解成丙酮酸的总反应式为： C6H12O6+2NAD+2pi+2ADP 2CH3COCOOH+2NADH+2H+2ATP 反应过程如图2-8所示，包括许多步骤。葡萄糖首先经过二次磷酸化转变成1，6-二磷酸果糖。后者在EM途径的特征酶1，6-二磷酸果糖醛缩酶的作用下分解成2个三碳化合物，即3磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮，其中磷酸二羟丙酮也可转变为3，磷酸甘油醛。因此，由1，6-二磷酸果糖生成2分子3磷酸甘油醛。在此基础上脱氢和磷酸化生成2分子丙酮酸、2个NADH和4个ATP。由于在前面葡萄糖磷酸化时用去2个ATP，所以净得2个ATP。至此糖酵解反应完成。 EM途径在反应过程中生成的几种磷酸化中间产物及终产物丙酮酸在合成代谢中起着重要作用，并且为微生物提供生理活动所需的ATP和NADH。其中NADH生成后不能积存，必须重新氧化为NAD。在进行有氧呼吸时NADH经呼吸链氧化，同时由电子转移磷酸化生成ATP。在发酵时NADH将分子中的氢交给有机物使之还原，本身则氧化为NAD+ ，这时NADH并非为微生物提供能量，而是提供还原力。 2乙酰辅酶A的生成 丙酮酸在丙酮酸脱氢酶系的催化下氧化脱羧、脱氢生成乙酰辅酶A。其反应式为： 丙酮酸脱氢酶系CH3COCOOH+CoSH+NAD+ -CH3COSCoA+NADH+H+CO2 丙酮酸 辅酶A 乙 酰辅酶A 丙酮酸脱氢酶系由3种酶组成：丙酮酸脱氢酶、二氢硫辛酸转乙酰基酶和二氢硫辛酸脱氢酶。该酶系在一些兼性好氧菌如大肠杆菌中，只在有氧时才合成，无氧时不合成。在无氧条件下即使是已合成的丙酮酸脱氢酶系，其活性也被抑制。 3三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle，TCA循环) 这个循环是从乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合形成柠檬酸开始的，它是葡萄糖降解成丙酮酸后进一步彻底氧化的过程。其总反应式为： 乙酰CoA+3H2O+3NAD+FAD+ADP+pi2CO2+CoA+3NADH+3H+FADH2+ATP 反应步骤见图2-9所示。该循环的主要特点是：在循环中生成一系列二羧酸和三羧酸化合物，最后又再生出草酰乙酸。其结果是乙酰辅酶A被分解成C02、NADH和FADH2。乙酰辅酶A是脂肪酸合成的原料，TCA循环中的二羧酸和三羧酸中间化合物也为生物合成提供原料，它们与氨基酸、嘌呤和嘧啶等的合成有密切关系。因此，三羧酸循环是糖、蛋白质和脂肪酸等代谢的桥梁。反应过程中由底物水平磷酸化生成1个ATP。此外所生成的NADH和FADH2都可进入呼吸链进行有氧呼吸作用产生大量能量。因此，尽管分子氧不直接参与TCA循环，但TCA循环必须在有氧条件下才能进行。 4进入呼吸链产能 在这一步骤中，三羧酸循环中生成的NADH和FADH2进入呼吸链，将H和电子交给02生成水并生成能量，也形成诸种代谢终产物。经过糖酵解和TCA循环等4个阶段，在理想条件下，1分子葡萄糖被彻底氧化为H20和CO2，可共计产生38个ATP(在真核生物中只产生36个ATP)。其中包括在EM途径中生成8个ATP；由2分子丙酮酸生成乙酰辅酶A时生成6个ATP；由2分子乙酰辅酶A通过TCA循环至呼吸链完成共生成24个ATP(表2-5)。 (二)糖降解的其它途径 1.磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway，PP途径) 它是从6-磷酸葡萄糖酸开始分解，即在单磷酸己糖基础上进行的降解作用。PP途径重要特点是在作用过程中形成五碳糖分子，故称为磷酸戊糖途径。 反应步骤见图2-10。PP途径可分为两个阶段。第一阶段为氧化阶段：从6-磷酸葡萄糖开始，经过脱氢、水解，氧化脱羧生成5磷酸核酮糖和二氧化碳。第二阶段为非氧化阶段：是磷酸戊糖之间的基团转移、缩合(分子重排)生成一系列7碳、4碳、3碳化合物，最后使6-磷酸己糖再生。 PP途径的另一重要特征是产生NADPH，它比NADH多一个磷酸基，连接于腺苷分子的核糖环上。这两种辅酶的功能不同，NADH产生于氧化反应中用于ATP形成，而NADPH是生物合成作用的还原剂。大多数好氧和兼性好氧微生物中都具有PP途径。而且在同一微生物中往往同时存在PP和EM途径，二者在不同菌种中所占比例不同。如酵母菌对葡萄糖的利用，其中87是走EM途径，剩余13则走PP途径；青霉77走PP途径，而23走EM途径。 2ED途径(Entner-Doudoroff pathway) 这是在细菌中分解葡萄糖生成丙酮酸与3-磷酸甘油醛的另一途径。能利用这条途径的微生物远不如EM途径和PP途径那样普遍，主要是假单胞菌属的一些细菌。在分解葡萄糖的过程中，首先是将葡萄糖转变成6-磷酸葡萄糖，再氧化为磷酸葡萄糖酸，进一步转变成2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸，后者可裂解生成丙酮酸和3·磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛可进人EM途径转变成丙酮酸(图2-11)。 这条途径的产能水平较低，1分子葡萄糖分解为2分子丙酮酸时，只净得1分子ATP和2分子NADH。 3磷酸酮糖酶途径 这是一条磷酸戊糖途径(PP途径)的支路，作用过程中磷酸酮糖酶是关键性的酶，它从磷酸戊糖和己糖中裂解出乙酰磷酸。 尽管反应产物类似乎葡萄糖降解的删途径，但有不同酶系参与作用，形成不同中间产物。磷酸酮糖酶催化木酮糖5磷酸的磷酸化和裂解产生甘油醛3磷酸和乙酰磷酸。甘油醛-3-磷酸经由糖酵解的PP途径或EM途径转变为丙酮酸，并合成2分子ATP。1分子ATP已用于葡萄糖的初始磷酸化形成葡萄糖-6-磷酸，故这一途径中基质水平的磷酸化净产生的ATP仅1分子。但此途径还形成NADPH+H+ 和中间产物木酮糖5-磷酸，它是进入戊糖代谢的起点。这一途径迄今只在某些原核生物中发现，它的能效也不如EM途径，然而它使具备这一途径的微生物利用不同的基质，形成的NADPH+H+ 和中间产物，可作为合成其它化合物的前体。 二、丙酮酸代谢的多样性 由葡萄糖降解至丙酮酸后，丙酮酸的进一步代谢去向视不同的微生物和环境条件而异。在有氧条件下通过三羧酸循环彻底氧化成C02 ，生成的NADH+H+ 和FADH2 进入呼吸链将H+和电子交给最终受体分子氧生成水，获得能量。在无氧条件下一些微生物可以进行发酵作用将丙酮酸转化为各种发酵产物。微生物所进行的各种发酵，常常是以它们的终产物命名，如酒精发酵、乳酸发酵、丁酸发酵等。由于发酵过程中有机物不完全降解，并且一般只有底物水平磷酸化作用，因而其产能水平低。 (一)酒精发酵 酒精发酵是丙酮酸在无氧条件下生成乙醇的过程，典型的酒精发酵是指由酵母菌，尤其是酿酒酵母所进行的产生乙醇的过程。其产物是乙醇和二氧化碳，生成途径是葡萄糖经EM途径降解为2分子丙酮酸，然后在脱羧酶的作用下生成乙醛和C02 ，乙醛接受糖酵解中产生的NADH+H+ 的氢，在乙醇脱氢酶的作用下还原成乙醇。 这样在厌氧条件下，每分子葡萄糖经酵母菌酒精发酵后产生2分子乙醇、2分子C02 和2分子ATP。 某些细菌也能进行酒精发酵，其产物也是乙醇和二氧化碳，但它们的乙醇生成途径不同于酵母菌，是经过ED途径。由于细菌的酒精发酵与酵母菌的酒精发酵由葡萄糖分解成乙醇的途径完全不同，所以产能水平也不相同，前者较后者少一半： (二)乳酸发酵 许多细菌能利用葡萄糖产生乳酸，产生乳酸的这类细菌通常称为乳酸细菌。乳酸发酵有同型乳酸发酵和异型乳酸发酵之分。它们在菌种、发酵途径、产物和产能水平上均不相同。乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)的多数细菌通过同型乳酸发酵途径产生乳酸。同型乳酸发酵的过程是：葡萄糖经EM途径降解为丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的催化下被NADH+H+还原为乳酸,其结果是1分子葡萄糖产生2分子乳酸和2分子ATP。 其总反应式为： C6H12O6+2ADP+2Pi2CH3CHOHCOOH+CH3CH2OH+2ATP 肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)等细菌进行异型乳酸发酵。异型乳酸发酵途径的特点是有磷酸酮糖裂解反应。途径中葡萄糖经6-磷酸葡萄糖酸生成5-磷酸核酮糖，再经异构作用生成5-磷酸木酮糖。后者经磷酸酮糖裂解反应生成3磷酸甘油醛和乙酰磷酸。3磷酸甘油醛进一步转变成丙酮酸后可以通过还原丙酮酸生成乳酸，而乙酰磷酸则还原为乙醇。因此，异型乳酸发酵产物中除乳酸外，尚有乙醇和C02，并且只产生1分子ATP，相当于同型乳酸发酵的一半。 乳酸发酵在工业上用于生产乳酸，在农业上用于青贮饲料的发酵。此外，在食品加工上也有广泛应用。制作青贮饲料、腌泡菜和渍酸菜的原理是人为地创造缺氧条件以抑制好氧性腐败微生物的生长，促使乳酸细菌利用植物中的可溶性养分进行乳酸发酵，产生乳酸。由于产生乳酸后使pH下降，因此，可通过乳酸发酵抑制其它微生物的活动。并且无论腌泡菜、渍酸菜或青贮饲料都不会降低营养价值，而能使之提高。这是因为乳酸细菌既无分解纤维素的酶，又无水解蛋白质的酶。因此，它们不会破坏植物细胞，也不会使蛋白质降解。因而乳酸在饲料青贮过程中起到了防腐、增加饲料风味和促进牲畜食欲的作用。 (三)丁酸发酵 这是由专性厌氧的梭状芽孢杆菌所进行的一种发酵，因产物中有丁酸，故称为丁酸发酵。丁酸发酵的代表菌为丁酸梭菌(Cbutyricurn)。其具体步骤为：葡萄糖经EM途径产生丙酮酸，由丙酮酸进一步生成乙酰辅酶A、H2 和C02 。其中乙酰辅酶A既可以由2分子缩合成乙酰乙酰辅酶A后还原成丁酰辅酶A并进而转化成丁酸，也可以生成乙酰磷酸，这是一个高能化合物，它可以将磷酸交给ADP生成乙酸和ATP，因此，在丁酸发酵产物中有丁酸、乙酸、C02 和H2 。 在微生物中许多发酵类型都与丙酮酸代谢有关，形成丙酮酸代谢的多样性。其中有些发酵类型只为某种菌所特有，具有特殊性，常用于微生物分类上鉴别和区分菌种。例如大肠杆菌的混合酸发酵，丙酸细菌的丙酸发酵，产气气杆菌的2，3-丁二醇发酵等。图2-12是不同微生物利用丙酮酸转化成各种发酵产物的一些例子。微生物的合成代谢 微生物的合成代谢(也称同化作用)是指从简单的小分子物质合成复杂的大分子物质，如蛋白质、核酸、多糖和脂类等化合物。合成作用必须具备三要素，即小分子前体物质、能量和还原力。这三要素主要是从分解代谢(也称异化作用)中获得。所以，细胞中分解代谢与合成代谢是密切相关的，分解反应常常并不进行到底，有些中间产物根据微生物的需要而转入合成途径。 微生物的分解代谢和合成代谢的总和即为新陈代谢。尽管分解反应和合成反应有着密切的相互联系或有着共同的中间代谢产物，但合成代谢决不是分解代谢的简单逆转。它们的区别主要表现在：酶系不同。在合成代谢中作用的酶和分解代谢中作用的酶不相同。分解代谢是产能反应，而合成代谢是耗能反应。在真核生物中合成代谢和分解代谢发生在不同的细胞区域内；而原核生物细胞结构上没有分区，分解和合成主要是由不同的酶来催化完成。 一、无机养料的同化 任何营养型微生物都需要无机养料，主要吸收C02 ，无机盐离子(如硝酸和硫酸离子)，有的微生物也能同化元素分子(如N2)。 (一)二氧化碳的同化 C02 是自养微生物的唯一碳源。异养微生物也能利用C02 作为补偿的碳源。将空气中的C02同化成为细胞有机物的过程称为C02 的同化，也叫作C02 的固定。 1自养微生物对C02 的固定 C02 固定作用的总反应是： ATP 6CO2+12NADPHC6H12O6+12NADP+ 酶 具体反应过程中有的步骤与糖酵解共同，有的则与磷酸戊糖途径相同。由6分子C02 产生1分子葡萄糖需要对6分子五碳糖核酮糖1，5-'磷酸(ribulose l，5-bisphosphate)进行羧化，形成不稳定的6碳中间化合物，它随即裂解，产生12分子3磷酸甘油酸，其中2个分子依次作用，最终形成葡萄糖。其它10分子3磷酸甘油酸用于再产生6分子核酮糖1，5二磷酸，整个反应过程是循环的，称为卡尔文循环(图2-13)。在卡尔文循环中磷酸核酮糖激酶(phosphoribulokinase)和核酮糖二磷酸羧化酶(1ibulose diphosphate carboxylase)是两个关键性酶，前者推动磷酸化，后者进行羧化，生化反应在羧化体(carboxysomes)中进行。 并非所有自养微生物同化C02 都通过卡尔文循环，绿色光合细菌(Chlorobium)缺乏关键的核酮糖二磷酸羧化酶，它同化C02 时是利用TCA循环的反向还原作用，对磷酸烯醇丙酮酸、琥珀酸-CoA和。-酮戊二酸进行羧化。这一系列反应必须有还原剂铁氧还蛋白(ferredoxin)存在，而且要加入ATP。C02 的这种同化途径也存在于严格厌氧的异养细菌中。 异养微生物对C02 的固定 尽管化能异养生物碳源只有很少量来自C02 ，但它是必要的，在添补反应(anaplerotic reaction)中起重要作用，这一反应在代谢过程中补充关键性中间物质。在TCA循环中。酮戊二酸和草酰乙酸可以不断排出用以合成一些有机物的碳架，如果没有草酰乙酸的补充，则TCA循环就会中断。所以许多异养生物具有磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶，固定C02 ，形成草酰乙酸(图2-14)。在脂肪酸的合成中，C02 可由乙酰辅酶A羧化酶催化形成丙二酰-CoA(malonylCoA)而被同化。 (二)硝酸盐的同化还原 硝酸盐是一种高度氧化状态的无机氮源，它首先要被还原为氨才能同化为有机氮化物，称为硝酸盐的同化还原作用，这时氮原子的态价从+5转变为3。这一还原作用完全不同于以硝酸根作为电子最终受体的异化还原作用。硝酸盐的异化还原是厌氧呼吸的产能方式，形成的终产物是N2和其它气态氮而释放到细胞外(见第九章)。而微生物吸收硝酸盐逐步还原成氨用于细胞物质合成的硝酸盐还原方式，称为硝酸盐的同化还原。大多数细菌、丝状真菌和少数酵母菌都能够进行硝酸盐的同化还原。同化型硝酸还原需经过两个阶段。 第一个阶段是硝酸盐还原成亚硝酸盐： NO3-+NADPH+H+NO2-+H2O+NADP+ 此反应由同化型硝酸还原酶催化(区别于异化型硝酸还原中的异化型硝酸还原酶)，供氢体是NADPH+H+或NADH+H+。同化型硝酸还原酶是一种位于细胞质中的可溶性酶，当微生物以氨作为氮源时，它的合成可被氨阻遏。 第二阶段是由亚硝酸还原成氨： 其中，N02-被还原成羟胺(NH20H)的反应是由亚硝酸还原酶催化的，该酶是一种含有金属的蛋白。脉孢霉的亚硝酸还原酶中含有Cu和Pe。供氢体可以是NADPH+H+，也可以是NADH+H+。羟胺还原酶也是含有金属的蛋白。棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)的羟胺还原酶就含有Mn，供氢体是NADPH+H+或NADH+H+。 (三)分子态氮的同化(生物固氮作用) 微生物将分子态氮(N2)还原为氨(NH3)的作用称为生物固氮作用。总反应式为：N2+8e+nATP2NH3+H2+nADP+nPi要实现上面的化学反应必须具备固氮酶、电子供体、电子载体和能量条件。 1.固氮酶 固氮酶(nitrogenase)是氮气还原的生物催化剂，它的分子量很大，一般都含有2种蛋白组分，即钼铁蛋白和铁蛋白，前者是分子量为200240kDa的22型四聚体；后者是分子量约为5772kDa的二聚体。钼铁蛋白含2个Mo原子，约30个Pe原子和数目略少的S离子，它们构成2个铁钼辅因子(FeMoCo)和4个Fe-4S簇(P中心)；铁蛋白有1个Fe4S4(Cys)4n+簇。只有当这两个组分同时存在才构成具有功能的固氮酶。在固氮菌(Azotobacter)细胞中还存在不含钼的固氮酶，由钒代替了钼的作用，称为钒固氮酶。现在已知固氮菌中还有第三种固氮酶，钼钒都不存在，其作用由铁来替代。 固氮酶具有多种催化作用，除还原分子态氮外，还催化许多底物的还原作用，如H+H2、C2H2C2H4、CNCH3+NH3、N20H2等。乙炔(C2H2)还原：为乙烯(C2H4)的反应被应用于间接测量固氮酶的活性。理论计算：1分子N2还原形成2分子NH3需要6个电子，1分子C2H2还原形成1分子C2H4只需2个电子，为3：1，因而可以根据乙烯形成量来推算固氮产物的氮量。但是由于固氮生物特性不同和测定条件的差异，不能简单地根据所测定的乙烯形成量都按3：1来计算固氮量，已知变化幅度在15：1到25：1之间。在有其它生物同时存在时，情况就更复杂，乙烯是植物和许多微生物的正常代谢产物，只是形成的机制不同。固氮酶对氧气敏感，分子态氧可使其钝化而失活，所以固氮酶的催化作用必须在无氧条件下进行。因而需氧性固氮微生物的生活条件和它的固氮条件是尖锐矛盾的，它们的细胞结构和生理功能具备缓解这一矛盾的机制。 2.氮分子的还原过程 氮分子(N2)的还原需要氢和电子，其来源因不同固氮微生物而异。厌氧的巴氏梭菌靠丙酮酸裂解；光合细菌通过光合磷酸化获得电子；好氧的固氮菌则是通过TCA循环等代谢产生NADPH作为氢和电子的供体；在共生的根瘤类菌体中,有大量贮藏物质聚-羟基丁酸，它能为固氮作用提供电子。它们提供的电子经由电子载体，主要是还原势高的铁氧还蛋白(Fd)和黄素氧还蛋白(Fid)，再将电子转移给固氮酶的铁蛋白，并同Mg ATP结合，被还原了的铁蛋白将电子转移给钼铁蛋白，用于底物的还原作用，所以铁蛋白也称为氮气酶的还原酶。而钼铁蛋白也称为上氮气酶(dinitrogenase)。整个催化过程可以用图概括(图215)。 从图2-15还可看出N2还原为NH3过程中2H+被还原为H2，有关实验证明即使N2量在5.06625x106Pa，放H2作用也不可避免。所以氢是氮还原的竞争性抑制剂。下列两个反应同时进行。 N2+6e-+6H+2NH3+2ADP+12ADP+12Pi (1) 2H+2e-+4ATPH2+4ADP+4Pi (2) 葡萄糖进行完全氧化磷酸化时每对电子产生3个ATP(ATP2e-=3)。上列两项反应共需要28分子ATP，放氢损失的能量一般约占25，同硝酸还原酶相比，固氮酶催化的是高耗能(ATP)的生化反应，而且反应慢(表2-6)。固氮微生物以N2作氮源时必须合成大量固氮酶，有时酶蛋白量可达细胞总蛋白量的30。 为节省能量消耗，固氮生物只是在没有现成的无机氮化物作养料时才进行固氮作用，将N2还原为氨，它们具有一套复杂而高效的机制，来调节氮素的吸收和同化。 目前的研究结果表明能够进行固氮的都是原核微生物。已进行了广泛深入研究的固氮菌有棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii，严格好氧固氮菌)、巴氏梭菌(Clostridium paste