第三章 病毒的复制(12页).doc

-第三章 第三章 病毒的复制-第 12 页第四章 病毒的复制第一节 研究病毒复制的一般性方法研究病毒的常用培养系统噬菌体细胞培养系统用该系统研究噬菌体复制的优点：敏感的宿主细菌易于在琼脂平板上培养，其数目易于控制；噬菌体在细菌内增殖导致细菌培养物变清亮，在合适的接种密度下很容易在琼脂平板上形成噬斑，其结果容易观察；噬菌体和细菌的增殖速度快、增殖周期短，在一定时间内可多次反复实验。噬菌体同步感染敏感的细菌培养物建立了测定一步生长曲线的实验方法，弄清了噬菌体的复制循环。动物病毒动物细胞培养系统目前已建立了很多细胞株，包括脊椎动物细胞（哺乳动物细胞株）和无脊椎动物细胞（昆虫细胞株），为研究病毒复制打下了良好的基础。在离体条件下，避免了机体内的控制机制及其他因素的影响，因此只能近似反映动物机体内病毒的复制过程。植物病毒原生质体培养系统高活性的原生质体的分离和培养方法的建立，把病毒与植物机体或组织之间的复杂关系，转变为病毒与植物单细胞的简单关系，提高了感染效率。植物体的单细胞体外培养目前无法实现。在植物体外，有由纤维素组成的细胞壁，植物病毒感染植物体的感染效率要低很多。前二者都是一个病毒感染一个细胞，但是要104106个植物病毒才能感染一个植物体。采用原生质体（去掉细胞壁），则病毒的感染效率大大提高。但是总的效率还是比噬菌体和动物病毒差。无论是哪种培养系统，都要考虑： 宿主细胞的敏感性与生理状态 注意感染复数 病毒感染宿主细胞后，会导致宿主细胞出现裂缝，胞内的物质渗漏，使宿主细胞死亡。 要尽可能做到感染复数为1，即一个对一个。感染复数(multiplicity of infection, m.o.i) ：用以起始病毒感染的每个细胞所需的病毒颗粒数目。单位（PFU/cell） 1.2一步生长实验（定量描述烈性噬菌体的生长规律）以适量的病毒接种于标准培养的高浓度的敏感细胞，待病毒吸附后，再高度稀释病毒细胞培养物（避免二次吸附），或以抗病毒抗血清处理病毒细胞培养物（去除过量的噬菌体，也是为了避免二次吸附）以建立同步感染，然后继续培养，定时取样测定培养物中的病毒效价，并以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线，即一步生长曲线。体现3个时期： 潜伏期 突破期 平稳期 潜伏期中包含有隐蔽期(有感染性的病毒粒子从消失到出现这段时期)潜伏期：噬菌体吸附到细胞到释放出新噬菌体的时间隐蔽期：病毒在受染细胞内消失到细胞内出现新的感染性病毒的时间（1）潜伏期，这一时期几乎没有形成噬菌斑，进入裂解期后就形成了噬菌斑，也就是有新的病毒粒子释放出来了，因此潜伏期是指病毒吸附于细胞到受染细胞释放出子代病毒所需的最短时间。不同病毒潜伏期长短不一，噬菌体一般有几分钟，动物病毒和植物病毒以小时或天计。（2）裂解期：在潜伏期后，病毒效价急剧增加，这是新合成的病毒核酸和蛋白质装配成大量病毒粒子，并释放的结果。潜伏期后宿主细胞裂解释放出大量子代病毒的时期称为裂解期或成熟期。这一点跟细菌的生长曲线不同，细菌的生长曲线中的延滞期是为分裂做准备，对数期是大量繁殖的时期，而病毒一步生长曲线中的裂解期则是病毒大量释放的时期，而不是繁殖（即复制）的时期（复制过程实际上是在潜伏期完成的）。（3） 稳定期：裂解期末，受染细胞将子代病毒粒子全部释放出来，病毒效价稳定在最高处的时期，称为稳定期，即病毒粒子已经全部释放，没有新的病毒粒子释放了，所以形成的噬菌斑数量保持不变，不会下降，因此不会像细菌的生长曲线那样有衰亡期。一步生长曲线的意义：（1）可获知潜伏期和裂解期。（2）可获知裂解量：每一受感染细胞所产生的子代病毒粒子的平均数。 稳定期的病毒粒子数目裂解量= 潜伏期受感染细胞的数目第二节 病毒的复制周期病毒增殖（multiplication） 只在活细胞内进行，以病毒基因为模板，在酶作用下，分别合成其基因及蛋白质，再组装成完整的病毒颗粒，这种方式称复制。从病毒进入宿主细胞开始，经过基因复制，到最后释放出子代病毒，称为一个复制周期。病毒的复制周期依次包括吸附，穿入，脱壳，生物合成及组装，成熟和释放。2.1吸附（adsorption）病毒附着于敏感细胞的表面，细胞表面能吸附病毒的物质结构称为病毒受体。敏感的宿主细胞是病毒复制的第一阶段。该过程包含静电吸附及特异性受体吸附两阶段。细胞及病毒颗粒表面都带负电荷，Ca2+、Mg2+等阳离子能降低负电荷，促进静电吸附。静电吸附是可逆的，非特异的。可逆性吸附：又称为静电吸附，指病毒体与细胞接触，进行静电结合。非特异性、可逆的，是由随机碰撞、布朗运动、静电引力引起，其他的粒子也可以发生这种吸附，如灰尘的吸附等。不可逆吸附：又称为真正的吸附，指病毒体表面位点（蛋白质结构）与宿主细胞膜上相应的受体结合。是决定病毒感染的真正开始。如噬菌体通过尾丝与细菌表面的受体结合，再如流感病毒通过HA（血凝素蛋白）与宿主细胞表面的唾液酸受体结合。吸附类型的转变：一般情况下病毒与宿主细胞通过不可逆吸附后即发生侵入过程，但有时也会由不可逆吸附变为可逆性吸附，这个过程主要取决于三方面的条件，即病毒吸附蛋白、病毒的细胞受体和环境因素。病毒吸附蛋白：能够识别细胞表面特异性受体的病毒体表面结构蛋白称为病毒吸附蛋白（VAP）(virus attachment protein,BAP)。它决定了病毒与敏感的细胞表面受体的特异性结合。吸附后病毒粒子或病毒核酸能进入宿主细胞中。实例：如：T偶数噬菌体的吸附蛋白噬菌体尾丝蛋白。有包膜的动物病毒的吸附蛋白是包膜上的糖蛋白突起（流感病毒血凝素糖蛋白）；无包膜的动物病毒腺病毒的吸附蛋白是二十面体壳体上的五邻纤维。病毒的细胞受体：能被病毒吸附蛋白识别，是启动感染发生的特殊细胞位点。它在很大程度上决定了病毒的宿主范围、组织亲和性，并影响病毒的致病性（不同的宿主上有不同的受体，不同的细胞上也有不同的受体）。病毒受体可分为细胞受体单位和细胞受体位点细胞受体单位（cellular receptor unit）：是指能够识别一个病毒吸附蛋白的细胞分子。通常由几个亚基单位构成，其活性依赖于分子的空间结构。细胞受体位点（cellular receptor site）：是指由一个或几个受体单位组成，并能有效地结合一个病毒粒子的细胞表面结构。具有种系特异性。 一些不同种系动物的细胞存在不同的病毒受体。如多瘤病毒受体只存在于小鼠细胞上。具有组织特异性。动物不同组织细胞上存在不同的病毒受体，从而决定了病毒的组织嗜亲性。如HIV可感染具有CD4抗原的T辅助性淋巴细胞，单核巨噬细胞。而不能感染其他细胞。实例：细菌病毒：大多数噬菌体的细胞受体在细菌的细胞壁上，如LPS、脂蛋白、蛋白质等。噬菌体的细胞受体特异性很强，因此噬菌体的专一性很强。动物病毒：多数动物病毒的细胞受体单位是镶嵌在细胞质脂双层之间的糖蛋白，即细胞膜上的糖蛋白。植物病毒没有吸附这一步，因此没有细胞受体，其感染是通过昆虫的刺入或者胞间连丝完成的。病毒吸附蛋白与细胞受体结合的机制毒吸附蛋白与细胞受体结合的机制：氢键、离子间静电引力、范德华力等可逆性吸附：只是静电引力引起，无化学键结合，易受pH影响不可逆性吸附：病毒吸附蛋白与细胞表面受体形成牢固的化学键植物病毒迄今尚未发现有特异性细胞受体，其病毒进入植物的机制是通过伤口或媒介昆虫传播的。病毒外壳蛋白与寄主细胞受体之间的关系植物病毒不表现出外壳蛋白与寄主细胞表面受体之间的特异性1把不能侵染番茄的TMV株系的RNA包上一个能侵染番茄的TMV株系的外壳，所得杂种仍不能侵染番茄。单独用不能侵染番茄的TMV毒株的RNA来接种也不能侵染番茄。反过来，能侵染番茄的RNA和不能侵染番茄的外壳装配成的病毒仍然可以侵染番茄。2用体外装配的方法把脊髓灰质炎病毒的RNA包上另一种同属肠道病毒组能侵染小鼠细胞的柯萨奇病毒的蛋白质衣壳，这种体外装配的杂种病毒就能侵染原来脊髓灰质炎病毒不能侵染的小鼠细胞。环境因素（1）温度：在一定范围内，病毒的吸附速率与温度成正比，例如：脊髓灰质炎病毒在1的吸附率仅是37的十分之一。（2）离子环境：在一定浓度的阳离子存在的条件下，能够促进病毒对细胞的吸附（二价阳离子能促进噬菌体的吸附）。螯合剂可抑制吸附。（3）pH：不同的病毒细胞系统吸附反应的最适pH有很大的不同。例如：腺病毒T型与红细胞结合的最适pH是5.58.7；而柯萨奇病毒B4吸附HeLa细胞的最适pH是3.03.5。2.2侵入（penetration）病毒核酸或感染性核衣壳穿过细胞进入胞浆，开始病毒感染的细胞内期。侵入是病毒感染的第二阶段。主要的方式有：注射式侵入：是有尾噬菌体的侵入方式。T偶数噬菌体的尾丝与细胞表面受体结合尾鞘蛋白收缩使基板上升 尾管在尾部溶菌酶的作用下插入细菌细胞壁 噬菌体头部的dsDNA分子通过尾管注入细胞大肠杆菌雄性菌株的丝杆状噬菌体也采取注射侵入细胞细胞内吞是病毒穿入细胞的常见方式细胞内吞：是种常见的动物病毒的侵入方式，如：流感病毒、痘病毒、多瘤病毒等。细胞膜将病毒粒子包裹 膜内陷形成吞噬泡使病毒粒子进入细胞质 与细胞器（如溶酶体）等的内膜融合 释放病毒粒子膜融合常见包膜病毒膜融合：病毒包膜与细胞膜的融合过程，主要是有包膜的病毒的侵入方式。直接侵入常见无包膜病毒病毒直接侵入的方式分为三种类型。部分病毒粒子直接侵入细胞，如脊髓灰质炎病毒、腺病毒许多无包膜病毒通过吸附蛋白与细胞受体结合后，宿主细胞膜的流动性可引起病毒衣壳蛋白的重排和构型变化，导致病毒粒子释放核酸进入细胞质内，病毒衣壳仍留在细胞膜外。其他特殊方式：植物病毒未发现有特异性细胞受体，通过存在于植物细胞壁上的小伤口或天然存在的外壁孔侵入细胞，也可通过植物细胞之间的胞间连丝而侵入细胞，或者通过昆虫的口器侵入细胞。2.3脱壳（virus uncoating）脱壳是病毒感染的第三阶段。指病毒感染性核酸从衣壳内释放出来的过程。有包膜病毒和无包膜病毒脱壳方式随不同病毒而异。病毒脱壳后并不完全裸露，而是与一些特异的病毒蛋白或细胞蛋白连接以抵抗核酸酶的降解作用。无包膜病毒脱壳：小RNA病毒、有尾噬菌体直接在细胞膜或细胞壁表面进行脱壳，其侵入与脱壳一次完成；呼肠孤病毒粒子有双层衣壳，经细胞内吞作用进入细胞后被溶酶体中的酶水解脱掉外衣壳，再进一步脱壳；腺病毒粒子以内吞方式进入内吞泡，其结构会发生改变由二十面体变为球形颗粒，然后进入细胞质，进一步脱去六邻体蛋白。有包膜病毒脱壳：由于以膜融合方式侵入细胞，其包膜在与细胞膜融合时已脱去，只剩核衣壳。核衣壳被移至脱壳部位，在细胞蛋白酶的作用下脱去衣壳。痘苗病毒脱壳分为两个阶段：病毒包膜经膜融合脱掉使其核心裸露，然后通过吞噬泡转移至细胞质，吞噬泡破裂进入细胞质；病毒核心在病毒特异的RNA聚合酶作用下，从痘苗病毒基因组DNA上转录约25%的早期基因，合成包括脱壳酶在内的早期蛋白，引起病毒进一步脱壳。2.4生物合成（biosynthesis）病毒感染细胞后，细胞内无病毒粒子状态，病毒要么潜伏下来将核酸整合于细胞基因组（病毒的隐蔽期），要么接管细胞的代谢机制，利用宿主的大分子合成装置通过核酸的复制与表达来完成大分子的合成，为最终形成成熟的病毒粒子提供前提物质，这是体现病毒的生命特征的周期。 病毒粒子以不同方式来影响宿主细胞大分子合成，无论何种病毒与宿主细胞系统，都能有效保护当时病毒核酸的存在，有利于大分子的物质向着病毒大分子物质合成方向转移。 大分子物质合成的整个过程有一个调节机制，基因的表达存在时间顺序性，主要通过基因表达的转录时间顺序性来调节，即分期进行的。 早期转录：早期基因 早期mRNA 早期蛋白a. 改变/抑制宿主细胞大分子合成b. 与病毒复制有关的蛋白质 复制 晚期转录：晚期蛋白（病毒的结构蛋白） 无论哪个阶段，都会产生对病毒核酸复制有调节作用的调节因子。病毒基因组复制的基本特点全保留复制和半保留复制：大多数dsDNA病毒基因组复制为半保留复制。如T4、SV40全保留复制（conservative replication）：病毒dsRNA中的两条亲本链一直缠绕在一起，仅在复制点处有几个碱基对解链，并且在复制酶的作用下复制出一条子代RNA链，然后以该新生链为模板合成出互补链，由此产生子代dsRNA基因组。 如：呼肠孤病毒的dsRNA基因组是全保留复制 一些+ssRNA噬菌体基因组复制产生的复制中间体也能通过全保留复制形成子代+ssRNA病毒基因组复制的起始：DNA病毒基因组上只有一个复制原点；RNA病毒5端的共价结合蛋白作为基因组复制起始引物；ssDNA病毒基因组两端的末端重复序列形成反转发夹结构可作为引物起始DNA的合成；逆转录病毒以互补于病毒RNA基因组的tRNA分子为引物起始合成（-）DNA链。病毒基因组复制的方向：dsDNA病毒基因组复制：单向（腺病毒）或双向复制（大多数）连续复制和不连续复制大多数dsDNA病毒基因组5 3方向复制（冈崎片段）RNA病毒的复制常常是连续合成病毒基因组复制所需要的复制酶：依赖于宿主细胞的复制酶。如SV40、多瘤病毒 病毒基因组自身编码的复制酶。如痘苗病毒 对于RNA病毒来说，复制与转录是同一种酶，即这种酶既是复制酶，又是转录酶。 复制叉方式（replication fork）指双链DNA在复制原点解开成单链，由此出现两个叉子状生长点，称为复制叉。大多数线状dsDNA病毒如T4、T7噬菌体以复制叉方式复制；环状dsDNA如SV40、-噬菌体DNA以方式进行复制。复制叉的生长大多是双向的，也有的是单向的。 滚环方式 （rolling cirlcle）单链环状DNA病毒侵入寄主后，以正链DNA为模板利用寄主细胞的DNA聚合酶复制出与之互补的负链DNA，然后形成双链DNA。在DNA酶的作用下，正链DNA被切断，它的某些内部结构被暴露出来。此时DNA聚合酶以负链DNA为模板进行复制。随着复制的进行像一条长尾巴似的被滚出去，所以这种方式叫滚环复制。 链置换方式（strand displacement）以3 5的DNA链为模板，并且由新合成的生长链置换出与模板链互补的亲链，然后新生链和模板链互补生成子代dsDNA。（1）dsDNA复制：双链DNA主要以线状存在，少数环状存在，复制时都经过两个阶段: 双链DNA在固定位置双向进行，有一个复制点或有多个复制点 出现单链的缺口或者间隙，会导致它们对核酸酶结合力大大增加。核内复制：Papovavirus（乳头瘤病毒）adenovirus（腺病毒）、herpesvirus（疱疹病毒） 质内复制：poxvirus（痘病毒）（2）ssDNA复制：病毒基因组ssDNA是以链置换的方式进行复制的； 病毒基因组DNA末端的反转发夹序列即为复制时的引物； 病毒基因组编码末端蛋白或T蛋白具有特异的核酸酶活性，可对复制中间体产生切割，T蛋白通常共价结合在处于复制状态DNA 5端； 病毒DNA复制需要宿主细胞提供DNA聚合酶和拓扑异构酶。 如：细小病毒（3）dsRNA复制：双链RNA病毒有两个特点： 它的基因组为多片段基因组（10-12）； 有双层衣壳，没有囊膜。 病毒编码的 RNA-RNA 聚合酶存在于细胞核中，在该聚合酶的作用下病毒基因组转录正链RNA。它们既能作为mRNA，又能作为病毒基因组的模板，以全保留的方式进行复制。mRNA翻译结构蛋白，装配内层衣壳后，正链RNA进入，并形成双链RNA。然后又重复上述过程，最后获得了外层衣壳。如：呼肠孤病毒（4）+ ssRNA复制：先以 +ssRNA为模板，复制出 -ssRNA，再以新合成的 -ssRNA为模板合成子代 +ssRNA，最后由 +ssRNA与病毒蛋白质装配成子代病毒粒子。如：ssRNA 噬菌体、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、TMV等。（5）- ssRNA复制：其复制过程首先以 -ssRNA为模板，复制形成 +ssRNA，再以新合成的 +ssRNA为模板合成子代 -ssRNA，然后 ssRNA 与病毒蛋白装配生成子代病毒粒子。如：弹状病毒、正粘病毒、副粘病毒等。（6）具有DNA中间体的单链 +RNA复制：单链RNA的基因组必须反转录成双链DNA；随后这种DNA必须整合到细胞DNA中；整合状态长期持续下去并传给子代细胞，也可能转录RNA，生产子代病毒或使细胞转化；感染细胞不会死亡，分裂不停止。这类病毒的潜伏期很长，有时可以终身带毒而不发病。该类病毒通常引起人和动物的肿瘤，其中包括造成人免疫性缺陷症的艾滋病病毒、白血病病毒、肉瘤病毒等。（7）部分双链DNA病毒：亲代的双链DNA先以其中的负链为模板转录为正链RNA，此RNA可作为mRNA，同时又以此正链RNA为模板反转录为负链DNA，再以负链DNA合成其互补链即形成子代双链DNA。病毒核酸的复制的主要方式病毒核酸复制的主要类型 噬菌体的转录和翻译：噬菌体基因组转录分为四个时期： 立即早期（immediate early）、延迟早期（delayed early） 准晚期（quasi-late）、晚期（late） 噬菌体的转录调控机制： 可利用宿主的转录酶进行转录（某些噬菌体本身携带转录酶，当转录酶与DNA进入细胞后，转录即刻开始）、小的DNA噬菌体完全依赖宿主的转录酶。 某些噬菌体DNA是逐步注入细胞的，首先进入细胞的基因片段被转录、余下的DNA才能进入细胞，可以导致不同的基因依次被转录。 在同一转录单位的基因相继转录时，靠近启动子的基因优先转录。 修饰宿主的转录酶，可改变其与调节亚基的相互作用。 噬菌体基因与宿主转录酶结合可以改变转录起始或终止的特异性。 噬菌体DNA出现单链的缺口或间隙可以改变它的模板性质。 不同噬菌体的mRNA的功能活性持续的时间不同。 噬菌体的多顺反子的mRNA能被切割成小mRNA。 并不是每种病毒都有上述的8种机制，可含有13种进行调节DNA噬菌体的翻译： 病毒基因能决定早期mRNA翻译的持续时间以及特定mRNA的翻译速率，从而控制噬菌体蛋白质合成的累积量。 通过改变宿主蛋白质合成的方向来达到抑制细胞本身蛋白质的合成，从而有利于病毒蛋白的产生。病毒核酸进入宿主后，病毒基因的存在决定了mRNA 在宿主细胞内翻译的持续时间以及翻译速度，从而决定了这些蛋白在细胞内的总量。动物病毒基因组的转录和翻译转录策略：一般在核内进行，绝大多数病毒依赖于细胞的转录酶和有关因子。 正链RNA病毒：直接作为mRNA翻译为蛋白质； 负链RNA病毒：由依赖于RNA的RNA聚合酶转录为互补的mRNA，再进行蛋白质合成。 双链RNA病毒：由病毒的RNA 聚合酶转录为mRNA。 双链DNA病毒：由依赖于DNA的RNA聚合酶转录为mRNA。 单链DNA病毒：先转变为双链DNA，再转录产生mRNA。 反转录病毒的正链病毒RNA：由反转录酶转录为互补单链DNA，再转变为双链DNA，整合于细胞基因组，然后转录产生mRNA。动物病毒基因组的翻译 翻译：早期 RNA 经修饰后从病毒的核心转移出来，翻译为病毒早期蛋白，包括酶类、病毒核酸复制所需的其他蛋白质。或调节宿主细胞RNA和蛋白质合成。晚期蛋白通常是子代病毒的结构蛋白，合成过量。植物病毒基因组的转录和翻译：大部分植物病毒基因组为 ss RNA，复制方式与其他RNA病毒类似，大多数植物中都有依赖于RNA的RNA聚合酶，这些酶参与病毒RNA的复制。 存在多种翻译策略。如豇豆花叶病毒基因组两个片段分别翻译产生两种聚蛋白，经酶切产生包括壳体蛋白在内的不同蛋白质。2.5装配与释放（assembly and release）新合成的病毒核酸和病毒结构蛋白组合成病毒颗粒的过程称为组装，而从细胞内转移到细胞外的过程称为释放。病毒释放的方式：宿主细胞裂解释放，见于无囊膜病毒。出芽释放，见于有囊膜病毒。病毒的结构成分核酸与蛋白质分别合成后，在细胞核内或细胞质内组装成核衣壳。 绝大多数DNA病毒在细胞核内组装； RNA病毒与痘病毒类在细胞质内组装。无包膜病毒组装成核衣壳即为成熟的病毒体，病毒的早期蛋白，即非病毒结构成分不组装入病毒，残留在感染细胞中。2.5.1装配（assembly）噬菌体：T4噬菌体：头部的装配（衣壳蛋白gp23、核心蛋白gp22、内部蛋白gpIP ）DNA的装填（DNA长度500nm，头部高度0.1nm，高度折叠。 DNA填装需要gp49（核酸酶-切割多联体）、gp16、gp17参与 ）尾管和尾鞘的装配（尾管144个gp19构成，6个环与基板连接gp18围绕尾管聚合形成尾鞘，未端加上gp3和gp15（稳定）基板的装配： 外部六角形结构：gp10、gp11、gp7、gp8、gp53、gp25 中心的塞子：gp27、gp5、gp26、gp28、gp51、gp29 gp9、gp12、gp48、gp54参与构成完整的基板。尾丝的装配： 尾丝结构成份：gp37、gp36、gp35、gp34 附属和催化蛋白：gp38、gp57、gp63、gpWac 成熟的T4噬菌体以裂解细胞方式释放。 尾部附着于头部不需要酶的作用，是一个自发过程。 动物病毒（分为2个阶段）a. 壳体装配：如脊髓灰质炎病毒，壳体由4种结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4组成。病毒基因组翻译产生前体蛋白切割形成P1、P2、P3 P1生成VP0、VP1和VP3 基因组+ssRNA进入前衣壳RNA-(VP0、VP1、VP3 )60 前病毒58个VP0切割成VP2和VP4。b. 壳体与核酸结合，形成核衣壳 对于无包膜的病毒，形成的核衣壳就是一个完整的病毒粒子，对于有包膜的病毒，需要在核衣壳外再形成一层包膜，而包膜的形成是来源于宿主细胞膜的成分，壳体装配与核衣壳形成是同时进行的。 植物病毒无包膜，核壳都以自我装配方式成熟。植物病毒一般不裂解细胞，而是通过胞间连丝传递给相邻的细胞。如TMV有2140个蛋白亚基，当蛋白亚基聚集形成20S双盘时，同一层圆盘内形成氢键、离子键。装配的起始：20S双盘与TMV-RNA结合，起始环插入双盘中央孔;装配的延伸：另外的双盘结合到TMV-RNA与第一个双盘形成的装配起始复合物上，蛋白质亚基逐个加入，完成装配过程。延伸沿两个方向进行，5端快于3端，完成整个装配需5-7分钟2.6释放（release）裂解（Disintegration）：烈性噬菌体、脊髓灰质炎绝大多数无包膜病毒释放时被感染的细胞崩解，释放出病毒颗粒，宿主细胞膜破坏，细胞随即死亡。出芽（Budding）绝大多数有包膜病毒通过细胞内的内质网、空泡，或包上细胞核膜或细胞膜以出芽方式释放而成为成熟病毒，在一段时间内逐个释出，对细胞膜破坏轻，宿主细胞死亡慢。从单个病毒吸附开始至所有病毒释放，此过程称为感染周期或复制周期。一个感染细胞一般释放的病毒数约为100-1000。第三节 病毒的非增殖性感染病毒对敏感细胞的感染可分为两类：一类是增殖性感染，这类感染发生在病毒能在其内完成复制循环的允许细胞内，并以有感染性病毒子代产生为特征。另一类是非增殖性感染：指由于病毒或是细胞的原因，致使病毒的复制在病毒进入敏感细胞后某一阶段受阻，结果导致病毒感染的不完全循环。在此过程中，由于病毒与细胞的相互作用，虽然也可能导致细胞发生某些变化，甚至产生细胞病变，但在受染细胞内，不产生有感染性的病毒子代。 病毒的非增殖性感染有三种类型：流产感染、限制性感染和潜伏感染。（一）流产感染1、概念：病毒进入细胞后，可合成部分或全部病毒成分，但不能正常装配，或仅产生无感染性的子代病毒颗粒。2、原因：（1）依赖于细胞的流产感染允许细胞：病毒能在其中完成复制循环的细胞非允许细胞: 病毒不能在其中完成复制循环的细胞（这两个概念见教材）若病毒感染的是非允许细胞，则病毒能进入早期复制，然而由于缺乏装配的酶，晚期基因的表达等，导致病毒没完成复制过程。（2）依赖于病毒的流产感染基因组不完整的缺损病毒引起，因一个或多个病毒复制所需基因有缺损，丧失功能，无论感染允许细胞还是非允许细胞，都不能完成复制循环，如DI颗粒、卫星病毒等。（二）限制性感染由于易感细胞的瞬时允许性而产生的，其结果或是病毒持续存在于受染细胞内不能复制（此时的易感细胞是非允许性细胞），直到细胞成为允许性细胞，病毒才能繁殖，或是一个细胞群体中仅有少数细胞产生病毒子代。（三）潜伏感染：在受染细胞内有病毒基因组持续存在，但并无感染性病毒颗粒产生，而且受染细胞也不会被破坏。非增殖性感染：病毒感染宿主细胞后不能产生有感染性的病毒粒子。原因： 可能是病毒基因组侵入细胞后任一阶段出现差错，宿主DNA/蛋白等仍能合成； 可能是装配和释放过程出现错误，从而导致非增殖性感染出现。 整合感染：病毒的基因组整合在宿主细胞染色体上，这种感染方式也不产生有感染性的病毒粒子。 a. 源于细胞本身产生 非允许细胞 （病毒无法完成感染） b. 源于病毒本身产生 缺损病毒造成：这种缺损病毒是因为缺少病毒自主复制所必需的一个或几个基因功能，所以在宿主细胞中不能完成增殖性感染的过程。 （1）干扰缺损病毒（DI病毒）：在病毒的感染过程中，所产生的一类亚基因组突变体，这类突变体缺少了病毒基因复制所必需的一个或几个功能基因，因此不能单独复制，必须要在同型完整病毒辅助下才能完成复制，但是由于DI病毒与完全病毒竞争复制所需的共同基因产物，所以DI病毒在某种程度上能抑制完全病毒的复制，导致产量下降，这种完全病毒称为标准病毒。 基因组存在缺失。不同的DI病毒缺损的大小数量是不同的，有的达到90%，但无论缺损多少，都必需保留有： a. 为病毒复制起始化的序列； b. 病毒壳体化序列。 可以干扰同源的标准病毒复制。DI病毒和标准病毒为了复制竞争相同的基因功能产物而发生选择性的复制过程，且这种情况下，DI病毒一般处于优势，因为DI病毒含有较小的基因组，对核酸酶的亲和力较大，从而使标准病毒复制数量大大降低。 必须依赖同源病毒才能进行复制。 具有与标准病毒相同的形态特征、结构蛋白与抗原性。 如何产生完整的高活性病毒以避免DI病毒的产生： 通过高倍稀释（低感染复数） 直接采用克隆病毒的方法：类似于在微生物分离纯化中用到的挑噬菌斑方法。 由于缺损干扰颗粒的产生，使同种感染性病毒数量减少，在导致病毒的持续性感染中具有一定的作用，但疫苗中含有大量缺损干扰颗粒会影响活疫苗的免疫效果。 （2） 卫星病毒 最典型的特征：具有极端寄生性，寄生于与之无关的辅助病毒上。与DI颗粒相似性：它也是缺损病毒，必须依赖于辅助病毒才能进行复制，并且能够干扰辅助病毒的复制；与DI颗粒不同：卫星病毒不是来源于辅助病毒的亚基因组突变体，它是自然界中存在的一类病毒，与辅助病毒的DNA/RNA毫无关系。子代对应亲代：干扰缺损病毒与标准病毒两者存在亲缘关系；卫星病毒与辅助病毒无任何关系，与辅助病毒间存在严格的特异性。（3） 假病毒体在病毒感染过程中，由于宿主细胞核酸完全取代了病毒基因组核酸的一类病毒，则称为假病毒体。 （4） 条件缺损病毒一类基因组发生突变的条件致死突变体，在允许条件下能够正常繁殖，在限制条件下导致流产感染，也能干扰野生型病毒复制。 （5）整合感染基于某些温和性病毒（某些噬菌体、肿瘤病毒）感染宿主细胞后，其部分或整个病毒基因组整合于宿主细胞的基因组中，并且能够随细胞基因组而同步复制，遗传给子代细胞，只有在某些条件下（自发/诱导），病毒基因组脱离细胞基因组，转向合成完整的病毒粒子。3.3病毒的拯救 处于流产感染状态的病毒，可以通过一定办法，使它们完成增殖性感染，从而产生子代病毒粒子。 两种办法： 协同培养：2种或2种以上的细胞混合培养，假如其中一种细胞是另一种细胞中的病毒允许细胞则混合培养可使病毒增殖。 协同感染：由2种或2种以上的病毒同时感染一个细胞，因为其中辅助病毒可为流产感染病毒提供繁殖所必需的基因产物。 温和噬菌体与溶源性细菌温和噬菌体：噬菌体感染细胞后，将其核酸整合（附着）到宿主的核DNA上，并且可以随宿主DNA的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。原噬菌体（或前噬菌体）：即整合在宿主核DNA上的噬菌体的核酸。 溶原性细菌：指在核染色体上整合有原噬菌体的细菌。可进行正常生长繁殖，而不被裂解。 病毒感染细胞后会发生2种反应： 溶源反应：产生溶源性细菌子代细胞CI基因的产物CI蛋白：是一种阻遏蛋白，可阻止左右两个早期启动子的转录，使之不能产生引起与复制及细胞裂解有关的蛋白，但在UV诱导下REC蛋白可降解CI蛋白，诱导90%的细胞裂解。 裂解反应：通过大分子合成成熟的子代病毒 导致细胞被裂解死亡溶原性细菌的特点可稳定遗传：子代细菌都含有原噬菌体，均具有溶原性； 可自发裂解：温和噬菌体的核酸也可从宿主DNA上脱落下来，恢复原来的状态，进行大量的复制，变成烈性噬菌体，自发裂解几率10-210-5 ； 可诱导裂解：用化学、物理方法诱导； 具有“免疫性”：溶原菌对其本身产生的噬菌体或外来的同源噬菌体不敏感，对同源噬菌体具免疫性，对非同源噬菌体无免疫性； 可自愈：自然遗失前噬菌体； 溶源转变：由于溶原菌整合了温和噬菌体的核酸而使自己产生一些新的生理特征。