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-基因工程考试试题-第 6 页基因工程一 名词解释1、限制与修饰系统：限制酶的生物学功能一般被认为是用来保护宿主细胞不受外源DNA的感染，可讲解外来DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。一般来说，与限制酶相伴而生的修饰酶是甲基转移酶，或者说是甲基化酶，能保护自身的DNA不被讲解。限制酶和甲基转移酶组成限制与修饰系统。2、各种限制与修饰系统的比较型型型识别位点46bp，大多为回文序列二分非对称57bp非对称切割位点在识别位点中或靠近识别位点无特异性，至少在识别位点外100bp识别位点下游2426bp简答1.何谓 Star activity？简述 Star activity 的影响因素及克服方法？ 答： 在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特征称为星星活性。引起星星活性的的因素：高甘油浓度（>5%）；酶过量（>100U/µl）；低离子强度（<25mmol/L）；高 pH (>8.0)；有机溶剂如 DMSO （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等；用其它二价阳离子 Mn2+、Cu2+、Co2+ 或 Zn2+ 代替 Mg2+ 。星星活性的抑制措施：减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度；保证反应体系中无有机溶剂或乙醇；提高离子强度到 100150mM （在不抑制酶活性的前提下）；降低反应 pH 至 7.0 ；使用 Mg2+ 作为二价阳离子。 2. 试回答影响限制性内切核酸酶切割效率的因素？ （影响酶活性的因素？）答： 外因：反应条件、底物纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当，反应体系的选择、反应时间的长短内因：星星活性、底物甲基化、底物的构象 3、DNA末端长度对酶切割的影响答：限制酶切割 DNA 时，对识别序列两端的非识别序列有长度要求，也就是说在识别序列两端必须要有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。在设计PCR引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切割扩增的PCR产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。一般需加 34 个碱基对。4、何为载体？一个理想的载体应具备那些特点？ 答： 将外源 DNA 或目的基因携带入宿主细胞的工具称为载体。载体应具备：在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原点）；必须具备合适的酶切位点，供外源 DNA 片段插入，同时不影响其复制；有一定的选择标记，用于筛选；其它：有一定的拷贝数，便于制备。5抗性基因（Resistant gene）是目前使用的最广泛的选择标记，常用的抗生素抗性有哪几种？并举两例说明其原理？ 答：氨苄青霉素抗性基因（ampr）、四环素抗性基因（tetr）、氯霉素抗性基因（Cmr）、卡那霉素和新霉素抗性基因（kanr , neor）以及琥珀突变抑制基因 supF 。青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，抑制转肽反应并抑制其活性。氨苄青霉素抗性Ampr 编码一个酶，可分泌进入细胞的周质区，并催化 -内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素的毒性。四环素与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。 Tetr 编码一个由 399 个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。6.何为 -互补？如何利用 -互补来筛选插入了外源 DNA 的重组质粒？ 答：-互补 指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的 -半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。 -互补是基于在两个不同的缺陷 半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。实现 -互补主要有两部分组成： LacZM15 ，放在 F 质粒或染色体上，随宿主传代； LacZ' ，放在载体上，作为筛选标记，当在 LacZ' 中插入一个片断后，将不可避免地导致产生无 -互补能力的 半乳糖苷酶片断。在诱导物 IPTG 和底物 X-gal（同时可作为生色剂）的作用下，含重组质粒的菌落不能产生有活性的 半乳糖苷酶，不能分解 X-gal ，呈现白色，而含非重组质粒的菌落则呈现兰色。以此达到筛选的目的。 7、试简述噬菌体的裂解生长状态Lytic growth 和溶原状态Lysogenic state 两种循环的分化及其调节过程？ 答：裂解生长状态是噬菌体在宿主中大量复制并组装成子代噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂解。溶原状态为噬菌体基因组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主染色体 DNA 中随宿主的繁殖传到子代细胞。调节过程： 由感染复数和细胞的营养状态决定的，感染复数越高，营养状态越差，则溶源化的频率就越高。溶源现象的生化媒介可能是3'-5'cAMP，它在细胞内的浓度会随营养条件的变化而改变，当细胞在富营养培养基中生长时，cAMP 的浓度较低，有利于裂解生长；在缺乏cAMP的突变细胞中，更有利于裂解生长另外一个重要的调节因素是噬菌体的C蛋白，它是噬菌体基因转录的激活子，抑制裂解功能基因的表达，催化噬菌体 DNA 整合到细菌的染色体中去。高浓度的C蛋白促进溶源化，而低浓度的C蛋白促进裂解生长。当C蛋白浓度足够时，激活C蛋白和基因 int 的表达，导致噬菌体DNA与染色体整合，朝着溶源态生长。9、cDNA文库的构建：将来自真核生物的mRNA体外反转录成cDNA，与载体连接并转化大肠杆菌的过程。 细胞总RNA的提取和mRNA的分离第一链合成：由mRNA到cDNA的过程为反转录，由反转录酶催化。第二链合成：自身引物合成法 置换合成法 引导合成法 引物衔接头合成法双链cDNA里连接到质粒或噬菌体载体并导入大肠杆菌中繁殖10、文库质量检测答：文库质量是由文库所含克隆的数目、平均插入片段的长度、插入效率、基因组覆盖度和覆盖倍数等因素决定。克隆数越多、平均插入片段的长度越长、插入效率和基因组覆盖度越高，文库质量越好。克隆数目可以通过多次转化累加，但并非越多越好，只要达到一定数目的基因组覆盖倍数和覆盖度就行，一般要求达到46倍覆盖率。11、基因覆盖倍数的估算方法答：有两种，一：用公式计算 基因组覆盖倍数=平均插入片段的长度克隆数/基因组DNA长度 二：结合基因覆盖度检测来估算。 基因组覆盖度是指问苦衷克隆覆盖基因组的范围。即选择一定数目的单拷贝基因作探针来筛选文库。每个探针筛选的克隆数目，即为该基因位点的覆盖倍数。12、解释并计算N=ln(1-P)/ln(1-f) 式中N：代表一个基因组文库所包含重组克隆个数 P：代表所期望的目的基因在文库中出现的概率 f：表示重组克隆平均插入片段的长度和基因组DNA长度的比值 计算：大肠杆菌基因组大小约4.6 mb，若P=99%，平均插入片段大小为20kb，f=20kb/4600kb, 则N=1057.即当期望从一个平均插入片段为20kb的大肠杆菌基因组文库中筛选到任意一个感兴趣的基因的概率达99%，该基因文库至少应包含1057个重组克隆。选择合适的载体系统和挑去一定的阳性克隆是构建基因组文库时首先考虑的问题。论述题1、cDNA文库的均一化处理两条途径：基因组DNA饱和杂交法和基因组DNA饱和杂交法基因组DNA饱和杂交法原理：利用不同表达水平的基因对应的基因组拷贝数相对一致的特点，可以对cDNA文库进行均一化处理步骤将基因组DNA用限制性内切酶消化固定，消化后的基因组DNA扁形为相对较短的单链且最大可能的覆盖基因组。分离纯化独立cDNA文库的混合质粒 文库cDNA与固定的基因组DNA充分饱和杂交，固定住相应的cDNA，并将它洗脱重新转化受体菌。优点：应用简单、没有一仪器上的限制缺点：由于基因组DNA相对很复杂，很难获得覆盖基因组的单链DNA片段，导致基因丢失； 在基因组DNA与文库DNA杂交的过程中，文库DNA自身杂交的速度会很快，导致基因丢失。基因组DNA饱和杂交法原理：双链DNA在加热变后再复性形成双链DNA的速度遵循二次复性动力学原理。即与组分中的单链DNA浓度有关，浓度越小，复性所需时间越长。cDNA文库中高丰度的cDNA复性所需要的时间短，低丰度的cDNA复性所需的时间长。通过对复性时间的控制，可以使高丰度的cDNA复性成双链状态，低丰度的cDNA保持单链状态。利用羟基磷灰石柱很容易将单链和双链cDNA分开，再用得到的单链cDNA转化宿主细菌，即可得到均一化cDNA文库。优点：几乎不会导致文库中cDNA的丢失；均一化效果明显缺点：基因组DNA饱和杂交法成功率高，而基因组DNA饱和杂交法在参数控制上存在着比较多的因素。2、扣除杂交cDNA文库原理：利用分子杂交原理，去除非差异表达基因的cDNA，保留差异表达的基因的cDNA用于制备文库。待测样本tester: 待测样本的总cDNA。对照样本driver: 表达谱背景一致但不含目的基因的总cDNA。tester与过量的driver杂交，用特定方法将二者共同表达的cDNA去除。如：抑制性扣除杂交(suppression subtractive hybridization, SSH) 原理：含目的基因的cDNA称为供体tester，不含目的基因的cDNA称为驱动driver。它们是由对应的mDNA组分在体外独立反转录成的。同时利用识别4个碱基的限制性内切酶Rsa将这些cDNA消化成平末端小片段。将供体一分为二，分别接上二种不同的接头。第一轮杂交：过量的驱动cDNA分别与带有2中不同接头的供体cDNA杂交，在2个独立的杂交体系中，供体与驱动cDNA会形成4种类型的cDNA片段：a、供体中既没有与供体杂交，也没有与驱动杂交的cDNA分子。b、供体中自身杂交的cDNA分子。c、供体与驱动中共同表达的基因杂交形成的双链cDNA分子。d、驱动中自身杂交和不能自身或与供体杂交的cDNA分子。第二轮杂交：将第一轮杂交的两个体系混合，再加入过量的驱动cDNA，进入第二轮杂交。杂交结果进一步形成了a、b、c、d。也形成了e（带不同接头a形成的）。将第二轮杂交的产物进行末端补齐，再进行两轮PCR扩增。在扩增过程中，由于a、d两端没有引物结合位点而不能再扩增。b两端带有相同的接头序列，形成蜗柄结构，不能进行指数扩增。c 只有一个引物接头，只能被线性扩增。只有e是均一化的，差异表达的基因。 用巢式引物进行第二轮PCR，降低PCA产物的背景，富集差异的基因。最后将PCR产物用T/A克隆载体进行克隆构建扣除杂交cDNA文库3、烟草酸性焦磷酸酶法构建全长cDNA文库 原理：烟草酸性焦磷酸酶（TAP），能特异性地识别真核生物mRNA的5端帽子结构并将其去除。暴露出切口5端的磷酸基团，可在该切口处连接一段特异的接头来引导cDNA第二链的合成。 在反转录合成第一链前对mRNA进行去磷酸化处理，使不完整的mRNA分子暴露的5磷酸基团被去掉。 在反应中加入TAP，特意的去掉完整mRNA分子5末端的帽子结构，暴露出5磷酸基团。 在T4 RNA连接酶的作用下，可以在5端连接上一段特异的RNA接头，不完整的mRNA分子中，由于缺少磷酸基团而不能接上接头。因此，只有添加了接头的全长mRNA分子才能在接头引导下合成第二链cDNA。理论上讲，用此法合成的cDNA都是全长的cDNA。4、酵母双杂交系统 （画图） P207简称双杂交系统（two-hybricl system）也叫相互作用陷阱（interaction trap）是根据真核生物转录调控的特点，创建的一种体内鉴定基因的方法。其筛选的基因不是“探针”的直接编码产物，而是能够与其相互作用的蛋白质的编码基因，即筛选与一直基因产物发生相互作用的蛋白的编码基因。许多真核生物转录激活因子有两个功能区域，一是DNA结合结构域（DNA binding domain,BD），可与DNA序列的特定位点即上游激活序列结合；二是转录激活结构域（activation domain,AD）,协助RNA聚合酶复合体激活上游激活序列下游基因的转录。将X与BD融合，蛋白Y与AD融合，将它们导入酵母细胞中表达，如果X和Y相互作用，则会导致BD和AD在空间上接近，形成一个有功能的转录激活因子，激活下游报告基因的表达。5、根癌农杆菌介导法（画图） 原理：根癌农杆菌内有一个大的致瘤质粒（tumor inducing plasmid）,简称Ti质粒，当根癌农杆菌感染植物时，菌体本身并没有进入植物细胞内，而仅是Ti质粒中一部分称之为“T-DNA”的DNA片段进入宿主细胞并插入基因组中，T-DNA中的基因利用植物的酶系统进行转录和翻译，其表达产物可诱发植物产生肿瘤。 根癌农杆菌Ti质粒的基因结构主要分为T-DNA区（transferred DNA region）、Vir区（virulence region）、Con区（region encoding conjugation）和Ori区（origin of replication）4个区段。T-DNA区称为转移DNA区。即根癌农杆菌侵染植物时转移到植物基因族中的一段DNA序列，该序列上的基因与肿瘤的形成有关。Vir区与T-DNA区相邻，该基因可激活T-DNA的专一，使植物致瘤，故称毒性区。Con区段上存在与细菌结合转移有关的基因，调控Ti质粒在根癌农杆菌中的转移，故称为结合转移编码区。Ori区主要调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。 过程：农杆菌对受体的识别农杆菌附着到受体细胞诱导和启动毒性区基因表达类似结合孔复合物的合成和装配T-DNA的加工和转运6、一元载体的构建的基本原理将Ti质粒上T-DNA中的致瘤基因全部去掉，使其丧失对植物的致瘤性。仅保留其两侧边界与T-DNA准确转移所必须的25个碱基序列，故这种载体又称为卸甲载体。由于根癌农杆菌的Ti质粒比较大，难以进行体外遗传操作，需要引入一个较小的中间载体，将欲转化的目的基因构建于中间载体上。在卸甲载体T-DNA区中删除致癌基因的位点插入一段与中间载体同源的质粒序列。将中间载体转移到含有卸甲载体的根癌农杆菌中。由于卸甲载体的T-DNA与中间载体具有同源序列，故可在根癌农杆菌中发生同源重组。将中间载体整合到卸甲载体的T-DNA区，并与卸甲质粒一起复制。为发生整合的中间载体因其没有在根瘤农杆菌中的复制元件，会自行消失。根据中间载体上所携带的抗性基因进行抗性筛选，即可。7、二元载体的构建的基本原理 原理： 对于一元载体来说，因为其T-DNA与Vir区是在同一载体上，故又称顺式载体。而事实上，T-DNA与Vir区完全没有必要一定要构建到同一载体。当它们处于不同载体上时， Vir区通过反式作用依然可以使T-DNA发生转移。 二元载体中，根癌农杆菌菌株中含有两个Ti质粒，一个称为微型Ti质粒，一个称为辅助Ti质粒。其中微型Ti质粒缺失了Vir区，其T-DNA也进行了卸甲处理，同时引入多个酶切位点，方便外源基因的插入，此外，具有广谱的复制原件，可同时在大肠杆菌和根癌农杆菌中生存。经过改造的微型Ti质粒相当小，可像一般质粒一样进行遗传操作。辅助Ti质粒相对较大，只去除了T-DNA，可激活微型Ti质粒上的T-DNA发生转移。 优点：二元载体构建较为方便；由于一元载体的T-DNA中含有中间载体，它们会随同外源目的基因一起被转入植物细胞内，而二元载体的不会带入大量无用的冗长DNA序列。因此外源基因的转化效率高于一元载体。8、Sanger双脱氧链终止法（画图） P158 双脱氧链终止测序法使用双脱氧核苷酸，它与脱氧核苷酸的主要不同在于：双脱氧核苷酸分子中脱氧核糖的3位置的羟基（OH）缺失。扩增时，在DNA聚合酶的作用下，其5位置的磷酸基团与上位脱氧核苷酸的3位置的羟基结合，但是，由于其自身3位置的羟基缺失，致使下位的5位置的磷酸基无法与之结合。即，双脱氧核苷酸整合到正在合成的DNA链中，该DNA的合成就到此终止。9、载体的分类 按功能分：克隆载体：（主要用于扩增或保存DNA片段，是最简单的载体。具有强大的包装能力） 表达载体：（带有目标细胞识别的启动子） 其他载体：（整合载体、穿梭载体等） 按来源分：质粒（细菌等原核生物染色体外遗传物质） 噬菌体（原核细胞的病毒） 真核病毒（真核细胞的病毒） 人工遗传物质（噬菌粒、粘粒、细菌、酵母等）10、基因转移常用方法及对象 自然转化：细菌等原核生物直接吸纳DNA 人工导入：物理法、化学法、生物法 物理：基因枪、超声波、显微注射、体细胞核移植、点击法 化学法：PEG诱导 生物：农杆菌介导法、花粉管通道法 对象：微生物、植物、动物 实验 分子杂交一： Southern 杂交 原理：Southern blot：一种检测 DNA 分子的方法。将 DNA 片段从琼脂糖凝胶转移到滤膜，结合了 DNA 分子的滤膜先与特定的预杂交液进行预杂交，然后与标记的核酸探针和滤膜混合。如果滤膜上的 DNA 分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸附在滤膜上。在经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去后，通过放射自显影或生化检测，就可判断滤膜上是否存在与探针同源的 DNA 分子及其分子量。 步骤：目的DNA用限制内切酶酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳0.4mol/LnaoH碱性条件下使其变性再用1.5mol/L Nacl、1mol/L 的Tris (ph=7.4)条件下中和，使DNA保持单链状态将凝胶上的DNA原位转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上80 °C处理或紫外照射，将DNA固定在滤膜上将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预杂交液进行杂交特定溶液和温度下，将标记的核酸探针与滤膜混合洗涤，将游离探针分子去除，同放射自显影或生化显影，即可判断滤膜是否存在与探针同源的DNA分子及其相对分子质量。注意：即将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中，滤膜本身对探针的吸附。主要用来判断某一生物样品中是否存在某一基因，以及该基因所在的限制性内切片段的大小。应用该技术的前提是必须有探针。