第二代和第三代慢病毒包装系统(4页).doc

-第二代和第三代慢病毒包装系统-第 4 页第二代和第三代慢病毒包装系统将HIV-1 基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列) 和编码反式作用蛋白的序列进行分离。载体系统包括包装成分和载体成分：包装成分由 HIV-1 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；载体成分与包装成分互补，含有包装、逆转录和整合所需的 HIV-1顺式作用序列。同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。第一代包装系统中，除vpu之外的辅助基因都被保留下来，Env包膜蛋白由VSV-G蛋白代替，应用 VSV-G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性。3质粒系统，包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒。其中包装质粒在 CMV 启动子的控制下，表达 HIV 21 复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白vpu；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒G蛋白 (VSV 2G)，应用 VSV 2G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性，允许通过高速离心对载体进行浓缩，提高了滴度； 转移质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列，还保留 350 bp 的 gag 和 RRE，并在其中插入目的基因或标志基因 ( 绿色荧光蛋白 GFP) 。在第二代系统中辅助基因vif、vpr、nef被进一步剔除，这些辅助基因的去除并不影响病毒的滴度和感染能力，同时增加了载体的安全性。第二代系统中5LTR 634bp，3' LTR 634bp，5LTR前不需要强启动子。4质粒系统。第三代系统中，tat调节基因也被剔除，对5LTR进行了改造，换上了异源启动子，从而不需依赖tat基因（Tat 基因编码蛋白可与LTR结合，增加病毒所有基因转录率）；构建自身失活的慢病毒载体（SIN），即删除了U3区的3LTR, 使载体失去HIV-1增强子及启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA；一些增强包装病毒滴度的元件被加入，如cPPT、WPRE。因此，第三代系统的安全性大大提升，进一步减少重组成复制型病毒(RCV) 的可能性。5' LTR (truncated) 181bp，3' LTR (U3) 234bp，5LTR前要有强启动子。4质粒系统。VSV-G包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性，允许通过高速离心对载体进行浓缩，提高了滴度。a、包装质粒  Invitrogen表达元件备注pLP1 Vectorgag/pol三质粒第三代系统。兼容性好，能与多数表达载体一起转染包装。pLP2 VectorRevPlp/VSVGVSV-GClontech表达元件备注Helper1gag-pro五质粒第四代系统。号称无需浓缩达到5*108IFU/ml。兼容型好。引入Tet-off诱导表达。Helper2vpr-polHelper3VSV-GHelper4Tet-offHelper5tat-IRES-revDidier Trono表达元件备注pMDLg/pRREgag/pol来自Didier Trono实验室，科研院校常用系统。第三代系统，经典骨架。1998pRSV-RevRevVSV-G2th generation表达元件备注pCMVgag/pol/tat/rev科研院校常用二代系统，也是Trono lab构建的。pMD VSV-GVSV-G pCMV-VSV-GVSV-G Weinberg RA，2003 第二代系统psPAX2gag/polDidier TronoInvitrogen的3个质粒与Didier Trono的第三代系统的3个质粒相同。第三代慢病毒载体系统由4个质粒构成，分别是：（1）1个具有目的基因的慢病毒表达质粒。表达质粒包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。目的基因两侧各有一个LTR（long terminal repeat）序列，LTR序列促使目的基因整合到目的细胞基因组里。为了提高安全性能，表达质粒的3LTR缺失了部分序列，使得整合后的病毒基因组失去自我复制能力。（2）2个包装质粒。其中一个质粒编码Rev，另外一个质粒编码Gag和Pol。（3）1个编码包膜蛋白的质粒。将上述4个质粒共转染细胞。GAG基因编码约500个氨基酸组成的p55蛋白前体,经蛋白酶裂解形成病毒的核衣壳蛋白(p7)、内膜蛋白(p17)和衣壳蛋白(p24)。POL基因编码聚合酶前体蛋白，经切割形成蛋白酶、整合酶、逆转录酶、核糖核酸酶H。REV基因编码Rev蛋白。表达质粒经转录产生慢病毒基因组mRNA，Rev蛋白与慢病毒基因组mRNA中的RRE结合，将基因组mRNA从细胞核转运到细胞质中。基因组mRNA与衣壳蛋白、逆转录酶、整合酶、包膜蛋白等组装成假病毒颗粒。3' LTR (U3)(234bp)包括5' LTR (truncated)（181bp）序列，5' LTR (truncated)在3' LTR (U3)的末端。