仪器分析分子发光分析法.ppt

关于仪器分析分子发光分析法现在学习的是第1页，共61页 分子发光分析法分子发光分析法较高激发态较高激发态基基 态态吸收能量吸收能量受激受激退激退激光辐射光辐射分子在退激过程中以光辐射形式释放能量分子在退激过程中以光辐射形式释放能量 5- 1 分子发光分析法及其分类分子发光分析法及其分类现在学习的是第2页，共61页 根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类：不同分为以下几类： 光致发光：以光致发光：以光能光能来激发而发光来激发而发光 化学发光：以化学发光：以化学反应能化学反应能激发而发光激发而发光化学发化学发 光分析法光分析法 热致发光热致发光 、生物发光、电致发光、生物发光、电致发光荧光荧光荧光分析法荧光分析法磷光磷光磷光分析法磷光分析法现在学习的是第3页，共61页激发光谱激发光谱和和荧光光谱荧光光谱荧光强度波长（nm)300400500硫酸奎宁的两个光谱Iex,maxfl,max现在学习的是第4页，共61页硒硒荧光分光光度法荧光分光光度法GB17378.5-1998(13.1)油类油类沉积物沉积物 荧光分光光度法荧光分光光度法GB17378.5-1998(14.1)石油烃石油烃荧光分光光度法荧光分光光度法GB17378.6-1998(14.1)现在学习的是第5页，共61页 5- 2 荧光和磷光光谱法荧光和磷光光谱法一、荧光和磷光光谱的产生一、荧光和磷光光谱的产生 基态分子光照后，基态分子光照后，价电子跃迁价电子跃迁产生荧光和磷光产生荧光和磷光 基态分子基态分子 价电子跃迁到激发态价电子跃迁到激发态光照激发光照激发去激发光去激发光 * * n现在学习的是第6页，共61页1. 电子自旋状态的多重性电子自旋状态的多重性 分子中的电子数及自旋方向分子中的电子数及自旋方向基态单重态 第一激发单重态 单重态分子具有抗磁性，激发态的平均寿命约为单重态分子具有抗磁性，激发态的平均寿命约为10-8现在学习的是第7页，共61页T1、T2、T3分别表示第一、二、三激发三重态分别表示第一、二、三激发三重态由基态单重态由基态单重态激发三重态，净自旋激发三重态，净自旋 0。这。这种跃迁为禁阻跃迁种跃迁为禁阻跃迁基态单重态基态单重态 第一激发三重态第一激发三重态 自旋平行自旋平行三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命约为三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命约为10-4 1S现在学习的是第8页，共61页 2. 无辐射去激无辐射去激 外部转移外部转移激发态分子与溶剂分子或溶质分子的激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用产生能量转移，荧光或磷光减弱或消失相互作用产生能量转移，荧光或磷光减弱或消失 振动驰豫振动驰豫(VR)同一电子能级中，从较高振动能同一电子能级中，从较高振动能级到较低振动能级的过程级到较低振动能级的过程 内部转换内部转换(IC)相同的多重态之间的转换相同的多重态之间的转换 S-S 系间窜跃系间窜跃(ISC)不同的多重态之间的转换不同的多重态之间的转换S-T 发生系间窜跃电子需转向，发生系间窜跃电子需转向，S1T1间进行，比内间进行，比内部转换困难部转换困难 现在学习的是第9页，共61页T1S0ISCVRVRIC吸光吸光 吸光吸光S0S1S2VR：振动驰豫：振动驰豫IC：内部转换：内部转换ISC：系间窜跃：系间窜跃现在学习的是第10页，共61页3.辐射去激辐射去激荧光和磷光产生荧光和磷光产生 S1或或T1 S0 这种过程叫辐射去激这种过程叫辐射去激 发光现在学习的是第11页，共61页现在学习的是第12页，共61页T1S0ISCVRVRIC吸光吸光 吸光吸光 荧光荧光图图5-1 分子荧光光谱产生过程示意图分子荧光光谱产生过程示意图S0S1S2VR：振动驰豫：振动驰豫IC：内部转换：内部转换ISC：系间窜跃：系间窜跃现在学习的是第13页，共61页（2）磷光）磷光 S1 T1 S0 磷光磷光 特点：特点： 发光速度慢，约为发光速度慢，约为 10-4 10s， 光照停止后，磷光仍可持续一段时间光照停止后，磷光仍可持续一段时间现在学习的是第14页，共61页磷光的波长更长磷光的波长更长 磷磷 荧荧 激激 * 易产生荧光易产生荧光 n * 易产生磷光易产生磷光现在学习的是第15页，共61页T1S0ISCVRVRIC吸光吸光 吸光吸光 荧光荧光 磷光磷光图图5-1 分子荧光、磷光光谱产生过程示意图分子荧光、磷光光谱产生过程示意图S0S1S2VR：振动驰豫：振动驰豫IC：内部转换：内部转换ISC：系间窜跃：系间窜跃VR现在学习的是第16页，共61页二、荧光、磷光与分子结构的关系（一）荧光效率（一）荧光效率 荧光强度常用荧光量子效率荧光强度常用荧光量子效率f 来描述来描述 荧光量子效率荧光量子效率 f =发荧光的分子数发荧光的分子数激发态分子总数激发态分子总数现在学习的是第17页，共61页分析上有应用价值的荧光化合物的荧光效分析上有应用价值的荧光化合物的荧光效率大于率大于0.1。现在学习的是第18页，共61页（二）荧光磷光与有机化合物结构的关（二）荧光磷光与有机化合物结构的关系系 至今对激发态分子的性质了解不深，无法定至今对激发态分子的性质了解不深，无法定量地描述荧光与分子结构之间的关系量地描述荧光与分子结构之间的关系 物质只有吸收了紫外可见光，产生物质只有吸收了紫外可见光，产生 *、n *跃迁，产生荧光跃迁，产生荧光现在学习的是第19页，共61页 *与与n *跃迁相比，摩尔吸收系数跃迁相比，摩尔吸收系数大大102103，寿命短，寿命短 *跃迁常产生较强的荧光，跃迁常产生较强的荧光， n *跃跃迁产生的荧光弱，但可产生系间窜跃，产迁产生的荧光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光生更强的磷光现在学习的是第20页，共61页1. 共轭体系共轭体系有较强的荧光有较强的荧光 具有共轭体系的芳环或杂环化合物具有共轭体系的芳环或杂环化合物, 电电子共轭程度越大，越易产生荧光子共轭程度越大，越易产生荧光; 环越多，环越多，共轭程度越大共轭程度越大, 产生荧光波长越长，发射的产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强荧光强度越强现在学习的是第21页，共61页 0.11 205 278 0.29 286 3100.46 365 400苯苯萘萘蒽蒽 350菲菲线状环结构比非线状结线状环结构比非线状结构的荧光波长长构的荧光波长长现在学习的是第22页，共61页 多环芳烃是重要的环境污染物，可用多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定荧光法测定 3,4 - 苯并苯并芘是强致癌物芘是强致癌物现在学习的是第23页，共61页2. 刚性平面结构刚性平面结构较稳定的平面结构较稳定的平面结构 具有强荧光的分子多数有刚性平面结构具有强荧光的分子多数有刚性平面结构荧光素：氧桥把两个荧光素：氧桥把两个环固定在一个平面上环固定在一个平面上，具有平面结构，强，具有平面结构，强荧光物质荧光物质酚酞：无氧桥把两酚酞：无氧桥把两个环固定，不能很个环固定，不能很好的共平面，为非好的共平面，为非荧光物质荧光物质现在学习的是第24页，共61页例例 1，2 - 二苯乙烯反式：平面构型 强荧光体顺式：非平面构型 非荧光体现在学习的是第25页，共61页（三）取代基的类型（三）取代基的类型 （1 1）增强荧光的取代基）增强荧光的取代基 -OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2等给电子等给电子基团基团 由于基团的由于基团的 n 电子（孤对电子）的电子云电子（孤对电子）的电子云与苯环上的与苯环上的 轨道平行，共享了共轭轨道平行，共享了共轭 电电子，扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧子，扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强度增强光强度增强现在学习的是第26页，共61页（2 2）减弱荧光的取代基）减弱荧光的取代基 -COOH 、 -NO2 、-COOR 、-NO、-SH 吸电子基吸电子基团团, 使荧光波长短移，荧光强度减弱使荧光波长短移，荧光强度减弱 芳环上被芳环上被F、Cl、Br、I 取代后，使系间窜跃加强，磷取代后，使系间窜跃加强，磷光增强，荧光减弱。磷光相应增强，这种效应为重原子光增强，荧光减弱。磷光相应增强，这种效应为重原子效应。效应。（3 3）影响不明显的取代基）影响不明显的取代基 -NH3+、-R、- SO3H等等现在学习的是第27页，共61页三、环境对荧光、磷光的影响三、环境对荧光、磷光的影响 1. 溶剂的影响溶剂的影响 不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质 溶剂的极性增强，荧光波长红移，强度增大溶剂的极性增强，荧光波长红移，强度增大 2. 温度的影响温度的影响低温下测定，提高灵敏度低温下测定，提高灵敏度 因为辐射跃迁的速率基本不随温度变因为辐射跃迁的速率基本不随温度变; 非辐射跃迁随温非辐射跃迁随温度升高显著增大。度升高显著增大。 荧光效率会随溶液温度升高下降，强度减弱。荧光效率会随溶液温度升高下降，强度减弱。 温度对磷光影响更大温度对磷光影响更大现在学习的是第28页，共61页3. pH的影响的影响 大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光性质受溶液的荧光性质受溶液pH的影响很大的影响很大 共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具有各自的荧光效率和荧光波长具有各自的荧光效率和荧光波长OHO_OHH+_例：例： 苯酚苯酚离子化后，离子化后，荧光消失荧光消失pH1有有荧光荧光pH13无荧光无荧光现在学习的是第29页，共61页 但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，分子但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，分子形式无荧光，离子化后显荧光形式无荧光，离子化后显荧光例：例： 苯酚苯酚有荧光有荧光无荧光无荧光另外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性现在学习的是第30页，共61页荧光池荧光强度检测器四、荧光强度与荧光物质浓度的关系四、荧光强度与荧光物质浓度的关系 强度为强度为I0的入射光，照射到浓度很稀的荧光的入射光，照射到浓度很稀的荧光物质时物质时,产生荧光，荧光强度产生荧光，荧光强度If 与入射光强度有与入射光强度有下面的关系：下面的关系：If = f Ia= f （I0 - I ）IIA0lg现在学习的是第31页，共61页! 3)3 . 2(! 2)3 . 2(3 . 2320AAAIIff 当当A0.05时，方括号中其它各项与第一项相比可时，方括号中其它各项与第一项相比可忽略不计，上式简化忽略不计，上式简化 If = 2.3 f I0A =2.3 f I0 bc将上式展开现在学习的是第32页，共61页当当A0.05时，时，现在学习的是第33页，共61页 荧光强度与物质浓度呈线形关系，荧光强度与物质浓度呈线形关系， If=KC 只有在浓度低时使用，荧光物质测定的是只有在浓度低时使用，荧光物质测定的是微量或痕量组分，灵敏度高微量或痕量组分，灵敏度高 浓度高时，浓度高时， If与与C不呈线形关系，不呈线形关系， 有时有时C增大，增大， If反而降低。因为公式反而降低。因为公式 中中后面影响；有时发生荧光猝灭效应后面影响；有时发生荧光猝灭效应现在学习的是第34页，共61页 荧光猝灭荧光猝灭 荧光物质与溶剂或其它物质之间发荧光物质与溶剂或其它物质之间发生化学反应，或发生碰撞后使荧光强度下生化学反应，或发生碰撞后使荧光强度下降降(荧光效率荧光效率 f 下降下降)称为荧光猝灭。称为荧光猝灭。 使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂现在学习的是第35页，共61页 氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是常见的荧光猝灭剂物等都是常见的荧光猝灭剂 碰撞猝灭碰撞猝灭 M + 激激 M* M* + Q M + Q +热热 自熄灭自熄灭荧光物质发射的荧光被荧光荧光物质发射的荧光被荧光物质的基态分子所吸收，即自吸收现象物质的基态分子所吸收，即自吸收现象现在学习的是第36页，共61页（一）荧光分析仪器（一）荧光分析仪器 主要由光源、单色器、样品池、主要由光源、单色器、样品池、检测器和显示器组成。检测器和显示器组成。五、荧光和磷光分析仪器五、荧光和磷光分析仪器现在学习的是第37页，共61页光源第一单色器液池检测器第二单色器检测器放大器及记录器与分光光度计有两点不同与分光光度计有两点不同两个单色器两个单色器检测器与激发光互成直角检测器与激发光互成直角现在学习的是第38页，共61页1、光源、光源 激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽度；适用波长范围宽 荧光计中，常使用卤钨灯作光源荧光计中，常使用卤钨灯作光源 荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯应用最广泛的一种光应用最广泛的一种光源，可发射源，可发射250800nm很强的连续光源很强的连续光源现在学习的是第39页，共61页2、单色器、单色器 荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱于定量分析，不能获得光谱 大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱获得激发光谱，又可获得荧光光谱 第一单色器作用第一单色器作用：分离出所需要的激发光，：分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长选择最佳激发波长 ex 第二单色器作用第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长波长 em。现在学习的是第40页，共61页3、样品池、样品池 盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上边光，只能用手拿棱或最上边4、检测器、检测器 把光信号转化成电信号把光信号转化成电信号, 放大放大, 直接转成荧光强度直接转成荧光强度 荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管光光度计采用光电倍增管 荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因为荧光荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可 大大提高大大提高荧光强度荧光强度5、读出装置、读出装置 扫描激发光谱和发射光谱记录扫描激发光谱和发射光谱记录, 结果打印输出结果打印输出现在学习的是第41页，共61页（二）激发光谱和荧光、磷光光谱 激发光谱：荧光和磷光均为光致发光，合适激发光谱：荧光和磷光均为光致发光，合适的激发光波长需根据激发光谱确定的激发光波长需根据激发光谱确定I固定固定获得方法：固定获得方法：固定I 现在学习的是第42页，共61页I固定固定获得方法：固定获得方法：固定现在学习的是第43页，共61页 磷磷 荧荧 激激图吸收峰荧光峰磷光峰现在学习的是第44页，共61页激发光谱激发光谱和和荧光光谱荧光光谱荧光强度波长（nm)300400500硫酸奎宁的两个光谱Iex,maxfl,max现在学习的是第45页，共61页（三）磷光分析仪器 与荧光分析仪器相似，主要差异如下：与荧光分析仪器相似，主要差异如下：1. 1. 试样室试样室 试样需在液氮温度（试样需在液氮温度（77K，-196）下测定低温磷光）下测定低温磷光（将液池放在盛放液氮的杜瓦瓶内）（将液池放在盛放液氮的杜瓦瓶内） 固体表面室温磷光分析需特制试样室固体表面室温磷光分析需特制试样室2. 2. 磷光镜磷光镜 有些物质既可产生荧光，又能产生磷光。用机械切光装有些物质既可产生荧光，又能产生磷光。用机械切光装置置磷光镜区别荧光和磷光。利用荧光寿命短，磷光磷光镜区别荧光和磷光。利用荧光寿命短，磷光寿命长消除荧光干扰。寿命长消除荧光干扰。现在学习的是第46页，共61页六、 荧光、磷光分析及应用（一）定量分析方法（一）定量分析方法 定量分析依据定量分析依据 If = KC Ip = KC1. 标准曲线法标准曲线法最常用的定量分析方法最常用的定量分析方法浓度浓度 C1 C2 C3 C4 C5 Cx荧光强度荧光强度 If1 If2 If3 If4 If5 IfxxCxC现在学习的是第47页，共61页2. 荧光猝灭法 把荧光猝灭用在定量分析上，具有较高的灵荧光猝灭用在定量分析上，具有较高的灵敏度和选择性敏度和选择性 荧光物质荧光物质 M 与猝灭剂与猝灭剂 Q 生成不发荧光的基生成不发荧光的基态配合物态配合物MQ M + Q = MQ（非荧光物质）（非荧光物质）)()()(QMMQfCCCK现在学习的是第48页，共61页)(1QCKIIf后前猝灭剂加入前的荧光强度猝灭剂加入后试液的荧光强度常数猝灭剂浓度经推导得出：经推导得出：现在学习的是第49页，共61页 标准曲线法标准曲线法现在学习的是第50页，共61页3. 比较法比较简单 如果试样数量不多，可用比较法进行测量如果试样数量不多，可用比较法进行测量 配一标准溶液浓度为配一标准溶液浓度为Cs， Cs与未知液浓度与未知液浓度Cx相近，相近，并在相同条件下测定它们的荧光强度并在相同条件下测定它们的荧光强度 未知液未知液 If x = KCx 标准液标准液 If s = KCs 比较CsCxIIfsfx00ffsffxfsfxIIIICsIICsCx荧光强度减去空白后若有试剂空白，测得的现在学习的是第51页，共61页（二）荧光分析法的应用 荧光分析法具有灵敏度高、取样量少等优点荧光分析法具有灵敏度高、取样量少等优点1. 无机化合物的分析无机化合物的分析 与有机化合物生成发荧光的有机配合物后，与有机化合物生成发荧光的有机配合物后，进行荧光分析的元素达进行荧光分析的元素达70多种，其中较常采多种，其中较常采用荧光法测定的元素有：用荧光法测定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd及某些稀土元素及某些稀土元素现在学习的是第52页，共61页2. 有机化合物的分析有机化合物的分析 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发荧光；可直接用荧光法测定。对多数能发荧光；可直接用荧光法测定。对于具有致癌活性的多环芳烃于具有致癌活性的多环芳烃荧光分析荧光分析法是最主要的测定方法法是最主要的测定方法 为提高测定的灵敏度，有时也将芳香族化为提高测定的灵敏度，有时也将芳香族化合物与适当试剂反应之后进行测定合物与适当试剂反应之后进行测定 可测定结构复杂的大量有机物质，如：各可测定结构复杂的大量有机物质，如：各种维生素、叶绿素、氨基酸、蛋白质、酶种维生素、叶绿素、氨基酸、蛋白质、酶和辅酶以及各种药物、毒物和农药等和辅酶以及各种药物、毒物和农药等现在学习的是第53页，共61页例：3，4 苯并芘 3，4 苯并芘为强致癌物质苯并芘为强致癌物质现在学习的是第54页，共61页例： VB2 又称核黄素，是一种生又称核黄素，是一种生长促进剂，常存在于动物肝长促进剂，常存在于动物肝脏、肉类、蛋黄、豆类、花脏、肉类、蛋黄、豆类、花生、蘑菇和海藻中，生、蘑菇和海藻中， VB2易易溶于强酸或强碱性溶液。溶于强酸或强碱性溶液。 在低浓度情况下，在低浓度情况下，I= KC，I与与C呈线性关系，在呈线性关系，在pH67荧光荧光最强最强 在在430440nm蓝光照射下，发蓝光照射下，发出绿色荧光，出绿色荧光， em = 535 nm下测下测 I ，用标准曲线法测定，用标准曲线法测定缺VB2会得口角炎、舌炎、唇炎、脂溢性皮炎维生素维生素B2现在学习的是第55页，共61页（三）磷光分析法应用 能产生磷光的物质数量很少，磷光分析不能产生磷光的物质数量很少，磷光分析不及荧光分析普遍，但磷光分析法已在药物及荧光分析普遍，但磷光分析法已在药物分析、临床及环境分析领域得到一定的应分析、临床及环境分析领域得到一定的应用。用。 低温磷光分析已应用在萘、蒽、菲、芘、低温磷光分析已应用在萘、蒽、菲、芘、苯并芘等多环芳烃及含苯并芘等多环芳烃及含O、S、N的杂环化的杂环化合物分析合物分析 固体表面室温磷光分析法已成为多环芳烃固体表面室温磷光分析法已成为多环芳烃和杂环化合物的快速、灵敏的分析手段。和杂环化合物的快速、灵敏的分析手段。现在学习的是第56页，共61页 5-3化学发光分析法（自学）现在学习的是第57页，共61页1.分子荧光光谱中，发射光谱与激发波长的关系分子荧光光谱中，发射光谱与激发波长的关系 ，激发光谱与激发光谱的形状，激发光谱与激发光谱的形状_, 并并互为互为_。(北师大北师大2002年年)2.物质分子在吸收光辐射后产生磷光，经历内部转换，物质分子在吸收光辐射后产生磷光，经历内部转换， 和和 三个过程。三个过程。（南开大学（南开大学2002年）年）练习题练习题现在学习的是第58页，共61页3.分子荧光与化学发光均为第一激发态的最低振分子荧光与化学发光均为第一激发态的最低振动能级跃迁至基态中各振动能级产生的光辐射，动能级跃迁至基态中各振动能级产生的光辐射，它们的主要区别在于它们的主要区别在于（ ） A、分子的电子层不同、分子的电子层不同 B、无辐射弛豫的途径不同、无辐射弛豫的途径不同C、产生的光辐射的能源不同、产生的光辐射的能源不同 D、 跃迁至基态中的振动能级不同跃迁至基态中的振动能级不同（南开大学（南开大学2002年）年）现在学习的是第59页，共61页 4.下列那种化合物的荧光量子产率可能最大：下列那种化合物的荧光量子产率可能最大：（ ） (A) (B) (C) (D) （郑州大学（郑州大学2002年）年）CH3CH3现在学习的是第60页，共61页感谢大家观看感谢大家观看现在学习的是第61页，共61页