线粒体与细胞凋亡研究进展(7页).doc

-线粒体与细胞凋亡研究进展-第 7 页·综 述·线粒体与细胞凋亡研究进展曾凯星11.中山大学药学院，广州，510006【摘要】线粒体是细胞凋亡的执行者。当线粒体受到内外环境因素的影响时，会造成线粒体通透性转运孔持续开放，细胞色素C的释放、Caspase蛋白的激活以及活性氧的作用。本文阐述了三者变化的多种机制，同时也论述了Bcl-2家族和AIF因子在凋亡过程中的调节作用机制，为寻找肿瘤靶点提供机遇。【关键词】线粒体；细胞凋亡；线粒体通透性转运孔；细胞色素C；Caspase Study Progress of Mitochondria and ApoptosisKai-xing ZENG11.School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-Sen University, Guangzhou, 51006, ChinaAbstract: Mitochondria are the executors of apoptosis. When the mitochondria are affected internal and external environmental factors, can cause mitochondrial permeability transition pore remain open, release of cytochrome C and activation of Caspase protein. This paper describes the various mechanisms of the three variations, but also discusses the Bcl-2 family and AIF factor regulating mechanism during apoptosis, these mechanisms provides an opportunity to find tumor targets.Keywords: Mitochondria; Cell apoptosis; mitochondrion permeability transition pore; Cytochrome C; Caspase细胞凋亡是集体在生长、发育和受到外来刺激时清除多余、衰老和受损伤的细胞以保持机体内环境平衡和维持正常生理活动过程中的一种基础调节机制。这种调节机制的异常与多种疾病的发生有关，如癌症的发生于细胞凋亡的抑制有关，而老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关。目前对细胞凋亡的研究已经涉及到肿瘤生物学、发育生物学等方面。线粒体是真核细胞赖以生存的产能场所，而近十几年来发现线粒体是调控细胞的重要细胞器。1 线粒体与细胞凋亡目前发现细胞凋亡主要经过三条信号转导通路，一条是外源性通路， 即由死亡受体及配体系统激发的凋亡信号下传，启动 Caspase蛋白酶而引发细胞凋亡1; 另一通路称为内源性通路， 细胞外的某些信号或细胞内DNA的损伤首先引起促凋亡的 Bcl -2 家族成员发生蛋白水解、脱磷酸化等修饰，由无活性状态变为活性状态， 从而由胞浆向线粒体膜移位，使PTP打开、DYm降低等变化， 细胞色素C 等凋亡信号分子进入胞浆， 发挥激活Caspase等的作用， 从而导致凋亡的特征性改变2。；还有一条凋亡通路为内质网通路，其确切机制目前还不十分清楚。前两种通路这两条通路最后都汇集于下游的效应Caspase，即凋亡蛋白酶Casapse的激活。活化Caspase在细胞中能切割400多种，如Laminas、信号分子如蛋白激酶、骨架蛋白、DNA修复酶以及包括调控mRNA剪切、DNA复制的功能蛋白。这些重要蛋白质的降解和核酸酶的激活最终导致细胞凋亡。2 MPTP和DYm对细胞凋亡的作用线粒体通透性转运孔(mitochondrion permeability transition pore， MPTP)是由位于线粒体外膜的电位依赖性阴离子通道( voltage dependent anion channel， VDAC)、线粒体内膜的腺苷酸移位酶 ( adenine nucleotide translocate，ANT)、线粒体基质的环孢菌素A结合蛋白D(cyclophilin D，CypD) 及其他分子构成的一种复合结构，DYm的稳定有密切关系。MPTP是跨越线粒体外膜和内膜的通道，M PTP周期性开放， 以维持线粒体内电化学平衡及稳定状态。多种因素对MPTP具有调节作用，pH下降、环孢菌素A、Mg2 +、磷酸酯酶抑制剂等因素对MPTP的开放具有抑制作用，而pH升高、Ca2 +、无机磷酸盐、过氧化物等因素对MPTP开放具有促进作用。正常情况下MPTP间歇性开放，分子质量小于1.5 ku的物质 ，如质子 、Ca2+、谷胱甘肽等可选择性通过，这些物质对维持线粒体膜电位和Ca2 +平衡具有重要作用。当MPTP持续开放时DYm降低甚至完全崩解，而DYm的崩解是细胞凋亡的特异性早期指标之一。线粒体基质的三羧酸循环酶系通过底物脱氢氧化生成还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( NADH ) 。NADH通过线粒体内膜呼吸链氧化，生产大量的ATP。与此同时，导致跨膜质子移位形成DYm。线粒体内膜上的ATP合成酶利用DYm 能量合成 ATP。DYm的耗散早于核酸酶的激活，也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面。而一旦DYm 耗散，线粒体可释放AIF和细胞色素C，细胞就会进入不可逆的凋亡过程。线粒体解开呼吸链会产生大量活性氧，氧化线粒体内膜上的卵磷脂。线粒体通透性改变( mitochondrial permeability transition , M PT ) 即 P T P 的非特异性 开放。M P T的作用有自我放大的效应。M PT 诱导DYm耗散,而反过来 mClCCP 使 DYm去极化会导致 M PT 。一些 P T P 的结果例如DYm耗散, 活性氧的生成本身也会导致 M P T 。这就说明 M PT 有正反馈, 从而在细胞凋亡中有自我摧毁的作用。反过来, 如果能防止DYm的耗散, 就能避免氧化还原不平衡、磷酯酰丝氨酸的暴露与蛋白酶和核酸酶的激活。然而,某些细胞内细胞色素C的释放可能比DYm早, 说明线粒体释放的细胞色素C可能还依赖于非PT P开放的其他途经，下面会继续讨论细胞色素C的释放途径及作用机理。线粒体的结构、功能与细胞凋亡关系密切, 其中PT P的作用极其重要, 如果线粒体有大量 PTP形成, 细胞ATP浓度很快下降, 则在致凋亡的蛋白酶被活化前细胞就坏死了。而DYm耗散产生的超氧阴离子也导致细胞死亡。3 细胞色素C、Casapse家族以及活性氧对细胞凋亡的作用3.1 细胞色素C细胞色素C不仅可作为呼吸链电子传递的物质，也是调控细胞凋亡的一种主要蛋白。在线粒体损伤后，细胞色素C作为应做传感器被释放到细胞质中，从而引发细胞执行凋亡程序。细胞色素C由2个没有促凋亡活性的前体分子血红素和脱辅基细胞色素C在膜间组装而成，具有促凋亡构象3。目前细胞色素C释放的机制有很多,主要有三种：一是PTP开放导致外膜破裂，释放细胞色素C；二是Bax和Bak等正常情况下能与抑凋亡蛋白分子Bcl-2/ Bcl-xL/Mcl-1相互结合。而仅含BH3结构域的Bcl-2家族促凋亡蛋白tBid、Bim等能与Bcl-2/ Bel-xL/ Mel-l 相互作用，使Bax / Bak等从抑制凋亡蛋白游离，进而形成多聚体，促使线粒体膜通透，导致细胞色素C释放；三是Bax 或 Bak与电压依赖性离子通道VADC结合后，可 以调节线粒体的膜电位，并导致细胞色素C从 Bax / Bak和VDAC 共同形成的大通道释放。细胞色素C释放到胞质后可使细胞凋亡，其主要是通过Caspase发挥凋亡作用4。3.2 Casapse家族Caspase全称为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteine aspartate specific proteinase)。caspase是一组存在于细胞质中具有类似结构的蛋白酶。根据Caspase在凋亡中的作用和 N末端的长度，将其分为2类: 一类为起始型Caspase(initiator Caspase)，另一类为效应型Caspase( effector Caspase) 。前者包括Caspase 8、9、10 等，具有长的N末端，能启动凋亡和调节后者，后者包括Caspase 1、3、6、7等，有短的 N末端，是凋亡的终结者。在线粒体中，有两种Caspase释放及作用机制。Caspase被死亡信号激活后，其激活第二 信使如 Ca2+、Bcl -2、神经酰胺、活性氧等，作用于线粒体，线粒体释放的proCaspase 2、3、9被激活后，又能激活 Caspase3、6、7。激活的Caspase3、6、7 再作用于p38激酶，诱导M PT进一步提高，促进 Caspase 2、3、9的释放，实现死亡信号级联放大，加快细胞凋亡。同样细胞色素 C也能在释放到胞质后，与 Caspase 9结合，激活 Caspase 9再激活Caspase 3，从而激活 Caspase 级联反应， 使细胞凋亡。参与凋亡的Caspase 9、Caspase 2 也是从线粒体中释放的5。3.3 活性氧（ROS）ROS对线粒体的影响在线粒体中，ROS的产生与细胞色素C的释放是一个相互促进的过程 细胞色素C是呼吸链中传递电子的重要载体 在凋亡初期，细胞色素C从线粒体释放入胞浆，线粒体内的细胞色素C减少，使得线粒体中一些电子不能被及时传递并从呼吸链中逃逸出来，与O2 作用产生O2，大量的O2进一步转变为其它ROS8同时，大量的ROS不仅会损伤缺乏组蛋白保护的线粒体DNA( mtDNA) 引起凋亡，而且会引起脂质体过氧化破坏线粒体膜，使膜的流动性降低线粒体内外膜蛋白过氧化，蛋白质交联，造成线粒体通透性改变( MPTP) MPTP又具有自我放大效应，诱导细胞内线粒体跨膜电位( m) 耗散，使线粒体释放细胞色素C 细胞色素C自线粒体释放后与Apaf21及caspase29共同组 成了凋亡体，又称为诱导死亡信号复合体( DISC)，当Apaf21与细胞色素C dATP /ATP结合后便可经募集区活化caspase2、9，再作用于其下游靶标 caspase2、3酶原，活化的caspase2、3作为效应子作用于不同的靶细胞，经蛋白水解作用导致细胞凋亡6。ROS与JNK介导的细胞凋亡途径: ROS对c-jun氨基端激酶( JNK) 的激活作用能诱发外在或内在的细胞凋亡信号JNK的上游是对氧化还原反应敏感的MAPKKK，ASK1 氧化还原蛋白( Grx，Trx1) ， 热休克蛋白( Hsp90，Hsp72) ， 14-3-3能抑制ASK1的活性，而TRAF蛋白Daxx JASP/JIP3 ASK1相关蛋白则能激活ASK1，ASK1-JNK信号通路在TNFR1介导的细胞凋亡信号转导过程中具有重要作用 TNF- 产生抗凋亡还是促凋亡作用依赖于被ROS激活的JNK的浓度和作用时间 JNK短暂少量的激活能够促使NF-B介导的抗凋亡基因的表达并使细胞存活，而JNK持续大量的激活与ASK1信号途径所介导的细胞凋亡有关 因此理论上讲，如果能够控制JNK的激活程度与持续时间，就能使特异性靶细胞存活或死亡，这为肿瘤的治疗提供了新思路。图1 ROS对线粒体的影响7图1是目前对ROS通过ASK1/JNK信号途径介导细胞凋亡理解的总结 这一模型提出ROS能够介导Trx1和ASK1氨基端结构域的相互作用，阻止ASK1的激活以及下游凋亡信号的传递 只有当Trx1与ASK1的结合减少时，Trx1/ASK1复合物( 被称作ASK1信号体) 才起到氧化还原开关的作用，能够在氧化条件下感知细胞内的ROS浓度并被激活 细胞内高浓度的ROS能诱导被氧化的Trx1从复合体上解离下来，并使ASK1通过氨基末端结构域的卷曲螺旋实现寡聚化使其具有完整的ASK1蛋白激酶活性有功能的ASK1信号复合体的形成需要TRAF2/6的募集，这一过程会加速ASK1的自磷酸化和JNK的激活 ASK2是ASK家族的另一个成员，它在细胞质细胞核以及线粒体中均能与ASK1结合并使其稳定，这个过程无论在调节ASK1/JNK信号通路还是细胞凋亡过程中都具有重要作用。4 凋亡调节因子与细胞凋亡4.1 Bcl-2家族Bcl-2、Bcl-xL等细胞凋亡负调因子在许多类型的细胞受到外界刺激时能保护细胞免于凋亡。它们主要定位在核膜的胞质面、内质网及线粒体外膜上。其疏水性C末端定位于细胞内膜系统上，而N末端朝向细胞质。与膜的结合对 于其发挥功能是极其重要的。实验表明,失去膜定位能力的Bcl-2蛋白的抗凋亡能力减弱了许多8,9。BH4结构域是Bcl-2等抗凋亡蛋白所特有的(Bcl-xL除外)。虽然BH4不是形成二聚体所必需的区域,但它的缺失或使蛋白质丧失功能,或产生一个促凋亡而 不是抗凋亡的突变体10。这说明BH4对Bcl-2或Bcl-xL发挥其抗凋亡功能是必需的。线粒体膜上的Bcl-2至少在三个水平上发挥功能来抑制凋亡:主要通过与Bax/Bak 相互作用来抑制细胞凋 亡; Bax是一种可溶性的蛋白分子,主要位于细胞质中，但当凋亡发生时它能从胞浆转移到线粒体并与线粒体膜相结11。实验证明,位于线粒体膜上的Bcl-2能与Bax相互作用,而后者也必须在线粒体上才能发挥其诱导凋亡的作用。同时把微量的重组Ba x加入到分离的线粒体 中能够诱导细胞色素C 的释放和Caspase激活,而只 含有Bax的BH3结构域的多肽则没有这种功能。Bax与Bcl-2相反,能促进 P T P 开放,并促进线粒体促凋 亡 因子的释放,Ba x的促凋亡作用 能被Bcl-2所抑制。并且,只有定位于线粒体上的Bcl-2和Bcl-xL才能拮抗 Ba x蛋白和阻止细胞色素C 释放、Caspase激活和凋亡,Bcl-2对DYm则无此功能（2）Bcl-2 能改变线粒体琉基的氧化还原状态来调控线粒体膜电位从而调控细胞凋亡。在细胞凋亡过程中,线粒体的琉基可能组成了胞内氧化还原电位的传感器,Bcl-2可能是通过抑制谷胱甘肽 (GSH)的外泄,降低胞内的氧化还原电位来抑制细胞凋亡的;(3) Bcl-2能通过 抑制PTP开放来抑制促凋亡蛋白从线粒体中释放,从而保护细 胞免于凋亡;有证据显示,Bcl-2还能将凋亡蛋白前体APaf-1等定位至线粒体膜上,使其不能发挥促凋亡作用。4.2 凋亡诱导因子( AIF) 与细胞凋亡凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor , AIF)是一种分子质量大小为57 ku的双功能黄素蛋白，位于线粒体的双层膜间区 , 具有电子供体/ 受体功能。AIF在诱导凋亡的同时会激发线粒体膜通透性的改变 , 诱导线粒体释放细胞色素C和 Caspase 9 , 促进细胞凋亡。当凋亡被诱导后, AIF从线粒体中释放出来 , 获能后直接进入细胞核内,独立地将染色质降解60ku左右的片段, 引起染色质凝缩与片段化。与其它细胞死亡模式不同, 显微注射 A I F 抗体可抑制细胞色素C的释放和 Caspase 的级联反应, 然而细胞色素C和Caspase抑制 剂并不能影响AIF的释放, 可 见AIF在细胞色素C/ Caspase凋亡途径上游发挥了促凋亡作用 , 而且也不依赖于 Caspase 和细胞色素C凋亡体。 线粒体膜上的 Bal - 2 家族控制着线粒体MPTP的大小 , 能阻止AIF的释放, 但不影响AIF的活性。此外, AIF还可反馈放大MPTP 的渗透性, 诱导线粒体释放细胞色素C等凋亡蛋白, 促进细胞凋亡。AIF自身并不具有核酸内切酶活性, 许多研究结果表明 , AIF可能与EndoG或其他核酸内切酶协同作用 , 但这一机制还需要进一步研究 。5 结语线粒体在细胞凋亡中起最基本的用 , 是凋亡的执行者。它受到外部因素如Ca2+、Caspase、PH下降等刺激后，发生MPTP打开以及DYm耗散的现象后，导致细胞色素C的释放以及下游的Caspase的激活。除了MPTP打开的原因外，细胞色素C有多种释放机制；同时Caspase也有其他与线粒体有关的激活机制，而且活性氧也在其中参与了细胞凋亡。同时Bcl-2家族与AIF起到了调节细胞凋亡的作用。而本文除了论述MPTP到细胞色素C，再到Caspase这条导致细胞凋亡这一条主要途径外，还阐述了其它与线粒体的作用机制和Caspase的凋亡机制。细胞凋亡与肿瘤发生密切相关，而大量细胞凋亡机制与线粒体有关，所以对这一机制的研究有助于寻找抗肿瘤靶点，促进肿瘤细胞的凋亡。References:1. 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