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土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及其淀粉 酶活力的测定 姓名：李青嵘 班级：生工 102 学号： 1014200044 同组组员：黄得凤 同组组员：张旭霞 摘要 本实验通过 90水浴 20min 预处理，杀死无芽孢菌体，再以弱选择性淀粉 培养基和稀释涂布平板法对土壤中产淀粉酶芽孢杆菌进行初步筛选，又通过分 区划线法对初筛菌株进一步分离纯化，得到两株纯培养的芽孢杆菌。并通过耐 盐试验、明胶试验、糖发酵试验、VP 试验、吲哚试验，等多项生理生化实验对 筛选出来的菌种进行鉴定，鉴定结果均为蜂房芽孢杆菌。进一步通过3，5-二硝 基水杨酸显色法对菌种的淀粉酶活力进行鉴定，测定结果分别为 10.68MMU ，12.64MMU 。 关键词： 淀粉酶，芽孢杆菌，酶活测定 1. 前言 淀粉酶是催化淀粉水解的一类酶的总称，广泛存在于动物、植物和微生物 中。目前淀粉酶广泛应用多种领域，在发酵工业中淀粉酶可用于淀粉原料的液 化及糖化工艺；在食品工业中淀粉酶可用于面包焙烤，使其体积更大，颜色更 好，颗粒更柔软；在农业中淀粉酶可作为饲料添加剂，降解饲料中淀粉营养成 分以利于动物吸收利用；此外，淀粉酶在医疗卫生、废料处理、纺织印染等领 域都有广泛应用。 目前生产应用的淀粉酶主要来源于微生物，并集中在几种细菌和真菌中， 尤其以芽孢杆菌所产的淀粉酶较多。其原因首先芽孢杆菌属(Bacillus)中能产生 淀粉酶的菌种较多；其次，芽孢杆菌属产的淀粉酶有较好的应用价值，如凝结 芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌产的淀粉酶具有耐热 性；再次，芽孢杆菌应用历史悠久，广泛用于饲料添加剂，其安全性有保证。 本文主要从土壤中筛选产淀粉酶的芽孢杆菌，分离纯化，并进行酶活测定，从 而获得有经济价值比较高的菌株。 2. 材料与方法 2.1. 实验材料 2.1.1. 土样的采集 从广州大学 B-8门前采集土样？ g，每天加入 2 g淀粉和 10 ml水进行培养 5天。 2.1.2. 培养基 2.1.2.1. 筛选及活化培养基 1 淀粉20 g，蛋白胨 10 g，NaCl 2.5 g，琼脂 10 g，自来水 1000 ml, pH 自然。 2.1.2.2. 斜面种子培养基 2 牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，琼脂 1520 g，自来水 1000 ml，pH 7.27.4； 2.1.2.3. 摇瓶发酵培养基 3 称取可溶性淀粉 2 g，蛋白胨 1 g，牛肉膏 03 g，氯化钠 05 g溶于100 mL 蒸馏水中。 pH自然； 2.1.2.4. 蛋白胨液体培养基（作吲哚实验用） 2 蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，自来水 1000 ml，pH 7.27.4，121 灭菌20 min； 2.1.2.5. 葡萄糖蛋白胨培养基（ VP 和 MR 试验用） 2 蛋白胨 5 g，葡萄糖 5 g，NaCl 5 g，自来水 1000 ml，pH 7.27.4，121 灭 菌20 min； 2.1.2.6. 糖发酵培养基（作细菌糖发酵试验用） 2 蛋白胨 2 g，NaCl 5 g，K2HPO4 0.2 g，1%溴麝香草酚蓝水溶液 3 ml，待试 糖10 g(一般糖或醇按 1 % 量加入，而半乳糖、乳糖按1.5 % 的量加入 )，自来水 1000 ml，pH 7.27.4； 2.1.2.7. 酪氨酸平板（作酪氨酸水解试验用） L酪氨酸 0.5g悬浮于 10mL蒸馏水中， 20分钟灭菌，然后于 100mL无菌的营 养琼脂混合，即成酪氨酸水解平板； 2.1.2.8. 酪素平板（作酪素水解试验用） 取5g脱脂奶粉加入 50mL蒸馏水中（或用 50mL脱脂牛奶），另称 1.5g琼脂溶 于50mL蒸馏水中，将两液分开灭菌。待冷至4550时，将两液混匀倒平板， 即成牛奶平板； 2.1.2.9. 西蒙斯氏柠檬酸盐培养液（作柠檬酸盐利用试验用） 2 柠檬酸钠 2 g，NaCl 5 g，MgSO47H20 0.2 g, K2HPO43H20 1 g,(NH4) 2HPO4 1 g, 1%溴麝香草酚蓝水溶液 10 ml，琼脂 1520 g，自来水 1000 ml，pH 7.0 , 121 灭菌20 min； 2.1.2.10.淀粉牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 2 可溶性淀粉 2 g，牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，琼脂 1520 g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.27.4； 2.1.2.11.（2%、5%、7%）高盐培养基 2 牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl（2g、5g、7g），琼脂 1520 g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.27.4； 2.1.2.12.明胶培养基 牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，明胶 12g，蒸馏水 1000 mL ，pH 7.0； 2.1.2.13.半固体培养基（作运动性实验用） 琼脂含量 0.5%，其他组分比例按牛肉膏蛋白胨培养基配制； 2.1.3. 试剂和仪器 2.1.3.1. 碘原液：碘 1lg，碘化钾 22g，加水定容至 50OmL； 2.1.3.2. 单染色：草酸铵结晶紫或石炭酸复红； 2.1.3.3. 革兰氏染色：草酸铵结晶紫染色液，卢戈氏碘液，95%乙醇， 0.5%沙黄 染色液。 2.1.3.4. 芽孢染色： 5%孔雀绿染色液， 0.5%沙黄染色液。 2.1.3.5. V.P 试验： 40%NaOH 溶液， -奈酚。 2.1.3.6. 吲哚试验：乙醚，吲哚试剂。 2.1.3.7. 硝酸盐试验：甲液（对氨基苯磺酸0.8g+5mol/L 醋酸 100mL；乙液 （-奈胺 0.5g + 5mol/醋酸 100mL）； 2.1.3.8. 酪素水解：牛奶； 2.1.3.9. 酪氨酸水解： L-酪氨酸； 2.1.3.10.淀粉酶活力测定： 1% 3,5-二硝基水杨酸试剂。 2.1.4. 仪器： 无菌培养皿，接种环，土样，三角瓶，烧杯，试管，酒精灯，无菌吸管， 载玻片，吸水纸等。恒温摇床，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌箱，超净工作台， 水浴箱，磁力搅拌器，涂布器，显微镜，移液管，移液枪。 2.2. 实验方法 2.2.1. 初筛 2.2.1.1. 制菌悬液： 取五份土样各 25 g，分别加入装有 225mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，用摇 床振动打散，制成 10-1的土壤悬液，并置于恒温水浴装置80 水浴，水浴锅温 度恒定后维持 20 min，以杀死无芽孢的细菌； 2.2.1.2. 梯度稀释菌悬液： 分别取装有 9 ml 无菌水的试管 6支，编号。取已制成菌悬液的10-1的土壤悬 液，振荡静置 30 s，用移液器吸取 1mL土壤原液加入 10-2的无菌水试管中，吹打 35次，充分混匀，即成 10-2土壤稀释液。同法用移液器从 10-2的试管中吸取 1mL稀释液加入编号为 10-3的试管中，混匀制成土壤液，依次连续稀释为 10- 4、10-5的土壤悬液液； 2.2.1.3. 涂布 2： 用无菌移液器从各浓度的土壤稀释液取50 uL于筛选培养基平板上，用无菌 玻璃涂棒涂布，充分涂布均匀。每个浓度2个平板，一个空白对照，并将接种完 成后的平板置于 37恒温箱，倒置培养 24h； 2.2.1.4. 筛选： 从各个土壤悬液稀释度的涂布平板上挑取直径较大的单菌落，10个，于新 的筛选培养基中进行分区划线； 2.2.2. 纯化及复筛 2.2.2.1. 分区划线接种 2： 用接种环挑取 10个较大菌落于筛选培养基中进行分区划线，先在平板的一 边作第 1次平行划线 34条，在转动培养皿约 60。角，并将接种环上剩余物烧掉， 待冷却后通过第 1次划线部分作第 2次平行划线，再用同法通过第2次平行划线部 分作第 3次平行划线和通过第 3次平行划线部分作第 4次平行划线。划线结束后， 盖上皿盖，倒置在 37 下恒温培养 24 h。 2.2.2.2. 单染色 2 涂片、干燥及固定；初染：在涂有菌种的载玻片上滴加适量的草酸铵结晶 紫染色液或石炭酸复红液，染1 min，倾去染液，用水冲洗至无染色液颜色为止。 镜检：用油镜观察染色结果； 2.2.2.3. 芽孢染色 2 涂布、干燥及固定；加染色液：于涂片上加入23滴5%孔雀绿水溶液；加 热：用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，边加热边滴加染色液，自载玻 片上出现蒸汽时，开始计时，约4 min；脱色：倾去染液，待玻片冷却后，水洗 至孔雀绿不再褪色为止；复染：滴加沙黄染色液，染23 min，水洗；镜检： 用油镜观察染色结果。 2.2.3. 淀粉水解实验 2 对通过单染色和芽孢染色的镜检得到的纯培养的芽孢杆菌进行淀粉水解实 验，并从中筛选出水解圈较大的6株菌作为目的菌，进行后续实验。具体步骤如 下：挑取菌种，采用点解法接种于可溶性淀粉培养基中，每两种菌做一个平板， 并做一次平行实验和空白对照组。将接种完成的平板置于37恒温箱中倒置培 养24h。 2.2.4. 斜面保种 2： 取各种无菌牛肉膏蛋白胨斜面培养基数支，贴上标有菌株名称和接种日期 的标签，每种菌接 3管，用接种环挑取单菌落进行斜面接种，加塞，包扎好后在 37 下恒温培养 24 h，再放入冰箱 4暂存备用； 2.2.5. 生理生化试验鉴定 2.2.5.1. 革兰氏染色实验 2 从各纯培养的平板中挑取菌种于载玻片上，滴加无菌生理盐水，涂片、干 燥及固定；初染：在涂有菌种的载玻片上滴加适量的草酸铵结晶紫染色液，染1 min，倾去染液，用水冲洗至无染色液颜色为止；媒染：滴加卢戈氏碘液，染 12 min，水洗；脱色：滴加 95%乙醇，将玻片摇晃几下倾去乙醇，重复23次， 立即水洗；复染：滴加沙黄染色液，染23 min，水洗；镜检：用油镜观察染 色结果。 2.2.5.2. 糖发酵实验（葡萄糖） 2 用接种环将各种杆菌分别接种于葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇的发酵 管内，每种发酵管重复两次，标记，并设置空白组作为对照（注意接种的整个 过程中不能认为的制造气泡），接种完后，每一管外包一层无菌纸，以防污染， 将全部发酵管倒置于小烧杯内，37培养 24h。 观察记录，与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴 性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“” 表示，若培养液呈黄色，反应结 果为阴性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“+”表示。培养液的杜氏小管 内有气泡为阴性反应，表明该菌分解糖能产酸产气，记录用“+”表示，如杜氏 小管内没有气泡为阴性反应，记录用“” 表示。 2.2.5.3.乙酰甲基甲醇实验（ V.P 试验） 2 取葡萄糖蛋白胨培养液的试管，编号，以无菌操作分别接种少量菌苔至以 上相应试管中，空白对照管不接菌，置37恒温箱中，培养二十四小时，培养 完后，取出上述试管充分震荡2min每管分别加入 40%NaOH溶液1020滴，并加 萘酚，振荡试管以使空气中的氧融入，置37温箱中保温 15-30min后，若培 养基呈红色，记录为 V.P试验阳性反应（ +）表示，若不呈红色，记录为V.P试验 阴性反应（用 “-”）表示。 2.2.5.4.吲哚试验 2 取装有蛋白胨水培养液的试管编号，以无菌操作分别接种少量菌苔到以上 相应试管中，并做空白对照，置37培养箱中 24h，在培养液中加入乙醚 1- 2ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面， 此时沿管壁缓慢加入 5-10滴吲哚试剂，如有吲哚存在，乙醚层呈玫瑰红色，说 明吲哚试验为阳性反应，否则为阴性反应。 2.2.5.5.耐盐试验 2 将分离获得的菌种分别接种在2%、5%、7%的高盐培养基中，设置一组对 照，一组平行实验组，并置于37下培养，观察生长状况，并做记录。记录方 式如下：不生长： ，生长差： +，生长一般： +，生长良好： +； 2.2.5.6. 柠檬酸盐利用试验 2 取若干装有西蒙斯柠檬酸盐培养基的试管，将菌种接入试管，置于37恒 温箱中培养 2448h。若培养基为蓝色，则表明能利用柠檬酸盐作为碳源生长， 以“+”表示。若培养基为绿色则为阴性，以“” 表示。 2.2.5.7. 明胶试验 5 挑取菌种，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于平板培养基。 于2022培养 714天。每天观察结果，若因培养温度高而使明胶本身液化时， 应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化，如确被液化， 即为试验阳性，以 “+”表示。平板试验结果的观察为在培养基平板点种的菌落 上滴加试剂，若为阳性，1020min后，菌落周围应出现清晰带环。否则为阴性。 2.2.5.8. 硝酸盐还原试验 5 被检菌接种于硝酸盐培养基中，于35培养 l4d.将甲、乙液等量混合后 （约0.1 mL）加入培养基内，立即观察结果。 结果：出现红色为阳性。若加入试剂后无颜色反应，可能是：硝酸盐没 有被还原，试验阴性；硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而导致假阴性结果， 这时应在试管内加入少许锌粉，如出现红色则表明试验确实为阴性。若仍不产 生红色，表示试验为假阴性。若要检查是否有氮气产生，可在培养基管内加一 小倒管，如有气泡产生，表示有氮气生成。 2.2.5.9. 酪素水解试验 5 取牛奶平板，将菌种划线接在平板上，每皿1株菌。设置一组对照，一组平 行实验组，并置于 37恒温箱培养，记录菌落周围和下面酪素是否已被分解而 呈透明。 2.2.5.10.酪氨酸水解 5 取酪氨酸平板，将测试菌接种于划线接于培养基上，设置一组对照，一组 平行实验组，并置于 37恒温箱培养，记录酪氨酸结晶是否被水解而变透明。 2.2.5.11.鞭毛穿刺试验 2 取装有半固体培养基的试管，使用穿刺法接种待测菌，37培养 24h，观察 穿刺线形态，若是会运动的细菌，培养基中的穿刺线呈云雾状，但是如果是需 氧型的话会在培养基表面上形成一薄膜；若是不会运动的细菌，培养基中的穿 刺线很清晰。 2.2.5.12.鉴定 6 根据从伯杰式细菌学手册芽孢杆菌属中检索到的芽孢杆菌的生理生化特点， 选取能从土壤中分离到的芽孢杆菌种为标准菌种，其生理生化指标如下表： 通过对目的菌种进行多项生理生化实验，对比伯杰式手册的实验结果，从 而鉴定出目的菌的种别； 2.2.6. 产淀粉酶芽孢杆菌淀粉酶活性的测定（3，5-二硝基水杨酸显色法） 1 2.2.6.1. 粗酶液制备： 以一环菌种接种于发酵培养基中，摇床培养，160 rpm/min , 37 ，48 h。4000 rpm/min 离心 20 min，收集上清液即为待测粗酶液。 2.2.6.2. 1mg/mL 标准麦芽糖的制备： 准确称取 100mg 麦芽糖，用蒸馏水准确定容到100mL； 2.2.6.3. 3，5-二硝基水杨酸试剂的制备： 准确称取 3，5-二硝基水杨酸 1g，溶于 20mL 2mol/L NaOH 溶液中，加入 50mL 蒸馏水，再加入 30g 酒石酸钾钠，待溶解后，用蒸馏水定容到100mL， 盖紧瓶塞，备用； 2.2.6.4. 0.1mol/L Ph5.6 的柠檬酸缓冲液的制备 准确称取 4.62g 柠檬酸和 17.05g柠檬酸钠，用蒸馏水定容至800mL； 2.2.7. 1%淀粉溶液的制备 准确称取 1g 淀粉于 100mL 0.1mol/L Ph5.6 的柠檬酸缓冲液中； 2.2.8. 标准曲线的绘制 标准样液配制按上表配制完成，摇匀，置沸水浴中煮沸10 min。取出后流 水冷却，加蒸馏水定容至20 ml。以一号管作为空白对照管，520 nm比色测定 吸光度。以麦芽糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。 2.2.9. 测定 取10 ml 具塞刻度试管，预先洁净灭菌干燥、编号。按下表配制溶液，定 容后，摇匀，用分光光度计测定OD在520 nm的值。 2.2.10.计算 根据测到的 OD值，在标准曲线中找到相应的麦芽糖量，并在上述条件下以 单位体积样品在 30 min释放1 mg麦芽糖所需的酶量为一个麦芽糖单位（MMU ） 酶活力，按下式计算出淀粉酶的活力。 淀粉酶活力 =麦芽糖释放量（ mg）6稀释倍数 3.结果与分析 3.1.菌株的初筛 通过90水浴 20min分别对 2分土样进行预处理，杀死无芽孢菌体，再以弱 选择性淀粉培养基和稀释涂布平板法对土壤中产淀粉酶芽孢杆菌进行初步筛选， 获得12株菌，并分别点接于淀粉平板中，进行淀粉水解测定，最后挑取了3株淀 粉水解圈较大的菌株，进行分离纯化。 3.2.菌株的复筛 分别通过 3次分区划线，分离纯化初筛所得到的3株菌，经单染色镜鉴，鉴 定为纯培养；经芽孢染色镜鉴，观察到3号菌芽孢端生， 1、2号菌芽孢中生，均 为芽孢杆菌；经淀粉水解试验，发现3号菌几乎没有水解圈， 1、2号菌有水解圈。 采用斜面包藏法保存 1、2号菌株于斜面试管中，置于冰箱保种。 图1 淀粉水解试验图2 1号纯培养 图3 1号单染色图4 2号单染色 3.3.菌株的鉴定 通过革兰氏染色、运动性试验、耐盐试验、温度试验、柠檬酸盐试验、硝 酸盐还原试验、酪氨酸水解试验、酪素水解试验、糖发酵试验、VP试验、吲哚 试验、明胶水解试验等生理生化实验，对筛选得到的菌种进行鉴定。 各项生理生化实验结果如下表： 按照伯杰式细菌学手册的检索样式，对实验原始数据进行整理，整理结果 如下： 对照伯杰式细菌学手册，与芽孢杆菌属，蜂房芽孢杆菌的各项生理生化指 标完全吻合，且 1、2号菌生理生化鉴定结果相同。综上所述，鉴定结果为： 1、2号菌均为蜂房芽孢杆菌。 3.4.淀粉酶活力的测定 3.4.1. 麦芽糖标准曲线 公式： Y=0.2915X；R 2=0.9943 3.4.2. 淀粉酶活力 4.讨论 4.1.菌株的筛选 本实验通过 90水浴 20min 预处理，杀死无芽孢菌体，再以弱选择性淀粉 培养基和稀释涂布平板法对土壤中产淀粉酶芽孢杆菌进行初步筛选，又通过分 区划线法对初筛菌株进一步分离纯化，得到纯培养。对比同班同学的其他筛选 方案，如先获得纯培养，再筛选产淀粉酶的菌株等，本实验方案的实行效率更 高，操作也较为简单。 4.2.生理生化鉴定 本次实验通过多项生理生化试验鉴定菌种，在实验过程中，由于缺乏经验， 操作不熟练，通常导致实验结果不稳定，甚至是错误。例如，糖发酵试验，我 们对培养了 24h 的糖发酵管进行观察，没发现现象，便将其倒掉，而不是继续 培养观察，还有其他几项生理生化试验也是如此，后来在对照伯杰式细菌学手 册时，发现没有相吻合的菌种，最后才通过从新实验，获得真实数据。 4.3.酶活力测定 本次实验在酶活力的测定过程中，标准曲线的制作存在较大的误差，主要 原因有一下几点：首先，是标准曲线制作的方法不标准，大多是来源于豆丁网 的文档；其次，操作不规范，包括移液器的使用，分光光度计的操作等；最后 是，仪器的误差。 4.4.实验心得 本次综合实验收获很多，主要是在理论知识，实验技能，团队合作三个方 面提升较大。 在理论知识方面，我们的收获主要是对理论课上学到的知识，通过实践更 加深化地进行理解，加深印象，以及对一些实验的细节知识的学习。例如：对 紫外杀菌，高压蒸汽灭菌，干热灭菌，的工作原理更加深刻的理解，通过实验， 对划线分离，涂布稀释的分离纯化的方法有更加形象的认识。 在实验技能方面，我们的收获主要是加强了基本的实验操作技能，以及优 化实验进行的先后顺序。基本的实验操作技能主要包括：配制培养基和无菌操 作。表面上看，这些基本实验技能都相对容易，但是实际操作起来却是比较难 的，例如配制培养基用时过长，无菌操作划线或涂布时划破培养基，染菌，以 及由于操作不熟练，经常出现的被酒精灯烫伤，打翻培养皿等情况。但通过这 段时间的练习已经能熟练进行实验操作。优化实验进行的先后顺序有利于我们 节省实验操作的时间，提高实验效率。综合实验前期，由于缺乏经验，时间安 排不合理，经常导致实验时间过长，实验结果也比较不理想。但经过这次综合 实验，我们懂得了，灭菌的时候可以先去吃饭，明天要用的平板可以今天先倒 好，于培养箱空培过夜，这样既可以减少冷凝水产生，又可以增强凝固程度。 在团队合作方面，我们的收获主要是分工明确，加强组员之间的讨论交流， 分享经验。在综合实验之前，我们组员之间没有合作过实验，日常交流也比较 少。通过这次综合实验，我们组员之间一起讨论方案，一起完成实验，尤其到 了综合实验的后期，已经可以形成一种队友之间的默契，有时候自己想要一个 试剂或者是器材之类的，其他组员会主动取来我想要的东西。 参考文献 1. 唐丽江，王振华，王迪高产淀粉酶芽孢杆菌菌株的筛选J安徽农业科 学，200937，(12)：53625363 2. 周德庆，胡宝龙，祖若夫，等微生物实验教程（第二版）高等教育出版 社2006：3237，52，128131，205，220225，372373 3. 徐琛产淀粉酶芽孢杆菌的筛选和分离J齐鲁师范学院学报， 2011，26， （5） 4. 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