荧光探针定量PCR技术原理及应用(24页).doc

-荧光探针定量PCR技术原理及应用-第 23 页荧光探针定量PCR技术原理及应用      PCR技术是通过对基因的选择性片段进行体外高效扩增，实现目的基因的检测。荧光探针定量PCR（FQ-PCR）是一种新的基因定量检测技术，国外文献多用“实时定量PCR（real time quantitative PCR）”或“TaqMan PCR(以美国PE公司商标命名) ”。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针，巧妙地把核酸扩增（PCR）、杂交及光谱技术结合在一起，从而实现了对目的基因的准确定量检测，正发展成为临床实验诊断的常规技术。1.原理      FQ-PCR的工作原理1-3是利用Taq酶的5 3外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记的探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5端标以荧光报告基团FAM（6-羧基荧光素，荧光发射峰值在518mm处），靠近3端标以荧光淬灭基团TAMRA(6-羧基四甲基诺丹明,荧光发射峰值在582nm处)，两者之间构成能量传递结构。当探针保持完整时，5端荧光报告基团所激发出的荧光信号被3端淬灭基因吸收或抑制，不出现荧光信号变化。当PCR反应体系中有目的基因存在，就会扩增出特异核酸片段，荧光探针即会根据碱基配对的原理与之杂交。当PCR进入延伸（复制）期，Tap酶从引物3端开始,随新链延伸沿DNA模板移动，当移动到探针结合的位置时，其5 3端外切酶活性作用，将探针切断（切口平移效应）。荧光报告基团和淬灭基团间的能量传递结构被破坏，淬灭基团的淬灭作用被解除，荧光报告基团的荧光信号释放出来（图1）。PCR反应每复制一个特异核酸片段，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PRC产物是一对一的关系，因此用荧光检测技术检测出的荧光信号有无或强弱，即代表扩增产物有无或多少。由于荧光信号是代表扩增产物的有效特异信号，无需进行有效和无效信号分离，实现了仪器实时检测(图2)，为新的PCR定量原理创造了条件。图1.TaqMan PCR反应模式 （A）聚合反应：（B）链置换；（C）裂解； （D）聚合完成（R：FAM；Q：TAMRA；FP：上游引物；RP：下游引物）      ABI公司首先根据上述原理研制了ABI 7700 等系列定量PCR仪，在PCR反应中设置标准模板系列（一般57个标准浓度）反应管和空白对照管。通过实时检测反应管中的荧光信号，计算出RQ+、RQ-、RQ。RQ+代表样品管荧光报告基团发光强度与淬灭基团发光强度的比率，RQ-代表空白管中二者的比率，RQ（RQ = RQ+-RQ-）代表PCR过程中荧光信号变化量。当荧光信号增强到某一阈值（根据荧光信号基线的平均值和标准差，计算出以99.7%的置信度大于平均值作为阈值）时，标准模板反应管所用的循环次数（Ct值）就被记录下来。Ct值与标准模板数量的对数值之间有严格的线性关系3，利用系列标准模板的Ct值，制成标准曲线(图3)，根据待测样品的Ct值，就可在标准曲线中确定待测样品起始的DNA数量。根据数据处理，即可得出定量结果。探针设计一般应符合以下条件2：探针长度应在2040个碱基左右，以保证结合的特异性。GC碱基含量在40%60%，避免单核苷酸序列的重复。避免与引物发生杂交或重叠。探针与模板结合的稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5。另外，探针的浓度，探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响。图3.FQ-PCR 标准曲线 2. 技术特点2.1 封闭状态下检测，避免了扩增产物污染而致的假阳性      传统PCR于反应结束后取出反应液，通过电泳染色和紫外仪观察结果。扩增产物在开放状态下分析，对实险室的污染是不可避免的。因污染而导致假阳性，成为PCR临床实验诊断技术应用一个难以逾越的障碍。FQ-PCR在全封闭状态下实现PCR扩增和产物分析，完全杜绝了扩增产物污染而导致的假阳性。至于样品间的污染，无论从目的基因的数量、浓度还是颗粒大小分析，都比较容易控制。我国PCR临床应用出现问题，产物污染所致假阳性是主要原因之一。 2.2 基因的定量检测，扩展了临床应用空间     传统PCR对基因的检测只能定性，不能定量主要是由扩增产物积累的动力学所决定的：PCR产物在扩增过程中呈指数积累，当产物增加到一定程度，产物就停止了指数积累。不同起始模板，其指数增长期所用的循环是不同的，因此，不同数量基因的样品在同一循环次数中积累的产物不能作为样品基因定量的依据；PCR产物积累到一定程度就不能再增加，再进入平台期。为了扩大PCR检出的灵敏度通常要增加循环次数，循环次数增加使得样品目的基因含量高的反应管已进入平台期，终产物量并不代表样品目的基因含量；PCR反应的管间扩增效率差异总是存在的，既然PCR产物呈指数增长，由扩增效率差异引起的产物扩增差异也呈指数积累，增加循环次数势必增加终产物的差异，而减少循环次数又降低了检测的灵敏度。FQ-PCR采用实时检测，使所有含有不同数量的目的基因均在同一条件（达到荧光阈值）下进行分析，因而更具有可比性。而且，这一条件处于扩增产物指数积累初期，合成产物所需的dNTP、酶、离子均处于饱和的最佳状态，所以FQ-PCR循环参数与起始模板间有良好的线性关系（相关系数0.95），实现了极为精确的基因定量检测。2.3 光谱技术进一步提高了灵敏度     FQ-PCR 技术已用于单细胞基因诊断，灵敏度已达到极限水平，即检测单拷贝基因，而传统PCR是不易做到的。灵敏度提高得益于光谱技术。2.4 荧光探针杂交，进一步提高了特异性     PCR 扩增中常会出现非特异性扩增和引物二聚体，从而影响了对特异电泳带的判断。FQ-PCR通过特异性探针杂交信号检测PCR扩增产物，相当于PCR反应过程中自动完成了Southern杂交，进一步提高目的基因检测的特异性。2.5 扩增与自动分析一体化，检测更加简便和快速     FQ-PCR通过计算机和分析软件，使PCR扩增、产物检测和定量分析一体化，比传统定性PCR更为简便和快速，同时也避免了传统PCR产物分析中有害物质对人体的影响，计算和数据处理也有利于科研和临床资料的保存和分析。3. 临床应用概要     科学研究已经证明，人类疾病大都直接或间接与基因有关，临床实验医学正进入基因诊断时代。但对于许多疾病的发生和发展来说，相关基因不是有无问题，而是一个从量变到质变的过程，基因定量检测更具有临床意义。3.1 感染性疾病      PCR在医学检验学中最有价值的应用领域就是对感染性疾病的诊断。理论上，只要样本有一个病原体存在，PCR就可以检测到。一般实验室也能检出10102基因拷贝，而目前病原体抗原检测方法一般需要105-7个病原体才可检测到。PCR对病原体的检测解决了免疫学检测的“窗口期”问题，可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。     定量PCR研究资料已表明，病原体数量与感染性疾病病情的轻重程度、传染性及治疗效果均有相关性。许多研究表明，人类免疫缺陷病毒(HIV)感染后，潜伏期长短和临床症状轻重与血液中的病毒量显著相关；有也研究表明，HIV病毒载量低于一定值时，没有传染性。     在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒定量研究中发现，病毒的数量与某些药物的疗效相关。例如，干扰素治疗对肝炎病毒高拷贝者不敏感，低拷贝者敏感；而有些药物则具有显著降低病毒高拷贝的作用。3.2 肿瘤      尽管肿瘤发病的分子机制尚未完全清楚，但相关的基因的遗传学改变的积累，是致癌性转变的根本原因已被普遍接受。     癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期和良性的阶段就可出现。PCR技术不但能有效的检测基因的突变，而且能准确检测癌基因的表达量，可据此进行肿瘤早期诊断、分型、分期和预后判断。几乎所有慢性骨髓性白血病患者都可检测到原癌基因易位导致的BCR/ABL融合基因形成，定量PCR技术可通过检测BCR/ABL融合基因的表达确定微量残余恶性细胞存在的数量，以此作为治疗效果和估计复发的危险性的依据。     肿瘤标记物质也是肿瘤诊断的热门研究领域。目前临床对此多用免疫学方法检测，灵敏度低，一般需要达到108个分子数。用定量逆转录(RT)-PCR方法，一般条件下可检出10-102某种标志物的mRNA，可大大提高检出率。     一些病毒致癌作用也与病毒载量有关，EB病毒载量的FQ-PCR检测结果已被用于鼻咽癌早期发现和随访。3.3 遗传病     PCR技术首次临床应用就是从检测镰状细胞和-地中海贫血的基因突变开始的。基因的突变和缺失均会引起各种珠蛋白的表达不平衡，用FQ-PCR检测各种珠蛋白基因表达差异，是地中海贫血诊断的有效手段。     总之，除与疾病直接相关的基因检测外，各种与疾病相关的细胞因子、激素、受体，用FQ-PCR方法检测其基因表达水平具有更高的灵敏性，更有利于疾病诊断。参考文献1 Liva K J, Flood SJA, Marmaro J, et al. Oligonucletides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched prode system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Applic, 1995,4:357-362.2 Holland PM, Abramson RD, Waston R, et al. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5to 3exonuclease activity of the themus aquaticus DNA polymerase. Proc Nat Aca Sci USA,1991,88:7276-72803 Higuchi R, Dollinger G, Walsh PS, et al. Stimutaneous amplification anddetection of specific DNA sequences. Biotechnology, 1992, 10:413-417.一 荧光探针定量PCR定量检测的意义      定量检测与定性检测的最大区别就在于，定性只是检测病原体核酸的“有”或“无”，而定量可以检测病原体核酸量的“多”或“少”。      定量检测的意义：1. 体现病原体含量与复制水平、感染程度之间的关系。 2. 评价和考核治疗效果。 3. 用于传染病发病的监控、预测与预防。 4. 作为新的愈后指标。 5. 建立新的病原体分子诊断标准。 6. 新的药物及疗法的研究与开发。 二 荧光定量PCR报告结果的读取：      荧光定量PCR是直接扩增病原体的特异性DNA或cDNA，其结果反映了标本中DNA或RNA存在的多少，结果通常用数字表示，      报告为“copies/ml”、“2U/ml”或“copies”, copy即“拷贝”，表示病原体基因组的个数，该数据越大，表明病原体在体内复制得越厉害，传染性越强。      例：HBV-DNA 定量结果报告：3.637×104 IU/ml（如果采用科学记数法表示为：3.637E+04），代表每ml血液中含有36,370国际单位乙肝病毒分子。      如果待检标本能够定量，如血液等，结果报告为多少copies/ml或2U/ml。      如果待检标本不易定量，如分泌物、痰液等，结果只报告为多少copies。乙型肝炎病毒（HBV） 一 乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)感染      HBV感染是全球性公共卫生问题，世界卫生组织统计，全世界乙肝病毒携带者有3.5亿人之多。我国人群HBV携带率约为10%，有近1.3亿人感染HBV，是世界上最大的“肝炎大国”。 HBV感染后临床表现呈多样性，可表现为重症肝炎、急性肝炎、慢性肝炎或无症状携带者，其中部分慢性肝炎可演变成肝硬化或肝癌。HBV携带者因无症状，不易被察觉，其作为传染源的危害性比患者更甚。      HBV病毒颗粒呈球形，具有双层的衣壳，HBsAg镶嵌于脂质双层的外衣壳中。HBsAg大量存在于感染者血中，是HBV感染的主要标志，可刺激机体产生保护性抗体即HBsAb。      HBcAg位于内衣壳部分，其外被HBsAg所覆盖，不易在血循环中检出。其抗原性较强，能刺激机体产生HBcAb。HBcAb lgG在血中持续时间较长，为非保护性抗体。HBcAb lgM提示HBV处于复制状态。      HBeAg是Pre C基因（前核基因）的编码产物，是一种非结构性蛋白，为可溶性蛋白质，自肝细胞分泌入血中。HBeAg的消长与病毒体的DNA聚合酶的消长一致，故可作为HBV复制及强感染性的指标。其刺激机体产生HBeAb，对HBV感染有一定的保护作用，通常认为HbeAb的出现是预后良好的征象。 在这三对抗原、抗体系统中，核心抗原较难检测到，一般不作为临床常规检查，故称为“两对半”。其中HBsAg、HBeAg、HBcAb三项阳性称为“大三阳”， HBsAg、HBeAb、HBcAb三项阳性称为“小三阳”。 二 “两对半”检测与HBV-DNA定量      “两对半”是从免疫学水平来检测HBV感染机体后引起免疫应答，产生相应抗原抗体的含量（这个“含量”还不是定量，而只是抗原抗体的“有”或“无”），它实际上测定的是机体感染HBV后免疫应答结果的反映。由于个体反应的差异，不同的人在感染HBV后会出现不同的免疫应答，从而得到不同的“两对半”结果模式。如产生抗体、表现为“携带者”、“大三阳”、“小三阳”等等。但是所有这些免疫学指标不能反映患者或病人体内病毒的复复水平及传染程度，不能提示其与乙型肝炎的发生和发展过程之间的联系。      荧光探针定量PCR技术则是从分子生物学水平直接检测HBV病毒自身的遗传物质DNA，是病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。      HBsAg虽然是HBV的感染标志，但在感染的早期，或由于S基因（编码HBsAg）的低水平表达或变异，常规方法难以检出，会导致漏检。HBV-DNA检测比免疫学检测更早期、更灵敏。免疫学方法检测为HBsAg()的病人中，约有3%以上检测出HBV-DNA(+),健康供血者用PCR方法检测HBV-DNA，也有一定比例的阳性。HBsAg阴性的慢性肝炎中，仍有部分是HBV感染引起的。所以单凭HBsAg阳性与否来判断肝脏中HBV的复制及有无传染性是远远不够的，易造成部分慢性型病毒性肝炎的漏诊。对于HBsAg阴性或有HBV感染后的任何血清学依据都应进一步进行HBV-DNA荧光定量检测。也有时出现HBeAg()而HBV-DNA(+)的结果，这是因为编码e抗原的Pre C区基因极易出现变异，在Pre C区出现终止密码子，使Pre C区基因与C区基因不能转译出完整的e抗原，导致HBeAg表达缺失，机体感染HBV不表达HBeAg，当然血清学方法也不能检测出HBeAg的存在。      HBsAg(+)患者中大约有1-10%检测不出HBV-DNA，这种情况在世界各国都有报道。一方面，由于HBV-DNA整合于宿主细胞基因组，或基因变异，与常用的PCR引物、探针不匹配，PCR扩增不出相应的基因序列，因而未能检出。此外，由于HBV的复制有反转录过程，S基因（编码表面抗原）可以以2.1Kb RNA为mRNA转译成HBsAg，故在部分HBV感染中虽无病毒复制，但可长期产生HbsAg。510% HBV感染者表现为单项HBcAb阳性。有许多报道证明，单项HBcAb阳性的血液可以引起HBV的输血后感染。如果同时检查HBV-DNA，可以减少漏检，预防输血后肝炎的发生。      应用PCR检测发现，大多数“大三阳”病人血中能够检出HBV-DAN（检出率约为96%左右），有相当一部分人e抗原转化e抗体后，即“大三阳”转化为“小三阳”后，其血清中仍有DNA存在(检出率约为30%)，说明病毒仍未消失和停止复制。“小三阳”病人血清中HBV-DNA转阴率约为60-70%，这与病毒遗传物质突变或与宿主基因组整合、用药后复制暂停、以及血清HBV病毒炎症清除使血清中的HBV-DNA消失或下降至极低浓度（低于检测下限）有关，这种情况下并不表示病人恢复，应随访并复查血清HBV-DNA以免误症。      要特别指出的是，近年来由于抑制病毒复制的核苷类药物药物（如拉咪呋啶）在临床的大量使用，使得HBV-DNA复制水平可能会在短时期内迅速降低至不可检测水平（这时候免疫学检测指标可不发生改变），但是随着患者出现药物耐受或产生基因突变，HBV-DNA复制水平又可能呈现一种上升趋势，从而使HBV-DNA定量检测出现相对复杂的动态变化结果。三 荧光探针PCR定量检测HBV-DNA的意义 （一）HBV-DNA定量检测，临床上以103 copies/ml为检测临界值，可作为乙肝病毒无复制状态或低水平复制的指标。慢性乙肝患者血清中HBV-DNA105 copies/ml的患者，如果体内丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平异常，应考虑接受抗病治疗。 （二）HBV-DNA定量检测是直接对HBV的遗传物质DNA进行基因扩增，是病毒复制和存在的最早期、最灵敏也是最可靠的指标，可对HBV感染作出早期诊断。乙肝病人传染性与其血清中HBV-DNA含量高低呈正相关，病人血清中HBV-DNA复制水平越高，其传染性越强。 （三）乙肝的治疗目前尚无特效方法，常用的有干扰素和拉咪呋啶。临床上一般认为用药后HBV-DNA下降到105 copies/ml以下为对药物完全应答；定量下降大于2个数量级(102)为对药物部分应答；未达上述标准为低应答或无应答。研究表明，对于干扰素治疗：(1)治疗前HBV低水平复制者对 干扰素的反应性明显优于高水平复制者。HBsAg转阴的几乎都是那些治疗前血清HBV-DNA含量较低者，而治疗前HBV-DNA含量特别高者大多疗效不佳；(2)治疗中病毒复制水平迅速降低者，有望治愈。相反，治疗期间HBV-DNA水平下降较慢，或下降幅度较小，或变化不明显者，大多治疗无效；(3)治疗结束后，采用PCR定量法监测，HBV-DNA完全转阴一年以上者，可能不再复发，而终止治疗后HBV-DNA仍保持较低水平者，反跳的可能性较大。核苷类药物拉咪呋啶有显著降低高病毒载量作用，近期疗效颇有优势，但是长期使用可导致HBV基因突变，患者易产生耐受性，且易出现停药后反弹。 （四）肝移植前患者血清HBV-DNA水平的高低决定移植后肝脏是否再感染HBV。因为HBV主要侵犯肝脏，建议移植前使用抗HBV药物，最大限度降低血清HBV-DNA浓度，有助于防止HBV侵犯移植后肝脏，提高肝脏移植的效果。 （五）乙肝妇女怀孕前进行定量PCR测定，有助于选择有利的怀孕时机，要选择低病毒载量时受孕。乙肝孕妇怀孕期间定期进行定量PCR检查，有助于使部分病人得到及时、正确的诊断，减少宫内感染的风险；母婴传播多发生于胎儿期和围生期。尤其是HBsAg和HBeAg双阳性的母亲，体内HBV-DNA复制水平相对较高，发生胎内传播和围生期感染的机率均较高。因HBV可通过乳汁直接传染给婴儿，哺乳期妇女，除血液检测外，还应进行乳汁HBV-DNA检测，以决定是否母乳喂养。丙型肝炎病毒(HCV)一 丙肝病毒(hepatitis C virus，HCV)感染      丙型肝炎呈全球性流行，是欧美及日本等国家终末期肝病的最主要原因。据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约为3%，估计约1.7亿人感染了HCV，每年新发丙型肝炎病例约3.5万例。 丙肝病毒呈球形，有包膜，是一种单正链RNA病毒，主要在肝细胞内复制。基因组由9个基因区组成，编码糖基化包膜蛋白E1区和E2区基因极易出现变异。丙肝病毒体外培养至今尚不成功。      HCV感染引起的临床过程轻重不一，可表现为急性肝炎、慢性肝炎或无症状携带者。HCV感染的重要特征是易于慢性化，急性期后易于发展成慢性肝炎，部分病人可进一步发展为肝硬化或肝癌。40%50%的丙肝患者可转变成慢性肝炎。多数慢性肝炎患者的临床表现不明显，发病时已呈慢性过程，约20%慢性肝炎可发展成肝硬化。HCV感染与肝癌的发生有密切关系，在意大利、希腊、日本等国肝癌患者血中，50%70%抗-HCV阳性，我国肝癌患者血中约10%存在抗-HCV阳性。用RT-PCR技术可从约10%的肝癌组织中检出HCR-RNA。      HCV主要通过输血传播，是输血后肝炎致病因子。免疫学标志仅有抗-HCV一项，为非中和抗体。      全国血清流行病学调查资料显示，我国一般人群抗-HCV阳性率为3.2%。各地抗-HCV阳性率有一定差异。      HCV在体内呈低水平复制，病毒血症水平较低，不易诱导高水平的免疫应答；HCV亦可存在于肝外组织或外周血单核细胞中，使病毒感染不易清除。因为E1区和E 2区基因具有高度变异性，导致丙肝病毒包膜蛋白的抗原性快速变异，这种变异引起的免疫逃避作用，是病毒在体内持续存在，感染易于慢性化的主要原因，也是丙肝病毒疫苗研制的最大障碍。不同地区的不同个体、同一个体的不同时期、同一样品的不同克隆之间，丙型肝炎病毒的基因序列都存在着差异性。二 荧光探针PCR定量检测HCV-RNA的意义 （一）HCV-RNA荧光定量PCR检测，临床上以80 copies/ml为检测临界值，可作为丙肝病毒无复制状态或低水平复制的指标。慢性丙肝患血清中HCV-RNA103copies/ml的患者应接受抗病毒治疗。血清HCV-RNA107copies/ml的患者抗病毒治疗的疗效常优于HCV-RNA含量更高者。 （二）荧光探针PCR定量检测HCV-RNA可以大大提高检测的窗口期。暴露于HCV后13w，在外周血可检测到HCV-RNA。丙肝的免疫学指标只有抗-HCV抗体一项，血清学筛查HCV抗体的“窗口期”约达三个月之久。在急性HCV感染者出现临床症状时，仅50%70%患者抗-HCV阳性，3个月后约90%患者抗-HCV转阳，少数人感染HCV后不产生抗-HCV。故在免疫学检测的“窗口期”或一部分不产生抗体的丙肝病毒携带者，都可出现HCV-RNA(+)，抗-HCV(-)的检测结果。 （三）慢性丙型肝炎长期抗-HCV阳性，这只表示曾经感染了丙肝病毒并出现了相应的免疫应答，并不代表体内仍有丙肝病毒的存在或复制，这时只能通过HCV-RNA定量检测鉴别丙肝病毒的活动性和复制程度。有些人抗-HCV阳性，但可表现为ALT水平正常，HCV-RNA(-)。当然也不排除由于HCV基因变异，或是PCR抑制效应而导致的假阴性结果。 （四）HCV-RNA病毒载量与抗-HCV滴度以及ALT水平呈正相关，抗-HCV滴度和ALT异常率随着HCV-RNA载量升高而增加。HCV-RNA常在ALT恢复正常前转阴，但也有ALT恢复正常而HCV RNA持续阳性者。 （五）HCV-RNA病毒载量的高低与疾病的严重程度和疾病的进展并无绝对相关性，但可作为抗病毒疗效评估的观察指标。丙型肝炎治疗有一定疗效，治疗后血清HCV-RNA转阴率可高达50%80%，但停药后约半数HCV-RNA又转阳，复发时间多在治疗后612个月，若治后12个月ALT持续正常，血清HCV-RNA阴性，则可能治愈。抗-HCV阴转与否不能作为抗病毒疗效的指标。 （六）HCV主要在肝脏内进行复制，肝移植后丙型肝炎复发与移植时HCR-RNA水平及移植后免疫抑制程度有关。 （七）HCV 主要通过输血和血制品传播，同时，未经严格消毒的手术器械、注射器等也是其经破损的皮肤和黏膜传播的重要途径。医疗纠纷呈倍增长的年代，面对医疗纠纷中的“举证倒置”，更有必要对病人，尤其是手术和接受输血的病人进行入院前后HCV-RNA定量检测。结核分枝杆菌（TB） 一 结核分枝杆菌(tubercle bacilli，TB)感染      结核杆菌属分枝杆菌属，因繁殖时有分枝生长趋势而得名。由于菌体含大量分枝菌酸，故不易着色，但在加温或延长染色时间着色后能抵抗盐酸乙醇的脱色，故又称抗酸杆菌。      结核杆菌可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最多见。随着抗结核药物的不断发展和卫生状况的改善，世界各国结核的发病率和死亡率曾大幅度下降。20世纪80年代以后，由于艾滋病流行以及结核分枝杆菌耐药菌株的出现，结核病的发病率又有不断上升的趋势WHO最新统计，全球每年新发病例800万左右，其中发展中国家占95%。      我国2000年第四次全国结核病流行病学调查结果表明，我国有45亿人已受结核分枝杆菌感染，估计全国有活动性肺结核患者451万。全国结核病死亡率为44.5%，每年死于结核病者达13万人， 为各种其它传染病和寄生虫病死亡总和的2倍。青壮年结核病死亡占结核病死亡的48%。目前，我国结核病流行形势仍十分严峻，结核病尚未得到有效控制，为全球结核病高负担国家之一。其特点为高感染率，高患病率，高死亡率，高耐药率，低递降率，农村疫情高于城市，青壮年结核病患病和死亡比例高。      结核杆菌侵入肺泡后被巨噬细胞吞噬，由于菌体含有大量的脂质，能抵抗巨噬细胞的杀菌作用而大量繁殖，导致巨噬细胞裂解，释放出大量细菌而引起肺泡渗出性炎症，形成原发性结核。原发性肺结核多见于儿童。      继发感染多见于成年人。当人体抵抗能力下降时，残存于原发灶的结核分枝杆菌会再度大量繁殖而发病，且容易发生肺部干酪样坏死和空洞形成，菌可随痰排出，称为开放性结核。 部分患者，结核杆菌可经血液、淋巴液扩散侵入肺外组织器官，引起相应的脏器结核，如脑、肾、骨、关节、生殖器官等结核。艾滋病等免疫力极度低下者，严重时可造成全身播散性结核。痰菌被咽入消化道也可引起肠结核、结核性腹膜炎等。结核杆菌的肺外感染在临床上更容易误诊。近年来有许多报道，肺外结核标本中结核分枝L型的检出率比较高，应引起足够的重视。二 结核杆菌检测的方法学讨论及荧光定量PCR检测TB-DNA的意义      结核病是一种感染性疾病，病因很明确，实验室诊断是确诊的主要依据。 （一）最简单、快速、经济也是最常用的诊断方法是通过涂片染色直接观察抗酸杆菌，但是这种方法的灵敏性很差，对于结核杆菌感染者，其检出率只有30%左右。60%以上的肺结核病人以及75%的肺外结核病人都不能通过这种传统的方法检测出来。抗酸染色的另一局限是特异性的问题，它只能做到分枝杆菌属的鉴定，而无法将结核杆菌和基他分枝杆菌区分开来。涂片阳性只表明存在抗酸杆菌，包括约85%的结核分枝杆菌和15%的非结核分枝杆菌都可以抗酸染色阳性。 （二）作为结核病诊断“金标准”的细胞培养法，一般要48w的时间最快者也要2w才能出阴性/阳性结果，费时费事，延误诊断，有悖于结核杆菌的快速诊断要求。 （三）结核菌素试验作为结核的辅助诊断已经存在数十年之久了，但是却没有很好的说服力，因为非结核分枝杆菌也有致敏作用而导致假阳性。结核杆菌一直没有找到病原性的特异单一抗原或是保护性特异单一抗原。人们做了无数次的尝试，希望能够成功开发出在临床上应用的诊断结核的血清学试剂盒，但都以失败而告终。在开发这种检测试剂的一次次探索中，大量的蛋白和非蛋白抗原（如酰基海藻糖，苯酚糖酯）被发掘出来，但都没有太大的临床价值。由于结核分枝杆菌跟其他一些可能致病或根本不致病的微生物具有大量相同的抗原蛋白，所以想在临床上寻找一种适合于ELISA方法的抗原十分困难。 （三）随着分子生物学技术的发展，尤其是在核酸扩增和杂交领域取得的重大进展，有助于改正现存结核诊断方法中存在的缺陷。采用荧光探针定量PCR方法检测临床标本中结核杆菌的DNA是快速诊断结核杆菌感染的一种非常有前途的方法，尤其是对于因菌量少，或细菌发生L型变异而不易分离培养成功的标本更有实用价值。目前，荧光探针PCR方法检测结核杆菌已经得到了国家药品监督管理局(sFDA)的批准，在全国推广使用。 （四）荧光定量PCR法能稳定检测10 copies结核杆菌基因组DNA，灵敏度高，特异性强。一定比例涂片或培养阴性的病人，PCR检测可为阳性。该法检测活动性肺结核患者的痰和外周血阳性率分别为49.0%和51.6%、结核性胸膜炎患者的胸腔积液和外周血阳性率分别为45.4%和38.5%，以及结核性脑膜炎患者的脑脊液和外周血阳性率分别为50.8%和42.6%，检出结核杆菌阳性率显著高于痰涂片抗酸染色和改良罗氏培养法。 （五）若有出现涂片阳性，而PCR检测结果为阴性，首要考虑非结核分枝杆菌的感染。其次考虑操作原因，在痰液标本处理过程中，如果痰液化不够，细菌在离心过程中不能沉淀到试管底部而随上清一起去掉，会导致PCR结果的假阴性。 （六）荧光定量PCR法能反映抗结核治疗过程中痰标本中的结核杆菌的数量变化，对抗结核药物疗效有一定的监控效果。但是PCR并不能区分死菌与活菌，所以对于某些已经治愈的结核病患者，肺内若有死的结核杆菌的残留，仍可抽提到DNA，PCR检测仍可为阳性结果。 （七）对不同感染部位的标本进行TB-DNA的扩增和检测，即可诊断相应部位是否存在结核杆菌的感染。 1痰或支气管灌洗液TB-DNA检测可辅助诊断肺结核病。 2血液（白细胞）TB-DNA检测可辅助诊断播散性肺结核和各脏器的肺结核病。 3脑脊液TB-DNA检测可辅助诊断中枢神经系统结核病。 4宫颈拭子或尿液TB-DNA检测可辅助诊断泌尿生殖道结核病。 5胸腹水TB-DNA检测可以辅助诊断结核性胸膜炎。 肺炎衣原体(CP)一 肺炎衣原体(chlamydia pneumonia，CP)感染      肺炎衣原体主要寄生于人类的呼吸道，是引起呼吸道感染的重要病原体之一。人类是肺炎衣原体的惟一宿主。      肺炎衣原体系人与人之间经飞沫或呼吸道分泌物传播，在密切接触的家庭或在人群密集的医院等公共场所更易传播。其感染扩散速度较为缓慢，具有散发和流行交替出现的特点，在人群中流行可持续6个月左右。      CP主要引起青少年急性呼吸道感染，尤其引起儿童的咽炎、鼻窦炎、支气管炎和肺炎等。潜伏期平均30d左右，起病缓慢，临床表现为咽痛、声音嘶哑、发热、咳嗽和气促等症状，还可引起心包炎、心肌炎和心内膜炎。CP感染所引起的肺炎患者12w上呼吸道感染症状消失，而咳嗽加重，可持续1至2个月。老年患者的临床表现不易与其他原因引起的肺炎相区别，持续性咳嗽是本病的主要特点。半数肺炎患者常伴有结膜炎，也可引起肺外症状如红斑结节、甲状腺炎、格林-巴利综合征等。      近年来发现CP与冠状动脉硬化性心脏病的发生有关。采用免疫组化、分子生物学和病理学的研究结果证实在冠状动脉粥样硬化病灶中存在肺炎衣原体。不仅有肺炎衣原体的梨形结构，而且病理切片用抗肺炎衣原体特异单克隆抗体处理后呈阳性。也有资料表明肺炎衣原体的慢性感染及其所形成的免疫复合物对冠状动脉的损害，可能是引起冠状动脉硬化性心脏病病理改变的一个重要因素之一，但尚需进一步证实。      肺炎衣原体在激发哮喘中亦可能发挥作用。      在肺癌、支气管扩张患者中CP的检出率也相对较高。      CP感染的患者外周血白细胞计数大多正常，胸片无特异性，多为单侧下叶浸润，表现为节段性肺炎，严重者呈广泛双侧肺炎。 二 肺炎衣原体检测的方法学讨论及荧光探针PCR检测CP-DNA的意义      肺炎衣原体是严格的细胞内寄生，必需在活的细胞内才能生长，所以培养条件要求更高也更不容易，一般采用HEp-2t和Hela细胞株进行培养，再用荧光特异性单克隆抗体来鉴定细胞培养中的肺炎衣原体，但是这种方法周期长，检出率低，并不适应于临床检测。      血清学方法检测肺炎衣原体特异性抗体，微量免疫荧光（MIF）试验检测肺炎衣原体较为敏感。凡双份血清抗体滴度增高4倍或以上；或单位血清特异性IgM抗体 1：16或IgG抗体1：512，有一定的诊断价值。      分子生物学检测，采用限限制性内切酶Pst I 对肺炎衣原体的DNA进行酶切后，可获得一条474bp的DNA片段，而沙眼衣原体和鹦鹉热衣原体却没有这种DNA片段。实际上由于标本中病原体的数目很少，酶切的方法往往是在细胞培养或PCR扩增后进行。但是酶切方法由于成本较高且操作复杂，并不适用于临床检测。      近年来发展起来的荧光探针PCR方法，直接扩增患者痰液、鼻洗液、咽拭子或支气管洗液等标本中（取材用深部痰液，小儿用吸痰器吸取深部痰液效果最好，用鼻咽拭子需要在上腭悬雍垂后部涂擦取分泌物拭子）肺炎衣原体的特异性核酸片段，操作简单、灵敏度高、特异性强，同时避免了常规PCR技术操作复杂和扩增产物污染带来的假阳性等问题，被迅速应用于肺炎衣原体感染的临床检测。     同样荧光探针PCR检测还可用于观察肺炎衣原体感染的治疗效果，有效治疗后，标本中CP-DNA的拷贝数会相应地下降或转阴。肺炎支原体(MP)一 肺炎支原体(mycoplasma pneumonia，MP)感染      在正常人和动物的上呼吸道分泌物中可分离出多种支原体，说明绝大多数支原体构成人和动物的正常菌群。而目前所能确定引起人类呼吸道感染性疾病的也只有肺炎支原体，主要引起人类支原体肺炎。      MP主要引起呼吸道外源性感染，一般通过飞沫传播，一个四季均可发病，但多发生在夏末秋初季节，以115岁人群发病率较高，占小儿肺炎的20%左右，在人口密集场所或区域可达50%。婴幼儿发病率最高，占2569%，病情严重者可发生死亡。      MP感染主要引起支原体肺炎，其病变为同质性肺炎，亦可合并支气管肺炎，故曾称为原发性非典型性肺炎。潜伏期约为23w，临床症状有不规则发烧，体温可达39，热程在13w左右。临床症状轻重不一，主要表现为头痛，刺激性咳嗽。婴幼儿病情较重，发病急，病程长，以呼吸困难为主，主要症状一般在10d后减轻，由于局部炎症导致的咳嗽持续时间较长，并引起支气管壁肥厚。      支原体肺炎约占非细菌性肺炎的1/3以上，或各种原因引起的肺炎的10%。MP感染与小儿支气管炎哮喘密切相关。      除支原体肺炎外，尚可引起肺外感染，咽喉炎、鼻炎、中耳炎、气管炎和支气管炎等。      实验室检查周围血白细胞一般正常或有轻度增多。      胸部X线改变多种多样，最常见的是两肺下叶片状支气管肺炎。二 肺炎支原体检测的方法学讨论及荧光探针PCR检测MP-DNA的意义      肺炎支原体可从咳痰或咽拭子中培养出来，培养条件要求较高，分离和鉴定需12w，许多医院的实验室无法做此项检查，且周期太长，阳性率低，因此对临床帮助不大。      普通染色法不易着色。由于没有细胞壁，具有较大的可塑性,呈现高度的多态性，形态学方法难以鉴别。      冷凝集试验，仅有50%左右患者出现阳性，且此反应为非特异性，呼吸道合胞病毒感染、腮腺炎、流感等也可出现冷疑集素效价的升高，故只能做为辅助诊断。      酶联免疫吸附试验(ELISA)，免疫荧光法、金标免疫斑点