血红蛋白的提取和分离66643(7页).doc

-血红蛋白的提取和分离66643-第 7 页血红蛋白的提取和分离【学习目标】 1.熟记凝胶色谱法、电泳法分离生物大分子的基本原理，了解缓冲液的组成及其作用； 2.掌握血红蛋白的提取与分离的基本过程和方法。思考1：分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。思考2：蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的 、所带电荷的 、溶解度和 的性质和对其他分子的 等等，可以用来分离不同蛋白质。一、基础知识： 凝胶色谱法（又称分配色谱法）：1、概念：根据被分离蛋白质的 ，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来分离蛋白质的有效方法。2、凝胶：实际上是一些微小的 ，这些小球体大多数是由 构成的，如 和 ，内部有许多贯穿的通道。3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程 ，移动 ，而 的蛋白质 进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 ，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。4、具体过程：凝胶颗粒相对分子质量较小的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质（1）（2）（3）（4）（5）BA多孔板A. 的蛋白质由于 作用进入凝胶颗粒内部而被滞留； 的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。B.（1） 混合物上柱；（2）洗脱开始， 的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内； 的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外；（洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动）（3） 的蛋白质被滞留； 的蛋白质被向下移动。（4） 不同的蛋白质分子完全分开；（5） 的蛋白质行程较短，已从 中洗脱出来， 的蛋白质还在行进中。 缓冲溶液：1、作用：在一定范围内，能够抵制 的对溶液的 的影响，维持PH基本不变。2、缓冲溶液的配制通常由 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的 就可以制得 使用的缓冲液。思考3：本课题中使用的缓冲液是什么？它的目的是什么？使用的是pH= 的 ，目的是利用缓冲液模拟细胞内pH环境，保证血红蛋白的正常 和 。电泳：1、概念：指 在 的作用下发生 的过程。2、原理：a、许多重要的生物大分子，如核酸多肽等都具有 ，在 下，这些基团会带上 或 。b、在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷 的电极移动。c、电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身 、 的不同使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的分离。3、常用方法：琼脂糖凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳。测定蛋白质相对分子质量通常用十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳阴极阳极加入待分离的样品带电性质、分子大小和形状的不同，使分子迁移速度不同分子向阳极移动缓冲液琼脂胶溶液槽凝胶电泳原理示意图蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入 。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是 。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于 。使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。二、实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理粗分离纯化纯度鉴定（一）样品处理a、血液由 和 组成，其中 最多。b、在红细胞的组成中，约90%是血红蛋白。血红蛋白由 个肽链组成，包括 和 。其中每条肽链环绕着一个 ，此基团可携带 或 。血红蛋白因含有 而呈现红色。本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。思考4：你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？ 哺乳动物血液，因为该细胞中没有 ，血红蛋白含量高。(1)红细胞的洗涤目的：去除 ，以得于后续步骤的分离纯化。方法：按每100ml血液加入3g柠檬酸钠的比例向采血容器中预先加入柠檬酸钠，采集的血样 离心，然后用胶头吸管吸出上层透明的 ，将下层 的 倒入烧杯再加入用 的 ，缓慢 ，低速短时间 ，如此重复 次，直至上清液中已没有 ，表明洗涤干净。注意：洗涤次数，离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少， ；离心速度过高和时间过长会使 ，达不到分离的效果。思考5：加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？能否用蒸馏水代替生理盐水？防止血液 ；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白；不能，生理盐水能保持红细胞的 稳定而不至于破裂，在未洗净血浆中的杂蛋白前，红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度。(2) 血红蛋白的释放 目的：使红细胞破裂，释放 。 方法：将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加 到 体积，再加40体积的 ， 置于 上充分搅拌10分钟, 在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。思考6：加入的蒸馏水、甲苯的作用分别是什么？充分搅拌的目的是什么？蒸馏水的作用：使红细胞 ；甲苯的作用：溶解红细胞的 ；充分搅拌的目的：加速红细胞的 。(3) 分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min ，试管中的溶液分为4层:第1层（最上层）： 甲苯层第2层（中上层）： 的沉淀层， 色薄层固体第3层（中下层）： 的水溶液层， 的液体第4层（最下层）：其它杂质 的沉淀层将试管中的液体用滤纸过滤，除去 ，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的 。（二）粗分离透析（1）目的：透析可以去除样品中 的杂质，或用于更换样品的缓冲液。（2）原理：透析袋能使 自由进出，而 大分子保留在袋内。透析袋：一般是用硝酸纤维素（又称玻璃纸）制成的。（3）操作：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml物质的量浓度为20mmol/L的 ，（pH为 ），透析 。（三）纯化凝胶色谱操作1）凝胶色谱柱的制作取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。底塞的制作：橡皮塞打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。顶塞的制作：打孔安装玻璃管。组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体，并在下端出口连接带开关的尼龙管，尼龙管放入收集器。安装其他附属结构。2）凝胶色谱柱填料的处理（1）凝胶的选择： 。（2）方法： 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于 中充分溶胀后，配成 。注意：商品凝胶是干燥的颗粒，使用前需直接放在 中膨胀。为了加速膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用 加热，逐渐升温至接近沸腾，通常只需 。这种方法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的 ，排除胶粒内的 。（3）凝胶色谱柱的装填方法固定：将色谱柱处置固定在支架上装填：将 一次性的缓慢倒入 内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低 。在装填凝胶柱时，不得有 存在，一旦发现有 ，必须重装。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的 ，降低分离效果。在凝胶色谱操作过程中，不能发生 ， 的现象。一旦发生这种情况，凝胶色谱柱需要 。洗涤平衡 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在 高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分 12小时，使凝胶装填紧密。3）样品加入与洗脱（1）加样前：打开下端流出口，使柱内凝胶面上的 缓慢下降到与 平齐，关闭出口（2）加透析样品调整缓冲液面：与 平齐滴加透析样品：用吸管将1ml的样品加到 ，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意 。样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品 后，关闭下端出口。 洗脱：小心加入pH7.0 的20mmol/l的 到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。收集：待 接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每 收集一试管连续收集。注意：在蛋白质分离过程中，仔细观察 在洗脱过程中的移动情况。如果 均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功。思考7：血红蛋白呈现红色，这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义?血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察 来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。4.纯度鉴定SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳判断 的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度电泳方法步骤根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板SDS聚丙烯酰胺凝胶制备样品处理 把凝胶固定于电泳装置上加样：按顺序加样，加样量通常为1025 L电泳剥胶染色脱色观察结果 三、结果分析与评价（1）对血液样品处理后发生的变化正常现象：由于血红蛋白与氧气结合呈鲜红色，与二氧化碳结合呈暗红色，所以刚分离的血红蛋白溶液呈红色。观察你处理的血液样品离心后是否分层，如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。（2）判断装填的凝胶色谱柱是否成功判断方法：a、 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。b、 此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。调整方法：如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。（3）对分离效果的判断如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。四、课后练习1、下面是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入（图）和洗脱（图）示意图，请据图回答下列问题。（1）在加样示意图中，正确的加样顺序是_。（2）用吸管加样时，应注意正确操作，分别是_（3）等样品_时，才加入缓冲液。（4）待_接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每_mL收集一管，连续收集。答案：（1）（2）不要触及破坏凝胶面贴着管壁加样使吸管管口沿管壁环绕移动（3）完全进入凝胶层（4）红色的蛋白质52、血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2、CO2的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题。（1）将实验流程补充完整：A为_，B为_。凝胶色谱法的基本原理是根据_来分离不同种类的蛋白质。（2）洗涤红细胞的目的是去除_，洗涤次数过少，无法去除去 ；离心速度和时间过长会使 一同沉淀，达不到分离的效果。洗涤干净的标志是_。释放血红蛋白的过程中起作用的是_。（3）透析的作用是_。（4）在洗脱过程中加入物质的量浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH为7.0）的目的是 。如果红色区带 ，说明色谱柱制作成功。 答案：（1）血红蛋白的释放样品的加入和洗脱相对分子质量的大小（2）去除杂蛋白，利于后续步骤的纯化 血浆蛋白 白细胞和淋巴细胞 上清液中没有黄色蒸馏水和甲（3）去除小分子杂质 （4）准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的pH和体内一臻 均匀一致的移动3 凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。据下图回答问题：(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是_，原因是_。(2)自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由_替代。(3)装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是_。(4)洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体_(填“相同”或“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是_。答案：(1)a      a的相对分子质量大，无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快(2)尼龙网和尼龙纱(3)气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果(4)相同       保持稳定