蛋白质和酶的分离与纯化(8页).doc

-蛋白质和酶的分离与纯化-第 7 页蛋白质和酶的分离纯化及鉴定蛋白质是生命体中的重要物质基础之一。从分子水平上认识生命现象，已成为现代生物学发展的主要方向。要研究蛋白质，首先要得到高度纯化的目的蛋白。蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。要想从成千上万种蛋白质混合物中纯化出目的蛋白，就要根据蛋白质的理化性质不同设计出合理的分离方法。目前研究为止酶除核酶外本质都是蛋白质，因此酶的分离纯化方法基本是采用蛋白质的分离纯化方法，但是酶的活性受到多种因素的影响，因此酶的分离纯化比一般的蛋白质要求更高。一、质分离纯化的一般原则1. 原料的选择 原则：来源方便，成本低，易操作、安全的原料。 蛋白分布：体液、组织、细胞定位2. 破碎方法： (1) 机械方法：通过机械运动产生的剪切力的作用，使细胞或组织破碎的方法。 如：捣碎法、研磨、匀桨法 (2) 物理方法：通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。 如：反复冻融、渗透压、超声破碎 (3) 化学方法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎的方法. 如：甲苯、丙酮、氯仿和非离子型的表面活性剂（Triton和Tween） (4) 酶促法：溶菌酶、蜗牛酶等 3. 目的蛋白或酶的特异、快速、精确的定性或定量方法4. 先粗后细，分级分离 粗分：将得到的蛋白溶液先利用简单、快速、易处理的方法除去大部分杂蛋白。如: 盐析、离心、有机溶剂沉淀等。 精制：利用蛋白质性质的差异，采用不同的方法，如:离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶等方法进一步纯化。 5. 避免蛋白质的变性（pH、适合的温度和缓冲体系等）二、常用的蛋白质的分离纯化技术可以根据各种蛋白质的结构、理化性质不同设计分离方法。（一）根据蛋白质的溶解度不同进行分离1. 蛋白质盐析蛋白质属于生物大分子之一，分子量从1万至100万之巨，其分子的直径可达1-100nm，为胶粒范围之内。蛋白质的表面电荷和水化膜是其主要的稳定性因素。 大多数蛋白质都溶于水，在低盐条件下，蛋白的溶解度随着盐浓度的升高而增加，这称为蛋白质的盐溶现象，而盐浓度达到一定以后，蛋白质水化膜被破坏，电荷被中和，蛋白质的溶解度会随着盐浓度的升高而降低，并且析出，这就是盐析现象。由于各种蛋白质分子的颗粒大小和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。常用的中性盐：硫酸铵、醋酸钠、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中最常用的是硫酸铵，它的优点是温度系数小，溶解度高（25时的饱和度为4.1mol/L，即767g/L；0时的饱和度为3.9mol/L，即676g/L）；在这一溶解度范围内，许多蛋白都可以盐析出来；另外，硫酸铵不容易引起蛋白质变性；不同浓度硫酸铵pH在之间，可以结合等电点进行分离纯化，沉淀效果更好。影响盐析的因素：温度：pH：蛋白质浓度：盐析的缺点是蛋白质沉淀后要除盐，否则会影响后续的电泳或离子交换等相关实验。2. 等电点沉淀法蛋白质在等电点时，也就是静电荷为零时，蛋白质颗粒之间的静电排斥力减小，蛋白的溶解度下降，容易发生沉淀，因此，可以调节溶液的pH，使其达到目的蛋白的等电点，使之沉淀而分离。但是，此方法很少单独应用，一般与盐析法或后述的有机溶剂沉淀法联合应用效果更好。3. 有机溶剂沉淀法有机溶剂可使溶液的介电常数降低，蛋白之间的静电引力增大，互相吸引而易于集聚；也可使水化膜破坏，蛋白的溶解度降低。优点：易于进一步的分离，不用脱盐缺点：易引起蛋白的变性，所以沉淀后要尽快的分离常用的有机溶剂：乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等。（二）根据蛋白质分子大小进行分离1. 透析与超滤透析就是利用透析膜将分子大小不同的蛋白质分开。超滤是利用压力和离心力，促使大小不等的分子通过滤过膜，两者都是根据化合物的分子量进行分离的一种方法，可选择不同孔径的滤膜截留不同分子量的蛋白质。是以各种多孔凝胶为固定相，对不同分子量的组分进行分离的一种层析方法。也叫凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。常用的凝胶材料: 葡聚糖凝胶（Sephadex)：是由葡聚糖交联而成，具有良好的化学稳定性，耐高温（>120）, 型号多，可用于各种物质的分离和纯化。 琼脂糖凝胶（Sepharose)：是一种天然多孔凝胶，孔径大，适用于大分子量分子的分离。 聚丙烯酰胺凝胶：是人工合成的凝胶，交联度不同，孔径不同，可用于各种蛋白的分离。缺点是强酸会使凝胶的酰胺键破坏。（三）根据蛋白质带电性质进行分离1. 电泳法各种蛋白质在同一pH条件下，因为分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而彼此分离。2. 离子交换层析法是利用离子交换剂上可解离基团对各种离子的的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。离子交换剂：是含有可解离的阳离子或阴离子基团不溶性高分子化合物，这些基团能与溶液中的其它阳离子或阴离子进行可逆的交换。按活性基团性质不同：阳离子交换剂 阴离子交换剂按母体物质种类不同：离子交换树脂：小分子量蛋白质分离 离子交换凝胶：各种分子量蛋白质分离离子交换纤维素：各种分子量蛋白质分离 阳离子交换阳离子交换剂中含有酸性基团，能解离出氢离子，与样品溶液中的阳离子进行交换。 强酸型阳离子交换剂：磺酸（R-SO3-H） 弱酸型阳离子交换剂：磷酸（R-HPO3-H） 羧酸（R-COO-H） 酚羟基（R-O-H） 阴离子交换阴离子交换剂中含有的碱性基团，能释放出阴离子，与样品溶液中的阴离子进行交换。 强碱型阴离子交换剂：季胺 R-N+(CH3)3-OH- 弱碱型阴离子交换剂：伯胺 (R-N+HH2-OH-) 仲胺 (R-N+HCH3H-OH-) 叔胺 R-N+ (CH3)2H-OH-（四）根据蛋白质特异性进行分离-亲和层析亲和层析是利用生物分子与配体之间具有的专一而又可逆的亲和力，是生物分子分离纯化的技术。固定相：上述提到的凝胶或树脂结合上配体。优点：选择性好，纯化步骤简单，一次就可达到很高的纯化倍数。缺点：价格昂贵，处理量少，不适合大规模应用，洗脱剂要求高，无通用性。总之，根据拟分离的蛋白质的理化性质、防止变性以及样品情况和实验条件选择最佳方法。有时往往不止用一种方法进行分离纯化，而是选择几种适当的方法进行分离，力求达到纯化和高产的目的。实验一 g-球蛋白的分离纯化一、实验目的掌握蛋白质分离纯化的基本方法和步骤。二、原理-球蛋白是一组结构相似但又有差异的蛋白质，统称为免疫球蛋白（immunoglobin, Ig）。 按其结构和免疫化学性质的差异分为五类。分别为IgG，IgA，IgM，IgD，IgE，其中IgG占70%。血清中有70余种蛋白质，本实验的目的是要从70余种血清蛋白中分离出-球蛋白。1. 粗分，采用饱和硫酸铵盐析法，如果蛋白质溶液体积大，要求达到的硫酸铵饱和度在50%以上时，可在蛋白质混合溶液中直接加入硫酸铵试剂如果蛋白质溶液体积小，要求达到的硫酸铵饱和度在50%以下时，可采用饱和硫酸铵溶液法，饱和硫酸铵溶液的加入量按下式计算： V=V0（C2-C1）/(100-C2) 或者是V=V0（C2-C1）/(1-C2)V: 应加入饱和硫酸铵溶液的体积；V0：蛋白质溶液的原始体积；C1：原溶液的硫酸铵饱和度；C2：要达到的硫酸铵饱和度。硫酸铵盐析法可使蛋白质纯度提高5倍，而且可以除去核酸等杂质。2. 除盐：采用透析法使硫酸铵除去。3. 精制：采用阴离子交换层析法利用阴离子交换纤维素层析其优点是：具有开放性支持骨架，大分子可以自由进入和迅速扩散，吸附量大；具有亲水性，用温和的条件可以洗脱，不易引起蛋白质的变性或酶的失活；具有多孔性，表面积大，交换容量大，回收率高，可用于分离和制备。4. 纯度鉴定：采用醋酸纤维素薄膜电泳。三、试剂和器材1.试剂 正常血清（人、兔、狗） 饱和硫酸铵溶液 0.0175mol/L磷酸缓冲液1.0ml（pH6.3） DEAE-纤维素 纳氏试剂：碘化汞和碘化钾的碱性溶液，与氨氮反应生成淡红棕色的化合物（410-425nm)。 20%磺柳酸试剂2. 器材 层析柱及支架 白色和黑色比色板 透析袋及细线 烧杯2个、试管20支 吸管1个四、操作步骤1. 取少许血清作为A样。2. 盐析：取2ml血清加2ml生理盐水于离心管中，混匀后缓慢滴加饱和硫酸铵溶液4ml，边加边混，室温放置10min，3000 rpm，离心10min，小心除去上清，沉淀加0.0175mol/L磷酸缓冲液1.0ml（pH6.3）复溶。3. 透析除盐：用细线扎住透析袋一端，将溶解的g-球蛋白溶液倒入透析袋内，用线扎紧透析袋另一端，放入一大烧杯中，加入蒸馏水进行透析，每隔10min用纳氏试剂在白板上检测烧杯中的NH4+，并更换蒸馏水直至检测不到NH4+为止，留取透析袋内液体2滴，作为B样。4. DEAE-纤维素离子交换层析： 装柱：取层析柱加入蒸馏水，观察水流是否通畅，然后将层析柱垂直固定到支架上，关闭下端出口，将处理再生后的DEAE-纤维素悬液搅拌均匀后缓慢倒入层析柱，使柱床高度达到10-15cm。 平衡：打开柱的下端出口，用3个柱床体积的0.0175mol/L磷酸缓冲液（pH6.3）平衡后关闭柱的下端出口。 上样：将透析脱盐后的蛋白质溶液缓慢加到DEAE-纤维素柱床上，开下端出口，使样品进入柱床。 洗脱：用0.0175mol/L磷酸缓冲液（pH6.3）洗脱蛋白，并且立即收集洗脱液，流速为10滴/min，每2min收集1管，按顺序排列。 洗脱液中蛋白质的检测：取黑色比色板或干净的试管一个，按洗脱管顺序分别取1滴于其中，然后加入20%磺柳酸试剂1滴，出现白色浑浊或沉淀即为蛋白质析出，记录并估计各管的蛋白质浓度，取浓度最高的一管作为C样。五、实验注意事项1. 硫酸铵缓慢滴加，避免形成瞬间高浓度，导致杂蛋白共沉。2. 离心前试管要平衡，对称放入离心机内，开机和关机要缓慢加速和减速。3. 透析时两端要扎紧，不要扎段，10min左右换水一次，否则容易导致透析袋内样品稀释。4. 装柱时不能分层，不能进入气泡，转好后用上样缓冲液平衡。5. 样品进入柱床后再加洗脱缓冲液，否则会导致样品稀释。6. 洗脱时流速不要太快，否则也会导致洗脱液中的蛋白质稀释而检测不出。实验二 g-球蛋白的鉴定一、实验目的掌握蛋白质的电泳鉴定方法和步骤。二、原理电泳是在外界电场的作用下，带电物质向所带电荷相反电极方向的移动，由于蛋白质所带电荷不同，迁移速度不同而彼此分离。影响电泳的主要因素有溶液的pH、电场强度、电泳液的离子强度、电渗的影响，下表是血清5种蛋白质的理化参数。5种蛋白质的理化参数分类PIMWAlb12三、试剂和器材1. 试剂 巴比妥缓冲液（pH8.6）。 氨基黑10B染色液。 漂洗液2. 器材 电泳仪及电泳槽 烧杯、培养皿 滤纸和镊子 醋酸纤维素薄膜四、操作步骤1. 取膜：每组取3张膜，吸干水分，做好标记；2. 点样：距边缘1cm处，在粗糙面分别点A，B，C样；3. 电泳：粗糙面向下置于电泳架上，平衡5min，通电，恒压160-180V（电流强度约为0.4mA/cm），40-60min，关闭电源；4. 染色和脱色：用氨基黑10B染色5min，自来水冲洗，用漂洗液漂洗2-3次。五、实验注意事项1. 点样时点样片要垂直，点样量不能太多；2. 取放点样膜时首先要关闭电源，不许带电操作。