2022年基因工程重点考点归纳.docx

精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -第一章1. 简述基因工程中的四大要素.答：基因工程的四大要素是基因、工具酶、载体、宿主细胞.2. 简述基因工程产生的基础.答：基因工程产生的基础是理论上的三大发觉和技术上的三大创造.1971 年, 史密斯 （Smith H. O. ）等人从细菌中分别出的一种限制性酶,酶切病毒DNA 分子,标志着DNA 重组时代的开头.1972 年伯格（ Berg P.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和噬菌体DNA ,将两种DNA分子用连接酶连接起来,得到新的DNA 分子.1973 年,科恩（ Cohen S.）等进一步将酶切DNA 分子与质DNA 连接起来,并将重组质粒转入 E.coli 细胞中.理论上的三大发觉： （ 1）DNA 是遗传物质（ 2）DNA 双螺旋模型（ Watson/Crick1953）（ 3）确定了遗传信息传递的方式（60 岁月）技术上的三大创造： （ 1）工具酶的使用【Smith和 Wilcox1970流感嗜血杆菌分别纯化了 Hind II其它工具酶（如连接酶）等的发觉分子剪刀和DNA 缝合工具】（ 2）基因运载工具DNA 载体的使用 对质粒的熟悉） 【细菌的致育因子 F 因子 Lederberg 1946 抗药性因子 R大肠杆菌素因（Col ） 】（ 3）逆转录酶的使用【Baltimomore和 Temin 1970各自发觉了逆转录酶】意义： 丰富了“中心法就” 、真核基因的制备成为可能、构建 cDNA文库成为可能.其次章1.简述细菌的限制与修饰系统答：细胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶,即细胞中有限制修饰系统R-M Restriction-modification system . R-M 系统是细菌安内御外的积极措施.依据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要帮助因子,限制与修饰系统至少可分为四类.2.II 型限制性内切酶的特点答：II 型限制性内切酶是同源二聚体,由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成. 识别回文对称序列,在回文序列内部或邻近切割DNA ,产生带3 - 羟基和 5 -磷酸基团的 DNA产物,需Mg2+ ,相应的修饰酶只需SAM.其识别序列主要为4-6bp ,或更长且呈二重对称的特别序列.3.举例：你使用过的工具酶,用于做什么？应当留意的问题T4 DNA连接酶. T4 DNA 连接酶的分子量为68 kDa ,催化 DNA5 磷酸基与3羟基之间形成磷酸二酯键.应留意的问题是连接反应条件需要ATP,如在 16反应,大约需4 小时.如在4反应,就需反应过夜.可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 1 页,共 8 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -第三章1. 简述蓝白斑挑选的原理.假如插入的目标基因较小,仅使用蓝白斑挑选合适吗？对于白色菌落仍需要做哪些进一步的鉴定？答：蓝白斑挑选是重组子挑选的一种方法：是依据载体 - 互补的遗传特点挑选重组子.宿 主大肠杆菌的DNA 的短区段, lacZ M15基因 : 缺失-半乳糖苷酶中第11-41 个氨基酸的 lacZ基因,无酶学活性.而载体一般带有lacZ : N- 端 140 个氨基酸的lacZ 基因, 其产物无酶学活性.在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS ）,它并不破坏读框,但可使少数几个氨基酸插入到 -半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能,这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶C 端部分序列的宿主细胞.因此,宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性,但它们同时存在时,可形成具有酶学活性的蛋白质.这样, lacZ 基因在缺少近操纵基因区段 的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补,称为-互补.由 -互补而产生的 LacZ+ 细菌在诱导剂IPTG 的作用下,在生色底物X-Gal 存在时产生蓝色菌落,因而 易于识别.然而,当外源DNA 插入到质粒的多克隆位点后,由于插入片段较大,几乎不行防止的导致无 -互补才能的氨基端片段,使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落.这种重组子的挑选,又称为蓝白斑挑选.对于较小的基因片段,由于其可能无法完全阻挡 -互补,通常会显现假阴性.如要进一步确认,可对白斑提取质粒,再对质粒进行双酶切,电泳以确定,所取白斑的菌中含有目的基因.2.作为克隆载体应具备哪些条件？比较pBR322, pUC19 和 pUC119 相同和不同点？答：克隆载体应具备的条件：1 具有复制起点2 具有抗菌素抗生基因（3）具如干限制酶单一识别位点（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数.pBR322 与 pUC19 相比：共同点： pUC19 和 pUC119 从 pBR322 改造得来的,它们含有相同的ori 和氨苄青霉素抗性基因. pUC119 由 pUC18/19 增加了一些功能片段改造而来.不同点：（ 1）pUC19 抗性基因的DNA 核苷酸序列已经发生了变化,不再含有原先的核 酸内切限制酶的单识别位点,（ 2） pUC19 含有大肠杆菌 -半乳糖酶基因（lacZ ）的启动子及其编码 -肽链的 DNA 序列,此结构特称为 lacZ 基因（ 3）pUC19 含有位于 lacZ基因中的靠近 5 -端的一段多克隆位点（ MCS ）区段,但它并不破坏该基因的功能. （ 4）pUC19 的分子量比 pBR322 小的多,只有 2686bp（ 5） pBR322 仍含有四环素抗性基因.pUC19 与 pUC119 相比, pUC119 多了 M13 噬菌体 DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列（IG ） .3.为什么在帮助噬菌体M13K07 帮忙下可以有效的制备ssDNA.答：M13K07的突变基因产物优先与克隆于噬菌粒pUCll8 和 pUCll9 中的病毒复制起点的作用,这就使噬菌粒正链DNA 能够优先合成,以确保在细胞所产生的病毒颗粒中来自噬菌粒的单链 DNA能够占据优势.第四章 & 第五章1.对比以下各组概念：（1）克隆载体、表达载体和穿梭载体可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 2 页,共 8 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -（2） plasmid, phagemid and cosmid（3） PAC, BAC and Y AC答:（ 1）克隆载体 :以扩增或储存DNA 片段为目的的载体,一般具有复制起点,抗菌素抗生 基因,如干限制酶单一识别位点和较小的分子量和较高的拷贝数.表达载体是在常规克隆载体的基础上衍生而来,主要增加了增强子,以及有利于表达产物分泌、分别或纯化的原件,进行 DNA 重组的目的是要获得表达产物.相对于克隆载体来说增加了表达元件,基本骨架是最简洁的质粒克隆载体中的复制起点和氨苄青霉素抗性基因,表达形式主要是融合蛋白的形式, 表达载体除了供应复制属性外,主要是形成一种表达所必需的环境.穿梭载体能够在两类不同宿主中复制、增殖和挑选的载体,主要为质粒载体,相对与克隆载体和表达载体而 言,穿梭载体至少含有两套复制单元和两套挑选标记,相当于两个载体的联合.穿梭载体一般在大肠杆菌中保藏、扩增,然后将其转到目标宿主中.（2） plasmid: 质粒,指的是染色体外能进行自我复制的双链闭合环状DNA 分子,通常一个质粒含有一个Ori 以及与此相关的顺式作用元件,复制方式分为严谨型和放松型且具有不相 容性和转移性.phagemid 是噬菌粒,指的是带有丝状噬菌体大间隔区的质粒载体,是集质粒和丝状噬菌体的特点于一身的载体,具有ColE1复制起点及抗生素抗性挑选标记,以及丝状体噬菌体的间隔区,由于基因蛋白存在有利于产生ssDNA ,带有这种质粒的细菌被M13 丝状噬菌体感染后,在基因蛋白影响下质粒复制方式发生转变.Cosmid 是黏粒,指的是质粒的衍生物,是带有cos 序列的质粒,组成包括质粒的复制起点、抗性基因、cos 位点,可以像质粒一样转化和增殖.（3） YAC（酵母人工染色体载体）: 结构上能够模拟真正酵母染色体的线状DNA 分子,其工作状态是线状的,YAC载体以环状的形式存在,增加了大肠杆菌质粒载体的复制元件和挑选标记,以便储存和增殖.其中复制元件是其核心组成成分,有ARS、TEL 、CEN ,挑选标记主要是采纳养分缺陷型基因.BAC （细菌人工染色体载体）:其与常规克隆载体的核心 区分在于其复制单元的特别性,BAC复制单元来自F 质粒,其载体的低拷贝数可以防止嵌 合体的产生, 削减外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用,其标记基因是氯霉素抗性基 因. PAC（ P1 人工染色体载体） ：PAC 载体结合了P1 载体和 BAC 载体的正确特性,相当于P1 噬菌体的改进载体.2. 简述用 YAC 为载体时,重组菌的挑选方法.答： YAC载体的挑选标记主要是采纳养分缺陷型基因,如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷基因 trp1、leu2 和 his3, 尿嘧啶合成缺陷型基因ura3,以及赭石突变抑制基因sup4.其宿主酵母菌的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变ade2-1.赭石突变酵母菌在基本培育基上形 成红色菌落,当带有赭石突变抑制基因sup4 的载体存在于细胞中时,可抑制ade2-1 基因的突变效应,形成正常的白色菌落.第一步挑选：养分互补挑选,其次步挑选：看颜色转变是否表现出插入抑制基因致其失活.3. 简述 pET 表达系统,如何掌握外源基因的表达？答：有两套系统可掌握外源基因的严谨表达,一套是通过宿主掌握T7 RNA 聚合酶的量来实 现的,即在宿主细胞中引入一个带有T7 噬菌体的溶菌酶编码基因的质粒,如 pLysS 或 pLysE ,它们分别低量和高量表达T7 噬菌体的溶菌酶.该溶菌酶可抑制T7 RNA聚合酶的活性,从 而削减在未诱导情形下外源基因的表达.另一套是使启动子的掌握效应更严谨,在pET 载体上装载ac基因,提高阻抑物的浓度.同时也可利用T7-lac 启动子（在T7 启动子序列下 游装入一个由25bp 组成的 lacO 操纵子序列） ,当阻抑物结合在lacO 位点时,即使存在T7可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 3 页,共 8 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -RNA 聚合酶,外源基因也无法表达.只有当诱导物存在时,才能解开T7 RNA 聚合酶基因和外源基因表达的双重阻遏.4. 为什么采纳增加融合标签的技术,表达外源基因？答：由于当蛋白表达以后,有效的分别纯化或分泌就成为获得目的蛋白的关键因素.通过融合蛋白的形式表达,并利用载体编码的蛋白或多肽的特别性质,可对目的蛋白进行分别和纯 化.用作分别的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽（Tag）,常用的有谷胱甘肽S 转移酶、六聚组氨酸肽、蛋白质A 和纤维素结合域等,其主要是由于这样可以分别纯化目的蛋白.第五次1.比较各组概念： （ 1）琼脂糖电泳、PAGE、PFGE（ 2） southern blotting 、northern blotting 、 western blotting（ 3） RT-PCRDD-RT-PCRReal time PCR答：（ 1）琼脂糖电泳：用于DNA 的分别、检测和纯化.检测DNA 是否真的存在、是否有 降解现象,以及DNA 经限制性内切酶酶切后其产物的大小如何.对0.8-10kb 的 DNA 分别成效正确.PAGE：即聚丙烯酰胺凝胶电泳.检测小分子核酸的大小（如小相对分子量RNA 、寡核苷酸、 DNA 序列分析等） ,或在同位素标记的情形下分析单链核酸（如分别寡核苷酸探针和 DNA 测序等）.对 100 bp-1kb 的核酸分别成效正确.PFGE：即脉冲场凝胶电泳.分别大相对分子质量的DNA 的片段.原理是用一种交替 变化电场方向的电泳,以肯定的角度并以肯定的时间变换电场方向,使DNA 分子在微观上按“ Z”字形向前泳动,从而达到分别大相对分子质量的DNA 片段的目的.针对50kb或100kb 以上,甚至Mb 级的大片段DNA .（2） southern blotting: 即将 DNA 片段从琼脂糖凝胶转移到滤膜上,然后进行分子杂交,在滤膜上找到与核酸探针有同源序列的DNA 分子.该技术主要用来判定某一生物样品中是否存在某一基因,以及该基因所在的限制酶切片段的大小.前提是必需有探针.northern blotting: 与 Southern 杂交相像, 只是在 Blotting 过程中转移的是RNA .主要用来检测细胞或组织样品中是否存在与探针同源的mRNA 分子,从而判定在转录水平上某基 因是否表达,在有合适对比的情形下,通过杂交信号的强弱可比较基因表达的强弱.western blotting ：将蛋白质样品从SDS-PAGE 凝胶通过电转移方式转移到滤膜的方法,称为 Western 印迹转移.该技术与Southern 杂交相像,只是在Blotting 过程中转移的是蛋白质.其主要应用于检测细胞或组织样品中是否存在能被某抗体识别的蛋白质,从而判定在翻译水平上某基因是否表达.（3） RT-PCR：即反转录PCR.以反转录的cDNA 做模板所进行的PCR 反应,用于测定基 因表达的强度,仍可用于鉴定已转录序列是否发生突变,呈mRNA 多态性,克隆mRNA 的5'和 3'末端序列,以及从特别少量的mRNA 样品构建大容量的cDNA 文库.DD-RT-PCR ：即差异显示PCR.用于检测相像生物材料的基因表达谱差异的一种方法,是 PCR 和反转录有机结合并深化应用的产物.Real time PCR ：即实时定量PCR.通过特定设计的PCR 仪器来实时检测PCR 扩增过程每一轮循环产物的累积数量,可以很好的推算模板的起始浓度.2. 简述从生物材料中分别纯化DNA 和 RNA 时应当留意什么.可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 4 页,共 8 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -答：第一要保证DNA 和 RNA 不变性.然后留意提取溶液的浓度,pH 等.此外,就是要提取周期短, 周期越长提取成效越差.步骤尽量简洁, 过于繁琐的步骤会让生物大分子活性降 低.对于 RNA ,由于 RNA 酶相对来说特别耐高温,因此应留意RNA 酶在各种器物上的残留问题.为了防止RNA 降解,一般要在样品中加入RNA 酶抑制剂.提纯过程中的副产物 也是需要考虑的因素,要保证他们不能影响提纯工作的进行.3. 简述 PCR 原理和应当留意问题.答：DNA 聚合酶在dNTP 等底物存在时在引物的引导下沿着模板DNA 合成互补的DNA 链.经过 20-40 个循环（变性、退火、延长3 个热反应过程可称为一个循环）可扩增得到大量位于两条引物之间序列的DNA 片段.留意问题：长度：至少16 bp,通常为18-30 bp ,更短的引物一般会降低扩增的特异性,但会提高扩增的有效性.解链温度（Tm 值）：两个引物之间的Tm 值差异最好在2-5.对于小于20个碱基的引物其Tm 值可用简易公式运算即Tm=4 （ G+C） +2（ A+T ）.防止引物内部或引物之间存在互补序列（3 个碱基）,削减引物二聚体以及引物内部二级结构的形成. GC 含量尽量掌握在40%-60% 之间, 4 种碱基的分布应尽可能匀称.尽量防止嘌呤或嘧啶的连续排列,以及T 在 3末端的重复排列.引物的3末端最好是G 或 C,但不要GC 连排.4. 简述 Sanger 双脱氧链终止法测序的原理.答：双脱氧核苷酸分子的脱氧核糖的3'位置的 -OH 缺失, 当它与其他正常核苷酸混合在同一 个扩增反应体系中时,在 DNA 聚合酶的作用下, 虽然它也能够像正常核苷酸一样参加DNA 合成,以其5'位置的磷酸基团与上位脱氧核苷酸的3'位置的 -OH 结合,但是,由于它自身3'位置 -OH 缺失,致使下位核苷酸的 5'磷酸基团无法与之结合.也就是说,一旦双脱氧核苷酸整合到正在合成的 DNA 链中,该股 DNA 的合成就到此终止.基于双脱氧核苷酸的这种特性,建立了以双脱氧链终止反应为基础的 DNA 序列测定的方法.第十一章1.如何保证cDNA 文库的质量？（1） RNA的提取（例如异硫氰酸胍法,盐酸胍有机溶剂法,热酚法等等,提取方法的挑选主要依据不同的样品而定）.（2）要构建一个高质量的cDNA文库,获得高质量的mRNA是至关重要的,所以处理mRNA样品时必需认真当心.（3）由于RNA酶存在全部的生物中,并且能抗击诸如煮沸这样的物理环境,因此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要.（4）文库构建要挑选合适的载体,常规用的是噬菌体,这是由于 DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端,可用来构建柯斯质粒,这种质粒能容纳大片段的外源DNA .（5）胶回收前电泳槽,电泳板,梳子等都要用1% 的 HCl 浸泡过夜.（6）胶回收时电压要稳固.可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 5 页,共 8 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -2.总结获得目的基因的方法.一、直接猎取1.从基因文库中猎取（用限制性内切酶直接猎取法）.利用 噬菌体载体构建基因组文库的 一般操作程序如下：选用特定限制性内切酶,DNA 进行部分酶解,得到DNA 限制性片段选用适当的限制性内切酶酶解 噬菌体载体DNA . 经适当处理, 将基因组DNA限制性片段与 噬菌体载体进行体外重组.利用体外包装系统将重组体包装成完整的颗 粒.以重组噬菌体颗粒侵染大肠杆菌,形成大量噬菌斑,从而形成含有整个DNA 的重组 DNA 群体,即文库.2.cDNA 文库法（反转录法） .cDNA 文库,是指聚集以某生物成熟mRNA 为模板逆转录而 成的 cDNA 序列的重组DNA 群体. 虽然可用基因组文库法来猎取真核生物的目的基因,但是由于高等真核生物基因组DNA 文库比其cDNA 文库大得多,相关工作量同样大得多.更 为重要的是, 在真核生物基因组中合有大量的间隔序列或内含子,但在大肠杆菌等原核生物中没有类似序列的存在,所以大肠杆菌不能从真核生物基因的初级转录本中去除间隔序列,即不能表达真核生物 DNA .而在真核生物成熟 mRNA 中已不存在间隔序列 （已在拼接过程中被去除）,所以可以以真核生物成熟 mRNA 为模板, 逆转录而成的 cDNA 可被大肠杆菌表达.因此,在基因工程中, cDNA 文库法是从真核生物细胞中分别目的基因的常用方法.3.鸟枪法 （散弹射击法） .用限制酶将供体细胞中的DNA 切成很多片段,将这些片段分别载入运载体,然后通过运载体分别转入不同的受体细胞,让供体细胞所供应的DNA （外源 DNA ）的全部片段分别在受体细胞中大量复制,从中找出含有目的基因的细胞,再用肯定的方法吧带有目的基因的DNA 片段分别出来.用“鸟枪法”猎取目的基因的优点是操作简便,缺点是工作量大,具有肯定的盲目性.二、人工合成1.通过 DNA 自动合成仪, 用固相亚磷酸酰胺法合成,一般适于分子较小而不易获得的基因.对于大的基因一般是先用化学合成法合成引物,再利用引物获得目的基因.2.聚合酶链反应Polymerase Chain Reaction ,PCR 是 80 岁月中期进展起来的体外核酸扩增技术.它具有特异、敏锐、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点.能在一个试管内将所要讨论的目的基因或某一DNA 片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观看和判定.可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析讨论和检测鉴定.第十三章1.描述根癌农杆菌介导的已基因转化过程.（1）农杆菌对受体的识别.（2）农杆菌附着到植物受体细胞.（3）诱导和启动毒性区基因表达.（4）类似结合孔复合体的合成和装配.（5） T-DNA 的加工和转运.（6） T-DNA 的整合.（7） T-股（ T Strand）转入植物细胞,整合到寄主基因组中.（8） T DNA 基因表达,使植物细胞增殖并产生冠瘤碱.可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 6 页,共 8 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -2.Vir 区表达的蛋白是如何发挥其生物学作用的？答：受伤植物产生酚类物质（如烟草组织产生的乙酰丁香酮）诱导 Ti 中 VirA 基因的表达,编码一种结合在膜上的化学信号受体蛋白VirA 受体蛋白C 端活化,组氨酸残基磷酸化 激活 VirA 蛋白磷酸集团转移至VirG VirG 编码 DNA 结合活化蛋白VirG 蛋白结合于vir 启动子的特定区域作为转录激活因子,打开VirB 、VirD 、VirE 基因簇.3.什么是报告基因？报告基因应具备的条件？答：报告基因是指其编码的产物能够很快被测定、常用于判定外源基因是否胜利导入受体细胞（器官或组织） ,是否启动表达的一类特别用途的基因.它的应用不依靠于外界挑选压力的存在.既可以作为一种转基因的鉴定方法,也可以作为转基因帅选的一种手段.*抱负的报告基因的基本要求：（2）它的产物是唯独的,且不会损害受体细胞.（1）受体细胞中不存在相应的內源等位基因的活性.（3）具有快速、廉价、灵敏、定量和可重复性的检测特性.第十四章1.比较： gene knock-out, knock in and knock down:答：基因敲除（gene knock-out ）是针对序列已知功能未知的序列,以同源重组的手段,用外源基因来替换所检测的内源基因,从而通过挑选重组体,检验并估计该片段的生物学功能.基因敲除的载体一般由两段与基因组内靶基因座序列同源的DNA 片段组成, 中间为正向标记,同源臂外侧为负挑选基因.基因敲入（ gene knock in ）是利用基因同源重组,将外源基因（基因组原先不存在、或已失活的基因）,转入细胞与基因组中的同源序列进行同源重组,插入到基因组中,在细胞内获得表达的技术. 敲入结构类似于敲除载体,区分在于：或用外源基因替换并失活靶基因,或在不影响靶基因功能的情形下插入新的基因, 或在染色体上特定位点插入新的外源基因, 从而实现基因转移, 并使得外源基因高效表达. 即在敲除的同时又加入了一个新基因, 其后的挑选原理和过程都是相同的.基因下调（ knock down ）即 RNA 干扰,他通过干扰RNA 分子的作用达到转录后基因缄默的效应,也是讨论基因功能的一种方法.2.何谓基因打靶？画图描述同源重组细胞系挑选原理：基因打靶是通过外源基因与靶细胞染色体上的同源序列间的同源重组,将外源基因定点整合到靶细胞特定的位置上,而使某一个特定位点上的基因发生定点突变的技术.他是以同源重组和胚胎干细胞技术为基础,来讨论生物体内某基因功能的一种技术.载体-P tk1 2 P neor2靶基因1 2定点整合 1 2 P neor2该细胞是抗G418可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 7 页,共 8 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_资料word 精心总结归纳 - - - - - - - - - - - -随机整合 -P tk1 2 P neor2 白细胞既抗G418 ,又对 GANC 敏锐第十五章1.简述酿酒酵母表达载体的类型和特点.答：主要类型有：附加型和整合性.附加型表达载体多为大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达载体,使用 pUC 质粒的复制起点和氨苄青霉素抗性挑选标记.酵母部分通常包括酵母菌2um 质粒的复制区,用于酵母转化的挑选元 件主要是养分缺陷相关基因如：HIS4 ,LEU2 等,这类载体能独立于酵母染色体之外复制,常以 30 或更多拷贝存在,但没有挑选压力时的不稳固.表达盒式结构中启动子常用乙醇脱氢酶启动子PADH1 、半乳糖诱导型启动子PGAL ,分泌信号用自身 -交配因子的分泌信号,终止子用 CYC1 基因的转录终止子.整合型没有酵母中复制的质粒复制区, 而是利用同源片段将载体整合到染色体上. 他也有用于酵母转化的挑选元件, 和原核生物部分的复制起始序列以及某种抗性基因. 这类载体稳固性高,但拷贝数比较低.2.简述毕赤酵母表达载体特点.答：毕赤酵母是一种以能在以甲醇为唯独碳源的培育基上生长的酵母,他具有以下的生物学特点：1.甲醇代谢所需的醇氧化酶被分选到过氧化物酶体中,形成区域化.2.以葡萄糖作碳源时,菌体中只有1 个或很少几个小的过氧化物酶体.3.以甲醇作碳源时,过氧化物酶体几乎占到整个细胞体积的80% ,醇氧化酶 AOX 增至细胞总蛋白的35%-40% .4.强的乙醇氧化酶基因AOX1 启动子.表达的蛋白质具有活性,且表达量高12g/L .可高密度发酵培育120g/L .糖基化程度低：8-14 个甘露糖.可编辑资料 - - - 欢迎下载精品_精品资料_学习资料 名师精选 - - - - - - - - - -第 8 页,共 8 页 - - - - - - - - - -可编辑资料 - - - 欢迎下载