实验-细胞化学染色POX.ppt
细胞化学染色,沧州医专医学技术系 侯振江,细胞化学染色，是一种以形态为基础，结合运用化学或生物化学技术对血细胞内各种化学成分作定位、定性及半定量分析的方法。 用于研究血细胞生理、病理和化学结构； 临床上为某些血液病的诊断、鉴别诊断、疗效观察、预后监测和发病机制的探讨，提供重要依据。,血细胞化学染色的基本要求是在原位显示细胞成分和结构，反应产物应是有色沉淀物，具有一定的稳定性。 血细胞化学染色可显示糖原、脂类、酶、蛋白质等。,（一）固定 固定有物理法与化学法， 物理法为干燥和火焰固定， 化学法最常用的是甲醛、乙醇、丙酮和醋酸等。,血细胞化学染色流程,（二）显示 1、偶氮偶联法：利用人工合成的酶底物，在酶作用下，产生分解产物，再与重氮盐结合引起偶氮偶联，使其形成不溶性的偶氮色素，以此证明酶的存在。 2、联苯胺法：粒细胞和单核细胞中的过氧化物酶作用于过氧化氢，释放新生态氧，使无色的联苯胺形成蓝色沉淀。,3、普鲁士蓝法：细胞内、外铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成蓝色亚铁氰化铁沉淀。 4、雪夫反应：过碘酸氧化细胞内糖类中乙二醇基形成乙醛基，醛基与雪夫试剂作用，使无色品红形成红色沉淀。 5、金属沉着法 其他尚有物理学方法，如脂溶性染料染色（显示脂质）、荧光显示、放射自显影以及体外活体染色亦常用于临床血液细胞学诊断。,（三）细胞化学定量 粗略估量，以染色反应的强弱，受色的深浅，人为地区别为阴性和各种程度的阳性。 百分法，只能反映细胞阳性率，不能反映受色强弱。 积分法，是常用的半定量法，将等级估量与百分率相结合它既反映了细胞阳性率的高低，又反映了细胞受色的强弱。,下面介绍几种常用的细胞化学染色方法 这些方法学在白血病的鉴别诊断上具有重要意义。,一、过氧化物酶染色（POX）,（一）四甲基联苯胺法(TMB) 【原理】 粒细胞和单核细胞的胞浆内的髓过氧化物酶（POX orMPO）分解过氧化氢，释放新生态氧，使无色联苯胺氧化成蓝色联苯胺，后者进一步变成棕色化合物沉着于细胞质内。,POX,新生态氧 O,过氧化氢 （基质中）,四甲基联苯胺TMB （无色）,联苯胺蓝（蓝色）,亚硝基铁氰化钠,蓝色颗粒 （浆内酶部位）,粒、单核 细胞胞浆,【原理】,四甲基苯醌二胺,(棕色),自我脱氢氧化,【试剂】 1%TMB 亚硝基铁氰化钠饱和溶液 1%过氧化氢溶液 稀过氧化氢溶液 瑞氏染色液,【操作】 1. 取0.1%TMB乙醇溶液lml，加亚硝基铁氰化钠饱和溶液10l，混合溶液呈淡棕黄色。 2. 在新鲜干燥的血片上，加混合溶液0.5ml, 放置lmin后，再加稀过氧化氢溶液0.7ml，染色6min 。 3. 瑞氏染液复染1520min 。 4. 油镜镜检。,【结果】 细胞质内有蓝黑色颗粒者为阳性。 （） 无颗粒沉着； （） 颗粒细小 ，分布稀疏； （+） 颗粒较粗，局灶分布； （+） 颗粒粗大，分布较密，占胞质 1/22/3； （+） 颗粒粗大，呈团块分布； （+） 全部胞质均部满颗粒，可覆盖胞核。,骨髓片POX染色,【临床意义】 （1）粒系： POX主要分布在粒细胞和单核细胞内，随着粒细胞成熟的程度而逐渐增强，中性分叶核粒细胞为强阳性。 嗜酸性粒细胞阳性程度最强，其阳性颗粒比中性粒细胞粗大，有折光。 碱性粒细胞为阴性。,（2）单核细胞： 原始单核细胞为阴性反应， 幼稚单核细胞和成熟单核细胞呈弱阳性反应，颗粒细小，弥散分布。,（3）其他细胞 淋巴细胞、浆细胞、幼红细胞、组织细 胞、巨核细胞均呈阴性反应。 （4）血小板过氧化物酶 主要定位于幼稚型巨核细胞的核膜上，可作为原巨核细胞的一种标志物，有助于FAB M7的识别。,（5）过氧化物酶染色 主要用于鉴别急性白血病类型， 急性髓细胞白血病多呈阳性反应，以M3和M2型反应最强，MI和M5型反应较弱， 故有助于区别M3和M5型。 急性淋巴细胞白血病呈POX阴性反应，故为急性髓细胞和淋巴细胞白血病鉴别的重要指标。,注意事项,涂片应新鲜制作、厚薄适宜。 TMB 配制在8588的乙醇溶液中染色效果较好，勿用9095乙醇，否则细胞表面蛋白质很快凝固，妨碍试剂向胞内渗入而使显色反应减弱或消失。 过氧化氢溶液需新鲜配制，其浓度与加入量不能随意更改。涂片中粒细胞看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，即表示过氧化氢过浓。若过氧化氢加于血片上不产生气泡，则示无效。 染色液适宜pH值应为5.5，若pH值 <5.0会出现假阳性结果。 试剂应置于低温暗处，防止光线照射失效。 染色时加稀过氧化氢溶液之后必须与染色液充分混匀，否则同一片子上细胞染色情况不一致。,AML-M1,M1 - POX(+),二、苏丹黑B染色,【原理】 苏丹黑B (sudan black B , SB )是一种能溶解于脂肪中的色素染料，可使细胞内的中性脂肪、磷脂和类固醇着色，即使细胞内微细结构的脂类物质也能显示出来。,【试剂】 1. 10%甲醛液。 2. 苏丹黑B乙醇溶液,【操作】 1干燥血片或骨髓片在甲醛蒸气中固定。 2自来水冲洗。 3放人染色液中，37 染色3060min。 4用70%乙醇脱色12min，水洗lmin。. 5瑞氏染液复染2030min。,【结果】 脂类呈黑色或棕黑色颗粒，定位于细胞浆中 （+） 颗粒很小，细小、稀疏，或胞质局部面积的1/4有致密的颗粒。 （+）颗粒较少，或胞质面积的1/2出现黑色颗粒。 （+）颗粒较密，或胞质面积的3/4出现黑色颗粒。 （+） 颗粒极密，颗粒间无间隙。,【临床意义】 1. 粒细胞系 早幼粒及以下阶段随着细胞成熟，阳性颗粒逐渐增加。 早期原粒细胞一般为阴性，少数细小点状颗粒代表线粒体被染色 晚期原粒细胞可出现阳性颗粒，其颗粒限于胞浆的某一区域。,2. 单核细胞系 阳性，颗粒细小，分布弥散，形状不规则。原单核细胞为阴性。 3红细胞系、淋巴细胞系均呈阴性反应 4尼曼一匹克细胞和戈谢细胞均为阳性反应。,5苏丹黑B和过氧化物酶染色临床意义相似，主要用于急性白血病类型的鉴别。 苏丹黑B染色较过氧化物酶染色更敏感，但特异性不如过氧化物酶染色（极少数急性淋巴细胞白血病可为阳性）。,M1-SBB(+),M2-SBB(+),三、过碘酸一雪夫（PAS)染色,【原理】 胞浆内存在糖原或多糖类物质（如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖脂等）中的乙二醇基（CHOH-CHOH）经过碘酸（periodic acid）氧化，转变为二醛基（CHO-CHO），与雪夫(Schiff )试剂中的无色品红结合，形成紫红色染料而沉积于胞浆中。该反应称为过碘酸一雪夫(PAS)阳性反应。,【结果】 （1）粒细胞系： 原粒细胞多呈阴性反应，也可弱阳性。 自早幼粒细胞以后随着细胞的成熟程度，阳性反应逐渐增强。 嗜酸粒细胞颗粒本身不着色，但颗粒间的胞质呈弥漫性阳性反应； 嗜碱粒细胞为阳性反应，颗粒紫红色，大小不一。,中性粒细胞糖原含量参考标准 （-） 胞质无颗粒 （+） 胞质呈淡红色，无颗粒 （+） 胞质呈红色，有少量颗粒 （+） 胞质呈暗红色 ，颗粒较密 （+）胞质呈紫红色，颗粒极密,过碘酸-Schiff反应(PAS),（2）淋巴细胞系： 大多数淋巴细胞呈阴 性反应， 少数为（+）的阳性反应。 淋巴细胞糖原含量程度参考标准 （-） 胞质内无颗粒 （+） 胞质内有颗粒 （+） 有较粗红色颗粒 （+） 有粗大红色颗粒 （+） 颗粒粗大并有红色块状,（3）红细胞系： 幼红细胞和红细胞呈阴性反应 红细胞系列糖原含量程度参考标准 （-） 胞质无颗粒 （+） 有少数红色颗粒 （+） 有较粗红色颗粒或弥漫红色 （+） 有粗大红色颗粒或深红色 （+）有粗大红色块状或紫红色,（4）巨核细胞： 巨核细胞和血小板染色反应均为阳性 巨核细胞糖原含量程度参考标准 （-） 胞质无颗粒 （+） 少量糖原包涵体 （+） 中等量糖原包涵体，定位于核膜 出或分散胞质中，占胞质1/3 （+）大量糖原包涵体分散于胞质的1/2 （+）糖原包涵体充满整个胞质,PAS 巨核细胞,巨核细胞包涵体,（5）单核细胞呈阴性或阳性，颗粒细小，往往位于胞质边缘； 浆细胞大多呈阴性，少数为红色颗粒阳性； 组织细胞为阴性反应； 巨噬细胞可呈阳性，为红色颗粒反应。,【临床意义】 （1）M6与巨幼贫的鉴别 M6的幼红细胞PAS可呈强阳性，积分明显增高，巨贫、再障、溶贫时PAS反应为阴性。 （2）急性白血病的类型鉴别 ALL，PAS呈大块状阳性，也可是阴性，AML为阴性，急性单核细胞白血病时原单核细胞及幼单核细胞PAS阳性，积分增高，阳性颗粒小而多，呈弥散分布。,ALL-L1,L1 PAS(+),AML-M5,M5 PAS(+),AML-M6,AML-M6 PAS(+),AML-M7,M7 PAS(+),（3）巨核细胞和Sternberg细胞鉴别 巨核细胞PAS强阳性，Sternberg细胞为阴性或弱阳性。 （4）戈谢氏细胞强阳性，尼曼-皮克细胞阴性或弱阳性。 （5）淋巴肉瘤、霍奇金病等，淋巴细胞的糖原积分增高；一般的病毒感染，糖原积分在正常范围内。,四、中性粒细胞碱性磷酸酶染色,偶氮偶联法（Kaplow法） 【原理】中性粒细胞胞浆中的碱性磷酸酶在pH 9.29.8缓冲液中，能水解磷酸萘酚钠，并释放出磷酸与萘酚。再以重氮盐与萘酚偶联成不溶性有色偶氮染料沉淀于胞浆中。,【结果】 坚牢蓝RR阳性为紫黑色颗粒， 坚牢紫酱GBC阳性为棕红色沉淀。 “一”阴性反应，胞浆中无阳性染色颗粒。 “”胞浆中含有少量颗粒或呈弥散浅红色（或弥散紫色）。 “2”胞浆中含有中等量颗粒或弥散受色。 “3”胞浆中有丰富的颗粒或弥散深色，胞核清晰。 “4”有极丰富的粗大颗粒，充满胞浆，或弥散深色，胞核不清晰。,中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP),偶氮偶联法,NAP积分法 计数100个成熟中性粒细胞，按其反应强度分级，各级百分率与其级数乘积的总和，即为积分。 例如： NAP反应结果（%） （-） （+） （+） （+） （+） 20 40 20 15 5 积分=（020）+（220）+（315）+（45）=145 参考值：正常人血细胞碱性磷酸酶除成熟中性粒细胞（杆状核及分叶核）可见阳性外，其他血细胞均为阴性。 中性粒细胞NAP活性积分值一般为1050分，但有时可高达162分。,【临床意义】 （1）生理变化： 新生儿NAP增高，成人较儿童减低，老人更低；激烈运动增高； 月经期经前增高，行经后降低，经后期恢复正常； 妊娠期2-3月轻度增高，以后逐渐增高，分娩时达到高峰，产后恢复正常。,（2）、病理变化 增高：严重化脓性感染、类白血病反应、AA、CML加速期、ALL、CLL、恶性淋巴瘤、癌转移、MM、真红、骨髓纤维化等。 减低：PNH、CML、恶性组织细胞病、MDS。,（3）疾病鉴别诊断 慢粒与类白的鉴别：CML减低，类白增高。 急性白血病的鉴别：AML减低，ALL增高。 PNH与AA鉴别：PNH减低，AA增高。 病原微生物的鉴别：病毒感染减低，细菌感染增高。,NAP (+),CML-NAP(-),五、骨髓铁染色,【原理】正常人骨髓中的贮存铁主要存在于骨髓小粒和幼红细胞中，骨髓中的铁在酸性环境下与亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝反应，形成蓝色的亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁的部位，从而反映骨髓中铁的储存量。化学反应过程为： 4 Fe3+ 3 K4Fe（CN）6 Fe4Fe（CN）6312 K+ （含铁物质） （亚铁氰化钾） （亚铁氰化铁）,【结果】 （1）细胞外铁的观察 ： 细胞外铁呈蓝色的颗粒状、小株状或团块状。 以油镜观察定级标准 （-） 无铁粒可见。 （+） 少数铁粒或铁小珠。 （+） 较多铁粒和铁小珠。 （+） 很多铁粒、铁小珠和少数小块。 （+）极多铁粒、铁小珠并有很多小块，密集成堆。 正常范围：+，“+”占2/3，“+”占1/3。,细胞外铁,（2）细胞内铁观察： 细胞内铁指有核红细胞胞质内出现蓝色颗粒，以油镜计100个中、晚幼红细胞，记录胞质中含有蓝色小颗粒（即铁粒红细胞）的比值。并根据细胞铁颗粒的数目、大小、染色深浅和颗粒分布情况，将铁粒幼红细胞分为如下四型：,型：仅含1-2个铁颗粒。 型：含3-4个铁颗粒。 型：含6-9个以上铁颗粒。 型：10个铁颗粒。 正常范围：30% 90% ，平均60%， 多见型，少见型，无、型。,细胞内铁,（3）环形铁粒幼红细胞： 指含铁颗粒6个，其中2/3以上铁颗粒围绕核周排列成完整环形或不完整环形。 正常或非铁粒幼细贫血无环形铁粒幼细胞，铁粒幼细贫血中环形铁粒幼细胞6% 。,环形铁粒幼细胞,【临床意义】 1缺铁性贫血时， 骨髓细胞外铁明显减少，为“一”“士”，细胞内铁平均5.9%，仅为I型。 经有效铁剂治疗后，外铁增多。 因此骨髓铁染色是诊断缺铁性贫血及指导铁剂治疗的重要方法。,2铁粒幼细胞性贫血时， 外铁“2”一“3”，内铁平均70%，其铁粒粗大，以 型为主，出现较多环形铁粒幼细胞。 因此，本实验是诊断铁粒幼细胞贫血的有效方法。 MDS也可出现环形铁粒幼细胞。,3. 非缺铁性贫血 如巨幼细胞贫血、溶血性贫血、再生障碍性贫血等骨髓铁正常或不同程度的增加。 但再生障碍性贫血不会出现环形铁粒幼细胞，可作为与MDS鉴别的参考。 4. 继发性贫血的部分患者细胞内铁可减少，但细胞外铁不减少。,谢谢！,
