凝胶过滤及离子交换层析介质.ppt

关于凝胶过滤及离子交换层析介质现在学习的是第1页，共54页又称为分子筛层析又称为分子筛层析、凝胶层析或排阻层析凝胶层析或排阻层析, ,是利用凝胶的网状结构根据分子大小进行分离的一种方法。 凝胶过滤所用的凝胶过滤所用的是由是由。凝胶珠的内部是多孔的网状结构凝胶珠的内部是多孔的网状结构。单个凝胶珠本身象单个凝胶珠本身象“筛子筛子”,不同不同类型凝胶的筛孔的大小不同。类型凝胶的筛孔的大小不同。现在学习的是第2页，共54页凝胶过滤示意图凝胶过滤示意图现在学习的是第3页，共54页的工作原理的工作原理现在学习的是第4页，共54页凝胶过滤层析过程示意图小分子进入葡聚糖珠内小分子进入葡聚糖珠内大分子不能进入珠内，经珠之大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出间缝隙流出凝胶基质凝胶基质凝胶珠凝胶珠带网孔的葡带网孔的葡聚糖珠聚糖珠现在学习的是第5页，共54页凝胶过滤的基本原理：凝胶过滤的基本原理：含有尺寸大小不同含有尺寸大小不同分子的样品进入层析柱后，分子的样品进入层析柱后，不能通不能通过孔道扩散进入凝胶珠体内部，过孔道扩散进入凝胶珠体内部，可以可以通过部分孔道，通过部分孔道，可通过任意孔道扩散可通过任意孔道扩散进入珠体内部。从而使得进入珠体内部。从而使得小分子移动最慢小分子移动最慢, ,中等分子次之中等分子次之，不同分子尺寸的分子先后顺序，不同分子尺寸的分子先后顺序不同流出层析柱，达到分离的目的。不同流出层析柱，达到分离的目的。现在学习的是第6页，共54页1 1、常见凝胶种类：、常见凝胶种类：（1 1）葡聚糖凝胶：）葡聚糖凝胶：商品名称为商品名称为SephadexSephadex。市售有。市售有 Sephadex Sephadex G10-G200G10-G200。G G 后的数字为凝胶吸水值的后的数字为凝胶吸水值的1010倍。倍。G G反应凝胶反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。的交联程度、膨胀程度和分部范围。（2 2）琼脂糖凝胶：）琼脂糖凝胶：商品名称为商品名称为SepharoseSepharose或或Bio-Gel ABio-Gel A，琼脂，琼脂糖是从琼脂中分离制得的，这种凝胶的优点是孔径大，排阻糖是从琼脂中分离制得的，这种凝胶的优点是孔径大，排阻极限高。极限高。SepharoseSepharose2 2B,4B,6BB,4B,6B。（3 3）聚丙烯酰胺凝胶）聚丙烯酰胺凝胶 ( (商品名称为商品名称为Bio-gel P)Bio-gel P)： Sephacryl S100,S200,S300,S400Sephacryl S100,S200,S300,S400。一种人工合成的凝胶，一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联而成。交联剂以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。越多，孔隙度越小。 注：（注：（1 1）和（）和（2 2）属于多糖类骨架的介质，（）属于多糖类骨架的介质，（3 3）属于合成）属于合成大分子骨架的介质。大分子骨架的介质。一、凝胶过滤介质一、凝胶过滤介质现在学习的是第7页，共54页2 2、凝胶介质应具备的条件、凝胶介质应具备的条件介质本身为介质本身为，不与溶质、溶剂分子发生任何，不与溶质、溶剂分子发生任何作用；作用；应应，以减少非，以减少非特异性吸附，提高蛋白质的收率；特异性吸附，提高蛋白质的收率；介质内介质内，即孔径分布较窄；，即孔径分布较窄；凝胶凝胶；介质要有介质要有，易于消毒。易于消毒。现在学习的是第8页，共54页现在学习的是第9页，共54页现在学习的是第10页，共54页凝胶装置图凝胶装置图色谱峰和分离结果色谱峰和分离结果现在学习的是第11页，共54页3 3、凝胶过滤的优点、凝胶过滤的优点分离条件温和分离条件温和, ,蛋白质不易变性蛋白质不易变性, ,收率高收率高, ,重现性好；重现性好；工作范围广工作范围广, ,分离分子量的覆盖面大分离分子量的覆盖面大（几百到数百（几百到数百万）；万）；设备简单设备简单, ,易于操作易于操作, ,周期短周期短, ,可连续使用多次可连续使用多次（几（几百次甚至几千次百次甚至几千次）。现在学习的是第12页，共54页4 4、色谱柱的重要参数、色谱柱的重要参数(1)(1)柱体积：柱体积：柱体积是指凝胶装柱后，柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到从柱的底板到凝胶沉积表面的体积凝胶沉积表面的体积。在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶。在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床，因此柱体积又称床，因此柱体积又称“床床”体积，常用体积，常用Vt 表示。表示。外水体积：外水体积：色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，常用水体积，亦称间隙体积，常用Vo表示。表示。内水体积：内水体积：因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，这部分间隙的总和仍有空间，液体可进入颗粒内部，这部分间隙的总和为内水体积，常用为内水体积，常用Vi表示。表示。 不包括固体不包括固体支持物的体积支持物的体积（VgVg）。）。支持物的体积（支持物的体积（VgVg） 现在学习的是第13页，共54页(2) (2) 峰洗脱体积：峰洗脱体积：指被分离物质通过凝胶柱所指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液的体积需洗脱液的体积，常用，常用VeVe 表示。表示。 当使用样品的体积很少时，（与洗脱体积比较可当使用样品的体积很少时，（与洗脱体积比较可以忽略不计），在洗脱图中，从加样到峰顶位置以忽略不计），在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为所用洗脱液体积为VeVe。 当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。置。 当样品很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开当样品很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。始到洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。 现在学习的是第14页，共54页5 5、凝胶过滤的用途、凝胶过滤的用途脱盐脱盐: :用于无机盐和生物大分子的分离，上样量大用于无机盐和生物大分子的分离，上样量大, ,为为凝胶体积的凝胶体积的1/41/41/5,1/5,流速大于流速大于200cm/h200cm/h。分级分离分级分离: :用于分离分子大小相近的物质，通常为大用于分离分子大小相近的物质，通常为大分子物质的分离。必须采用孔径适当、分离范围与分子分子物质的分离。必须采用孔径适当、分离范围与分子大小相适应的凝胶，上样量小，仅为床体积的大小相适应的凝胶，上样量小，仅为床体积的5%5%10%10%。分子量测定分子量测定 理论上柱长加长理论上柱长加长 有利于分离效果的提高，有利于分离效果的提高， 但实但实际上却对操作不利。际上却对操作不利。现在学习的是第15页，共54页6 6、流动相、流动相用作流动相的溶剂用作流动相的溶剂; ;与固定相凝胶性质相似，与固定相凝胶性质相似，。当采用软。当采用软性凝胶时，溶剂应性凝胶时，溶剂应。，高粘度溶剂往往限制分子，高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分离效果，尤其是具有低扩散扩散作用而影响分离效果，尤其是具有低扩散系数的高分子量试样。系数的高分子量试样。：现在学习的是第16页，共54页1) 常用磷酸盐和硫酸盐进行离子强度的调节常用磷酸盐和硫酸盐进行离子强度的调节2) )用氯化钠作离子剂，疏水作用最小用氯化钠作离子剂，疏水作用最小3)pH)pH值不能太低，因为值不能太低，因为H H+ +会腐蚀不锈钢柱会腐蚀不锈钢柱常用的有四氢呋喃、甲苯、邻常用的有四氢呋喃、甲苯、邻二氯苯、二氯乙烷、氯仿、苯二氯苯、二氯乙烷、氯仿、苯、二甲基甲酰胺和水等。、二甲基甲酰胺和水等。现在学习的是第17页，共54页一般来说，生物化学领域常采用水溶一般来说，生物化学领域常采用水溶性溶剂，称为性溶剂，称为凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱；在合成高分子化学领域，常采用有机在合成高分子化学领域，常采用有机溶剂，称为溶剂，称为凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱。四氢呋喃四氢呋喃是最常用的流动相，它对是最常用的流动相，它对样品有样品有，因此被优先推荐使用。因此被优先推荐使用。现在学习的是第18页，共54页凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱流动相的折射率必须尽可能与样品的折射流动相的折射率必须尽可能与样品的折射率有较大的差别。率有较大的差别。凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱使用在检测波长无紫外吸收的溶剂作流动使用在检测波长无紫外吸收的溶剂作流动相相。现在学习的是第19页，共54页流速流速蛋白质分离时，流速对分离度的影响是蛋白质分离时，流速对分离度的影响是一个很重要的因素，一般一个很重要的因素，一般。样品容量样品容量进样体积和样品的浓度将明显地进样体积和样品的浓度将明显地影响蛋白质的分离度。影响蛋白质的分离度。样品的浓度范围一般在样品的浓度范围一般在0.01%-0.5%0.01%-0.5%，最好是高浓度、，最好是高浓度、小体积，在一般范围内可以得到好的分离效果，蛋白质的小体积，在一般范围内可以得到好的分离效果，蛋白质的样品体积为柱体积的样品体积为柱体积的1%-3%1%-3%比较合适。比较合适。现在学习的是第20页，共54页7 7、凝胶过滤基础、凝胶过滤基础 1）估计用量）估计用量 根据选择的层析柱估算出凝胶的用量。根据选择的层析柱估算出凝胶的用量。由于市售的是无水干胶，所以要计算干胶用量：由于市售的是无水干胶，所以要计算干胶用量： 干胶用量干胶用量( (g g) )柱床体积柱床体积( (mlml)/)/凝胶的床体积凝胶的床体积( (ml/gml/g) ) 考虑到损失，故一般凝胶用量再增加考虑到损失，故一般凝胶用量再增加1020(质量质量分数分数)。 现在学习的是第21页，共54页 2)水中膨化水中膨化 一般一般吸水率较小吸水率较小的凝胶（型号较小、排阻极限较小的凝的凝胶（型号较小、排阻极限较小的凝胶）胶）膨化时间较短膨化时间较短，在，在20条件下需条件下需24 h；的凝胶（型号较大、排阻极限较大的凝胶）的凝胶（型号较大、排阻极限较大的凝胶）。加热煮沸加热煮沸则使则使膨化时间大大缩短膨化时间大大缩短，一般在，一般在15 h即可完即可完成，而且煮沸也可以去除凝胶颗粒中的气泡。但应注意成，而且煮沸也可以去除凝胶颗粒中的气泡。但应注意。 琼脂糖凝胶和有些市售凝胶是水悬浮的状态，所以不琼脂糖凝胶和有些市售凝胶是水悬浮的状态，所以不需膨化处理，多孔玻璃珠和多孔硅胶也不需膨化处理。需膨化处理，多孔玻璃珠和多孔硅胶也不需膨化处理。 现在学习的是第22页，共54页 3）排除凝胶中气泡）排除凝胶中气泡 膨化处理后，要对凝胶进膨化处理后，要对凝胶进行纯化和排除气泡。行纯化和排除气泡。，倾泻去除表面的杂质和不均一，倾泻去除表面的杂质和不均一的细小凝胶颗粒。也可以一定的酸或碱浸泡一段时间，的细小凝胶颗粒。也可以一定的酸或碱浸泡一段时间，再用水洗至中性。再用水洗至中性。，否则会影响分离否则会影响分离效果，可以通过效果，可以通过排除气泡。排除气泡。 现在学习的是第23页，共54页 4）凝胶的保存）凝胶的保存 凝胶的保存一般是凝胶的保存一般是。 通常加入通常加入0.020.02( (质量分数质量分数) )的叠氮化钠，的叠氮化钠，44下保存。如果要下保存。如果要较长时间的保存，则要将凝胶洗涤后脱水、干燥较长时间的保存，则要将凝胶洗涤后脱水、干燥; ;l可以将凝胶过滤抽干后浸泡在可以将凝胶过滤抽干后浸泡在5050( (体积分数体积分数) )乙醇中脱水，乙醇中脱水，抽干后再逐步提高乙醇浓度反复浸泡脱水，至抽干后再逐步提高乙醇浓度反复浸泡脱水，至9595( (体积体积分数分数) )乙醇脱水后将凝胶抽干。置于乙醇脱水后将凝胶抽干。置于6060烘箱中烘干，即可装烘箱中烘干，即可装瓶保存。瓶保存。l注意膨化的凝胶不能直接高温烘干，否则可能会破坏凝胶注意膨化的凝胶不能直接高温烘干，否则可能会破坏凝胶的结构。的结构。 现在学习的是第24页，共54页8 8、凝胶层析的基本操作、凝胶层析的基本操作 1 1）层析柱的选择）层析柱的选择层析柱大小层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。层析柱的层析柱的长度长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。，为得到高分辨率，为得到高分辨率，。层析柱的直径和长度比一般在。层析柱的直径和长度比一般在1:251:251:1001:100之间。之间。用于分组分离的凝胶柱，用于分组分离的凝胶柱，如如脱盐柱脱盐柱由于对分辨率要由于对分辨率要求较低，所以求较低，所以一般比较短一般比较短。现在学习的是第25页，共54页2 2 ）装柱（凝胶层析柱）装柱（凝胶层析柱）a.除去气泡的溶胀凝胶应与层析柱除去气泡的溶胀凝胶应与层析柱，装柱，装柱过程中温度也要恒定过程中温度也要恒定;b.应应有利于装柱的凝胶浆有利于装柱的凝胶浆，适当稀释有利，适当稀释有利于装柱过程中气泡的排除于装柱过程中气泡的排除;c.将将，并保证其垂直。，并保证其垂直。d.先向柱内加满洗脱剂，检查是否漏水；再打开出液先向柱内加满洗脱剂，检查是否漏水；再打开出液口，口，特别是要排除床底支持物，特别是要排除床底支持物上的气泡。关闭出液口，使柱中洗脱剂的体积约上的气泡。关闭出液口，使柱中洗脱剂的体积约占总柱体积的占总柱体积的15; 现在学习的是第26页，共54页 e.柱颈接上胶浆贮存器，将柱颈接上胶浆贮存器，将柱内。注意避柱内。注意避免产生气泡免产生气泡; f.柱装好后，停柱装好后，停10min，然后打开出液口，然后打开出液口，; g.柱内柱内。再将恒压洗脱剂。再将恒压洗脱剂瓶与柱上端相连。瓶与柱上端相连。; h.调节恒压洗脱剂瓶的高低位置，调节恒压洗脱剂瓶的高低位置，。检查流。检查流体静力压，不要超过规定值。如果使用蠕动泵，注意使体静力压，不要超过规定值。如果使用蠕动泵，注意使流速不超过稳定后利用重力调节所达到的流速，一般要流速不超过稳定后利用重力调节所达到的流速，一般要低于后者低于后者10。现在学习的是第27页，共54页i.：用一个为该凝胶完全排阻的有色大分子物质作样品用一个为该凝胶完全排阻的有色大分子物质作样品进行层析。层析时，若有色区带移动不整齐，说明柱装进行层析。层析时，若有色区带移动不整齐，说明柱装得不好。此大分子的洗脱体积得不好。此大分子的洗脱体积(Ve)就是该凝胶柱的空就是该凝胶柱的空体积体积(V0)。是平均分子质量为是平均分子质量为2106Da并与蓝色染料偶联的一种葡聚糖，通常用并与蓝色染料偶联的一种葡聚糖，通常用它来测它来测 V0，对于葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和，对于葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和6 以上的琼脂糖凝胶均可用以上的琼脂糖凝胶均可用0.2 浓度的蓝色葡聚糖浓度的蓝色葡聚糖2000，它在，它在265nm及及630nm处都有吸收峰。处都有吸收峰。 现在学习的是第28页，共54页 3）洗脱液的选择）洗脱液的选择在凝胶层析中流动相只是起运载工具的作用在凝胶层析中流动相只是起运载工具的作用，一般不依赖于流动相性质和组成的改变来提高一般不依赖于流动相性质和组成的改变来提高分辨率，分辨率，所以和其他层析方法相，所以和其他层析方法相比，比，凝胶层析洗脱液的选择不那么严格凝胶层析洗脱液的选择不那么严格。现在学习的是第29页，共54页 由于凝胶层析的分离机理简单以及凝胶稳定由于凝胶层析的分离机理简单以及凝胶稳定工作的工作的pH值范围较广，所以洗脱液的选择主要取值范围较广，所以洗脱液的选择主要取决于待分离样品，决于待分离样品，一般来说只要能溶解被洗一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶层析于凝胶层析。为了防止凝胶可能有吸附作用，一般为了防止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定浓度的盐。洗脱液都含有一定浓度的盐。现在学习的是第30页，共54页 4 ）加样量）加样量l加样量的多少要根据具体的实验要求而定加样量的多少要根据具体的实验要求而定凝胶柱较大，加样量较大；样品中各组分相对分凝胶柱较大，加样量较大；样品中各组分相对分子质量差异较大，加样量也可以较大。子质量差异较大，加样量也可以较大。现在学习的是第31页，共54页从洗脱峰上看，从洗脱峰上看，如果所要各个组分的如果所要各个组分的洗脱峰分得很开洗脱峰分得很开，为了提，为了提高效率，可以适当高效率，可以适当增加加样量增加加样量；如果各个组分的洗脱峰只是如果各个组分的洗脱峰只是刚好分开或没刚好分开或没有完全分开有完全分开，则，则不能再加大加样量不能再加大加样量，甚至要减小，甚至要减小加样量。加样量。注意：注意：样品中的不溶物必须在上样前去掉，样品中的不溶物必须在上样前去掉，以免污染凝胶柱以免污染凝胶柱。样品的黏度不能过大，否则会。样品的黏度不能过大，否则会影响分离效果。影响分离效果。 现在学习的是第32页，共54页5）洗脱速度）洗脱速度要恒定而且合适要恒定而且合适方法：方法：a.使用使用恒流泵恒流泵，b.恒压重力洗脱恒压重力洗脱。洗脱速度洗脱速度。洗脱速度慢，样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好，但洗脱速度慢，样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好，但过慢会造成样品扩散过慢会造成样品扩散加剧加剧，区带变宽，反而会降低分辨率，而且区带变宽，反而会降低分辨率，而且实验时间延长。实验时间延长。一般凝胶的流速是一般凝胶的流速是2 210 ml10 mlh h，市售的凝胶一般会提，市售的凝胶一般会提供一个建议流速，可供参考。供一个建议流速，可供参考。现在学习的是第33页，共54页 总之，凝胶层析的各种条件，包总之，凝胶层析的各种条件，包括凝胶类型、层析柱大小、洗脱液、括凝胶类型、层析柱大小、洗脱液、上样量、洗脱速度等等，都要上样量、洗脱速度等等，都要根据根据具体的实验要求来选择具体的实验要求来选择。 现在学习的是第34页，共54页如果被分离的如果被分离的，有，有时带正电荷，有时带负电荷，可用离子交换层析方法时带正电荷，有时带负电荷，可用离子交换层析方法进行分离。进行分离。离子交换层析的离子交换层析的，包括离子交换，包括离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。二、二、 离子交换层析离子交换层析适用于蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物的分离适用于蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物的分离纯化。生化分离中约纯化。生化分离中约75%75%的工艺用离子交换法。的工艺用离子交换法。现在学习的是第35页，共54页1 1、原理、原理: :根据离子交换树脂对需要分离根据离子交换树脂对需要分离的各种离子的亲和力不同而达到分离。的各种离子的亲和力不同而达到分离。主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异进行分离。微小差异进行分离。离子交换树脂通常是离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质，分子中不溶于水的高分子物质，分子中含有可解离的基团含有可解离的基团。含有酸性基团的称为。含有酸性基团的称为阳离子交换阳离子交换树脂树脂，可解离出，可解离出H H+ +，含有碱性基团的称为，含有碱性基团的称为阴离子交阴离子交换树脂换树脂，可解离出，可解离出OHOH- -。现在学习的是第36页，共54页阳离子交换基阳离子交换基强酸性，聚苯乙烯树脂强酸性，聚苯乙烯树脂弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂现在学习的是第37页，共54页阴离子交换基阴离子交换基强碱性，聚苯乙烯树脂强碱性，聚苯乙烯树脂弱碱性，二乙氨乙基纤维素弱碱性，二乙氨乙基纤维素现在学习的是第38页，共54页带有带有SOSO3 3或或COOCOO基团，通常以基团，通常以SOSO3 3NaNa或或COOCOOH H形形式出现的叫做式出现的叫做阳离子交换基阳离子交换基；阳离子交换层析阳离子交换层析：。带有带有N N（C C2 2H H5 5）基团通常以）基团通常以N N（C C2 2H H5 5）ClCl出现的出现的叫做叫做阴离子交换基阴离子交换基。阴离子交换层析：阴离子交换层析：。现在学习的是第39页，共54页+ + + + + + + + + +若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H H+ +发生交换发生交换而结合在树脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物而结合在树脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与质可与OHOH- -发生交换而结合在树脂上。发生交换而结合在树脂上。物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有差异，因物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有差异，因此选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来此选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。，达到分离纯化的目的。+现在学习的是第40页，共54页示意图（交换树脂表面）示意图（交换树脂表面） 现在学习的是第41页，共54页现在学习的是第42页，共54页2 2、常用离子交换剂的种类与特性、常用离子交换剂的种类与特性 1.1.通用型离子交换树脂功能基通用型离子交换树脂功能基：适用于水处理，适用于水处理，湿法冶金，化学合成及医药工业等用途广泛的湿法冶金，化学合成及医药工业等用途广泛的离子交换树脂。离子交换树脂。2.生化专用离子交换介质生化专用离子交换介质：主要用于生化领域，主要用于生化领域，一般是凝胶过滤介质的衍生物，其骨架、粒径、一般是凝胶过滤介质的衍生物，其骨架、粒径、排阻极限等与母体相似。有纤维素类、葡聚糖排阻极限等与母体相似。有纤维素类、葡聚糖系、琼脂糖系、聚乙烯醇系等系、琼脂糖系、聚乙烯醇系等8类。类。详见教材详见教材P183184。现在学习的是第43页，共54页生化用离子交换剂的特点生化用离子交换剂的特点1、亲水性及生物相容性：、亲水性及生物相容性：都都以天然大分子为主，依此特性选用含亲以天然大分子为主，依此特性选用含亲水基团的单体开发合成刚性或半刚性的离子水基团的单体开发合成刚性或半刚性的离子交换剂。交换剂。现在学习的是第44页，共54页2、孔结构、孔结构：有有3种结构：种结构：凝胶孔（凝胶孔（溶胀时孔变大溶胀时孔变大）；）；大孔树脂（大孔树脂（孔在干、湿态都存在孔在干、湿态都存在）；）；琼脂糖介质的孔（琼脂糖介质的孔（孔径大小与琼脂糖浓度有关孔径大小与琼脂糖浓度有关）。）。3、电荷密度、电荷密度：电荷密度要适当。电荷密度要适当。4、粒度、粒度：粒径小，分布均匀则分离效果好。粒径小，分布均匀则分离效果好。5、纯度：、纯度：分工业级，分析级，生物技术级，分子分工业级，分析级，生物技术级，分子生物级。生物级。现在学习的是第45页，共54页3 3、全交换容量和工作容量、全交换容量和工作容量全交换容量全交换容量:每克干介质或每毫升湿介质具每克干介质或每毫升湿介质具有的功能基含量，是一个定值。有的功能基含量，是一个定值。工作容量工作容量:每克干介质或每毫升湿介质在一定的每克干介质或每毫升湿介质在一定的操作条件下的交换吸附蛋白质的实际容量，是一个操作条件下的交换吸附蛋白质的实际容量，是一个变值。变值。现在学习的是第46页，共54页4、离子交换层析的基本操作、离子交换层析的基本操作 （1）层析柱）层析柱 离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱，离子交换用的层析柱一般层析柱，离子交换用的层析柱一般粗而短，不宜过长粗而短，不宜过长。直径和柱长比一般为直径和柱长比一般为1 1：10101 1：5050之间，层析柱安之间，层析柱安装要垂直。装柱时要均匀平整，不能有气泡。装要垂直。装柱时要均匀平整，不能有气泡。现在学习的是第47页，共54页（2）装柱）装柱 先把柱内装满起始缓冲液，赶尽气泡并把先把柱内装满起始缓冲液，赶尽气泡并把柱子垂直固定；柱子垂直固定；将交换剂用起始缓冲液调稀将交换剂用起始缓冲液调稀搅匀后加入，搅匀后加入，柱内的交换剂应非常均匀地分布，柱内的交换剂应非常均匀地分布，不应出现节面和气泡，不能干柱，床面平整，床不应出现节面和气泡，不能干柱，床面平整，床高距柱顶高距柱顶2 23cm3cm为宜；为宜；现在学习的是第48页，共54页 （3）平衡缓冲液）平衡缓冲液 平衡缓冲液指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱平衡缓冲液指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。的缓冲液。平衡缓冲液的离子强度和平衡缓冲液的离子强度和pHpH值的选择值的选择首先要保证各首先要保证各个待分离物质（如蛋白质）的稳定。个待分离物质（如蛋白质）的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的其次是要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。结合有较大的差别。l一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合。一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合。而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定。而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定。 现在学习的是第49页，共54页（4）上样上样上样时注意样品液的离子强度和上样时注意样品液的离子强度和pH值，值，上样量以上样量以柱床柱床体积的体积的1%-5%(体积分数体积分数)为宜为宜，使样品能吸附在层，使样品能吸附在层析柱的上层，得到较好分离效果。析柱的上层，得到较好分离效果。将柱中的缓冲液逐渐放出，使顶部液面达到近于将柱中的缓冲液逐渐放出，使顶部液面达到近于柱床面时开始加样。柱床面时开始加样。用注射器或细长的玻管用注射器或细长的玻管沿柱壁绕环加入酶样沿柱壁绕环加入酶样，待样液，待样液达一定高度后达一定高度后再在柱中间小心加样再在柱中间小心加样。现在学习的是第50页，共54页（5）洗脱缓冲液）洗脱缓冲液 一般常用梯度洗脱一般常用梯度洗脱方式：改变离子强度和改变方式：改变离子强度和改变pH值。值。改变离子强度通常是在洗脱过程中改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子逐步增大离子强度强度，使各组分被洗脱下来；，使各组分被洗脱下来；改变改变pHpH值的洗脱，值的洗脱，阳离子交换剂一般是阳离子交换剂一般是pHpH值从低到高值从低到高洗脱洗脱，阴离子交换剂一般是阴离子交换剂一般是 pH pH 值从高到低值从高到低。 由于由于pHpH值可能对蛋白的稳定性有较大影响，故值可能对蛋白的稳定性有较大影响，故一般通常一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱。采用改变离子强度的梯度洗脱。 现在学习的是第51页，共54页(6) 洗脱速度洗脱速度洗脱速度通常要保持恒定洗脱速度通常要保持恒定。l洗脱速度慢比快的分辨率要好，但速度过慢会造成分离时间长、样品扩散、谱峰变宽、分辨率降低等副作用，所以所以要根据实际情况选择合适的洗脱速度要根据实际情况选择合适的洗脱速度。l如果洗脱峰相对集中某个区域造成如果洗脱峰相对集中某个区域造成，则应适当，则应适当或降低洗脱速度来提高分辨率；如果分辨率或降低洗脱速度来提高分辨率；如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高洗脱速度。较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高洗脱速度。现在学习的是第52页，共54页 （7）样品的浓缩、脱盐）样品的浓缩、脱盐 离子交换层析得到的样品往往盐的离子交换层析得到的样品往往盐的质量分数较高，而且体积较大，样品质质量分数较高，而且体积较大，样品质量分数较低。所以一般离子交换层析得量分数较低。所以一般离子交换层析得到的样品要到的样品要浓缩、脱盐浓缩、脱盐处理。处理。现在学习的是第53页，共54页感谢大家观看感谢大家观看9/1/2022现在学习的是第54页，共54页