间接免疫荧光(6页).doc
-间接免疫荧光-第 6 页间接免疫荧光法检测Ad-LMP2表达EBV-LMP2蛋白的活性1 材料和仪器293细胞大鼠抗LMP2单克隆抗体FITC标记山羊抗大鼠IgG抗体荧光显微镜2 检测方法2.1 293细胞接种到24孔板中, 1.52.0×105个细胞/孔，37，5% CO2培养箱培养过夜，细胞生长成片。2.2 每个细胞孔感染2.0×106VP供试品重组腺病毒，同时设置293细胞阴性对照孔。37，5% CO2培养箱培养两天，细胞完全病变。2.3 收集 293细胞。用PBS洗涤两次，重悬到100µlPBS缓冲液中，每孔10µl涂于细胞片上，室温自然晾干。2.4 将细胞片置于4丙酮中固定15分钟，PBS洗两次，室温晾干。2.5 PBS浸泡10min，用PBS（含0.05%Triton-X100）浸泡通透25min。2.6 用10%胎牛血清室温封闭40min。2.6 细胞孔使用1：20 PBS稀释抗体，置于湿盒中，37孵育1小时。PBS洗89遍，保持湿润。2.7 覆盖1：40稀释的FITC标记（PBS稀释）的羊抗大鼠IgG，置于湿盒中，37孵育30分钟。PBS洗89遍，室温晾干。(如用PBS有颗粒沉淀)2.8 伊文氏蓝负染5分钟。超纯H2O洗3遍，室温晾干。2.9 50%甘油封片。2.10 显微镜下观察照相。3 结果判定显微镜下观察阴性对照孔细胞呈红色，供试品孔细胞可以看到明显的绿色荧光，即判定为阳性。检测结果应为阳性。注：1、每一步均需晾干，细胞浓度可以比较高。2、水洗效果要好，无盐粒子颗粒。3、丙酮固定过夜效果较好。PBS稀释。当然最好用封闭液直接稀释，再加一点TritonX100效果好。培养液成分太多了。而且固定之后细胞都死了，用培养液没什么意义，只要保证其pH等条件适合就好了。抗体说明书上都会有推荐的稀释倍数。上网查一下，有很多protocol。一般一比几百到一万都有，依抗体而定。可以4度过夜，这样染色效果好。二抗一般较便宜，一般1：50到1：200多。Jdzhangwenjun5251. 直接免疫荧光法测抗原（1）基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。（2）试剂与仪器l 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4l 荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释l 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制l 搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）l 有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）l 荧光显微镜l 玻片架l 滤纸l 37温箱等。（3）实验步骤 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（+）荧光明亮；（+ +）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“+”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。（4）注意事项1)对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。2)染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。染色温度多采用室温（25左右），高于37可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2的低温，延长染色时间。低温染色过夜较3730 min效果好的多。3)为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。 标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。 阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。4)一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。2.间接免疫荧光法测抗体（1）基本原理染色程序分为两步，第一步，用未知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上，在湿盒中37保温30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG抗体。如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗体。（2）试剂与仪器l 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4l 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。l 荧光标记的抗人球蛋白抗体：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释 。l 搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）l 有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）l 荧光显微镜l 玻片架l 滤纸l 37温箱等。（3）实验步骤1)滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原标本片，10min后弃去，使标本片保持一定湿度。2)滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒内，37保温30min。3)取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗1-2次，然后按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不时振荡 。4)取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加一滴一定稀释度的荧光标记的抗人球蛋白抗体。5)将玻片平放在有盖搪瓷盒内，37保温30min。6)重复操作3。7)取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴缓冲甘油，再覆以盖玻片。8)荧光显微镜高倍视野下观察，结果判定同直接法。（4）注意事项1)荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4保存4h，时间过长 ，会使荧光减弱。2)每次试验时 ，需设置以下三种对照： 阳性对照：阳性血清+荧光标记物 阴性对照：阴性血清+荧光标记物 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物3. 已知抗原标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。4. 所滴加的待检抗体标本或荧光标记物，应始终保持在已知抗原标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。For immunof luorescence analysis, cells were grown on coverslips, fixed in 4% paraformaldehyde for 20 min, and permeabilized with 0.5% Triton X-100 (Sigma) in PBS for 15 min, both at room temperature.
