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植物生物技术,第十一章 转基因植物的分子检测及安全评价,Good afternoon,第一节 转基因植物的检测 第二节 转基因植物的安全性评价,本章主要内容,第11章 转基因植物的分子检测 及安全性评价,本章教学目的与要求,转基因植物检测方法 人们对转基因安全性的几类问题,第11章 转基因植物的分子检测 及安全性评价,第一节、转基因植物的检测,外源基因是否进入受体植物细胞 进入植物细胞的外源基因是否整合到植物染色体上 整合到染色体上的外源基因是否表达 能否产生理想的目的表型,一、外源基因整合状态检测,（一）、PCR 检测方法 检测报告基因或目的基因 快捷、简易、灵敏等优点,1. 引物的设计与合成,2. 模板DNA的制备 PCR对模板DNA的质量要求不高，可以直接利用细胞裂解液，或用快速微量法（CTAB或SDS法）制备基因组DNA 要有阴性对照和阳性对照,8,3. 反应体系与循环参数,反应体系：DNA模板，dNTP，Taq DNA聚合酶，buffer 反应程序： 变性 ( 9495oC) 复性 延伸 ( 3755 oC) ( 7072 oC ) 72 oC延伸10min 30-35cycles DNA扩增100万倍,转基因棉花再生植株的NPT-报告基因的PCR检测 M：1Kb的分子量标准；P：质粒；C：非转基因对照； 1-27：转化再生植株,4. 扩增产物检测,5. PCR检测的特点： 检测迅速 灵敏度高，可以检测到纳克级外源DNA 操作方便，对DNA质量要求不高 不足之处在于假阳性偏高、不能提供整合位点的遗传信息,（二）. Southern杂交及拷贝数检测,基因的碱基序列，与含有标记的探针发生同源配对，杂交后能产生杂交印迹或杂交带的转化植株为转基因植株；未产生杂交印迹或杂交带的为非转基因植株 选择不同的内切酶和探针组合，根据杂交带的片断大小及数目，可以判断外源基因的插入位点的整合情况及插入的拷贝数,1. 植物总DNA提取 CTAB: 十六烷基三乙基溴化铵是一种去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，在低盐溶液中，复合物在溶液中沉淀，在高盐溶液中是可溶的，再加入乙醇使核酸沉淀。 SDS法：高浓度的SDS在较高的温度下裂解细胞，高盐低温下沉淀多糖及蛋白质，然后用乙醇沉淀DNA,2. DNA纯度及浓度的检测： 琼脂糖凝胶电泳 0.8% 植物DNA呈现分子量较大的清晰条带 如果DNA 条带呈弥散状，表明降解 如果在小分子量区存在较亮的条带，说明含RNA 如果点样孔较亮，表明样品含杂质 紫外分光光度法： OD260/ OD260 =1.8 OD260/ OD260 1.8 含较多RNA OD260/ OD260 <1.8 含较多的蛋白质及其它杂质,3. 总DNA的限制性酶切 选择合适的限制性内切酶 单酶切 酶切反应体系 DNA 5-15ug 体积20-90ul 检测酶切效果 琼脂糖凝胶分离,4. 凝胶电泳分离各酶切片段 凝胶厚度 0.5cm以上 样品及上样量 含分子量质量标准DNA，阳性对照，阴性对照 低电压、长时间电泳 1V/CM 电泳16小时,5. 凝胶变性及转膜 双链DNA变性成为单链，用0.5M NaOH+1.5M NaCl 硝酸纤维素膜 尼龙膜 毛细管转移法 电转移法 真空转移法,5. 预杂交及杂交 预杂交：在加入探针前用封闭剂封闭膜上的非特异性位点 封闭剂：变性的非特异DNA，鲑鱼精DNA 高分子化合物：PVP+BSA+Ficoll400 杂交膜在预杂交液中，37-42温育3-12小时 杂交：加入杂交探针，65保温摇床过夜 洗膜：2*SSC0.1*SSC洗膜,6. 杂交信号的检测 同位素标记的探针通过放射性自显影检测 非同位素探针采用酶反应检测,转基因棉花再生植株的Southern分子杂交图,灵敏度高（可检测1pg的DNA样品），特异性强（可鉴别20个碱基的同源序列）是目前坚定外源基因整合最权威的方法,HR16 HR18 HR19 HR24 HR26 HR30 HR35 HR37 HR38 HR39 YZ1,二、外源基因表达的检测,基因表达包括转录和翻译两个水平 转录是指以DNA(基因)为模板合成mRNA的过程 翻译是指以mRNA为模板合成蛋白质的过程 检测外源基因的表达包括特异mRNA和特异蛋白质 检测特异mRNA的主要方法是Northern杂交和RT-PCR 特异蛋白质表达的检测方法主要有三种 生化反应检测法 免疫学检测法：Western杂交 生物学活性的检测,Northern杂交DNA和RNA分子之间的杂交 检测目的基因是否转录出mRNA的方法,（一）、Northern 杂交,（二）RT-PCR,原理：RNA的多聚酶反应（RT-PCR）是以mRNA 为模板进行逆转录反应（reverse transcription， RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的RNA模板。,RNA提取： 逆转录体系：RNA、缓冲液、dNTP、逆转录酶、引物（随机引物，Oligo dT; 特异引物) RT-PCR体系：特异性引物、cDNA模板、Taq DNA聚合酶、buffer,利用凝胶成像分析仪对电泳结果进行拍照和结果记录； 观察胶上是否有预扩增的主要产物带。对比目的基因产物的电泳谱带分子量和谱带的特异性，确定和描述谱带特征。,GhUBQ7,GhCIPK6,Western immunoblot analysis of chitinase (chi) gene expression in leaf extract of transgenic cotton lines.,（三）、 Western blot,（四）、生化反应检测法,主要通过酶反应来检测 标记基因的检测（卡那霉素抗性、除草剂抗性） 卡拉霉素抗性检测：在转基因植株的顶端刚展开的幼嫩的叶片上涂抹1%（w/v）的卡那霉素水溶液，7天后，观察叶片涂抹部位的颜色反应来判断结果（黄色为敏感、绿色为抗性）,（五）、生物鉴定法,抗性转基因时，为了测定基因是否转入或者转入的是否表达,可以给转基因植株施加生物胁迫因子, 如果产生抗性,表明转基因理想效果；转Bt 基因的棉花中, 采用抗虫筛选能够最直观地检测到抗虫基因的表达效果,本节完,一、转基因植物的类型,抗病转基因植物：抗病毒转基因烟草 抗虫转基因植物：抗虫棉 抗逆转基因植物：抗旱、抗盐碱 抗除草剂转基因植物：抗除草剂转基因玉米、大豆、棉花、油菜 改良品质转基因植物：转VtA水稻 转基因药品植物：生产霍乱疫苗的胡萝卜,第二节 转基因植物安全性评价,转基因植物的贡献,增加农作物产量 降低生产成本 减少化学农药对环境的污染 改善农作物品质 提高经济效益,抗除草剂作物,转基因植物的生产（图例）,抗虫棉花,抗CMV病毒转基因番茄,抗CMV病毒转基因甜椒,转查尔酮合酶矮牵牛花,二、转基因产品,安全吗?!,转基因生物给人类创造了巨大的经济和社会效益的同时，也可能给人类带来极大的潜在或现实危害。 康奈尔大学斑蝶事件 加拿大“超级杂草”事件 墨西哥玉米事件,1999年5月，康奈尔大学的一个研究组在Nature杂志上发表文章，声称转基因抗虫玉米的花粉飘到一种名叫马利筋的杂草上，用马利筋叶片饲喂美国大斑蝶，导致44的幼虫死亡。斑蝶蝴蝶是北美一种珍稀濒危动物，所以在当时在全世界都引起了很大的反响。 事实上，这一实验结果在科学上没有说服力。因为试验是在实验室完成的，且没有提供使用花粉量的数据。 现在这个事件也有了科学的结论：,第一，玉米的花粉非常重，扩散不远，在玉米地以外米，每一平方厘米马利筋叶片上只找到一个玉米花粉。 第二，2000年开始在美国三个州和加拿大进行的田间试验都证明，抗虫玉米花粉对斑蝶并不构成威胁，实验室试验中用10倍于田间的花粉量来喂大斑蝶的幼虫，也没有发现对其生长发育有影响。 斑蝶减少的真正原因，一是农药的过度使用，二是墨西哥生态环境的破坏,有人认为，外源基因的导入可能会造就某种强势生物，从而破坏原有生物种群的动态平衡和生物多样性。 1995年，加拿大首次商业化种植了通过基因工程改造的转基因油菜。但在种植后的几年里，其农田便出现了对多种除草剂具有耐抗性的野草化的油菜植株，即超级杂草。如今，这种杂草化油菜在加拿大的草原农田里已非常普遍。因为一些转基因油菜籽在收获时掉落，留在了泥土中，来年它们又重新萌发。如果在这片田地上种下去的不是同一个物种，那么萌发出来的油菜就变成了一种不受欢迎的野草，而且这种能够同时抵御三种除草剂的野草化的油菜不但很难铲除，而且还会通过交叉传粉等方式，污染同类物种，使种质资源遭到破坏。 应当指出的是，“超级杂草”并不是一个科学术语，只是一个形象化的比喻，目前并没有证据证明已经有“超级杂草”存在。同时，基因漂流并不是从转基因作物开始，而是历来都有。如果没有基因漂流，就不会有进化，世界上也就不会有这么多钟的植物和现在的作物栽培品种。,2001年发现的一种墨西哥玉米基因污染的问题是比较重要的。还有自然2001年曾经发表文章，关于墨西哥玉米遭到转基因玉米污染的事件。墨西哥本身不种植转基因的玉米，而且有法规规定不允许种植，但是它进口美国的转基因玉米用做饲料。结果可能是有些农民拿转基因玉米去种，种完之后就污染了当地的玉米。墨西哥是玉米的原产地。如果玉米原产地的遗传多样性受到污染，本地的玉米遗传结构受到破坏，产生的污染问题是很严重的。这件事对中国也有很大的启示。中国现在进口转基因大豆，而中国是大豆的原产地，很有可能转基因的大豆会对中国当地原产的大豆，发生遗传污染。因此，现在国家对转基因的大豆控制还是比较严格，不允许种植。,（一）、食物安全,选择标记基因可能编码出对人体有直接毒性的蛋白质； 转基因植物可能会表达出过敏蛋白； 转基因农作物表达出的某些蛋白质，可能会潜移默化的影响人的免疫系统，从而对人体健康造成隐性的损伤 改变农作物品质的基因，可能会改变宿主体内的代谢途径，从而改变转基因食品的营养成分 将动物蛋白基因转入农作物中，是否会侵犯素食者或宗教信仰者的权益？把人的某些基因转入农作物或牛、羊等家畜体内，结果在农作物或家畜的肉、耐中含有人的某些蛋白质，这样做是否违反了人类伦理道德？,（二）、生物安全,1、转基因作物是否会成为“超级杂草”：转基因植物可能会变成野生种类，或者它侵入新的生态区域，破坏了生态平衡后而成为杂草；抗除草剂基因等可能会通过花粉传播或近缘杂交进入到杂草或半驯化植物中，结果产生出超级杂草。 2、具有抗虫功能的转基因植物，其体内产生的抗虫蛋白可能使害虫产生抗性，使害虫变得更加难以防治？现在也已发现具有抗病毒功能的转基因植物，可以使相应的病毒出现抗性。 3、载体介导的外源基因可能发生横向转移，重组出新的菌株或病毒。,（三）、环境安全,1、改变了生物的多样性和群落结构，生态系统的稳定性可能会遭到破坏。转基因生物是自然界中不存在的“人工制造”的生物，它们所具有的强大的生存竞争将使处于脆弱平衡状态的农田生态系统等遭到破坏。 2、对非目标生物的危害将直接影响到对生物多样性的保护,正是由于以上种种 忧虑，人们对转基 因食品充满了恐惧 和担心。,三、转基因食品安全性管理,（一）安全性评价的目的 转基因食品的安全性评价是安全管理的核心和基础之一，转基因食品的安全评价目的是从技术上分析生物技术及其产品的潜在危险，对生物技术的研究、开发、商品化生产和应用的各个环节的安全性进行科学、公正的评价，以期在保障人类健康和生态环境安全的同时，也有助于促进生物技术的健康、有序和可持续发展。,对转基因食品安全性评价的目的： 1、提供科学决策的依据； 2、保障人类健康和环境安全； 3、回答公众疑问； 4、促进国际贸易； 5、促进生物技术的可持续发展。,（二）安全性评价的原则,1、实质等同性原则 2、个案评估的原则（case by case） 3、预先防范（precaution）的原则 4、逐步评估的原则（step by step） 5、风险效益平衡的原则 6、熟悉性原则（familiarity）,（二）安全性评价的原则 1、实质等同性原则 在1996年FAO/WHO召开的第二次生物技术安全性评价专家咨询会议，将转基因植物、动物、微生物产生的食品分为三类： （1）转基因食品与现有的传统食品具有实质等同性； （2）除某些特定的差异外，与传统食品具有实质等同性； （3）与传统食品没有实质等同性。 实质等同性比较的主要内容有生物学特性的比较，对植物来说包括形态、生长、产量、抗病性及其他有关的农艺性状；对微生物来说包括分类学特性（如培养方法、生物型、生理特性等）、侵染型、寄主范围、有无质粒、抗生素性、毒性等；动物方面是形态、生长生理特性、繁殖、健康特性及产量等。,2、个案评估的原则（case by case） 目前已有300多个基因被克隆，用于转基因生物的研究，这些基因来源和功能各不相同，受体生物和基因操作也不相同，因此，必须采取的评价方式是针对不同转基因食品逐个地进行评估，该原则也是世界许多国家采取的方式。,3、预先防范（precaution）的原则 早在20世纪60年代末斯坦福大学教授Berg尝试用来自细菌的一段DNA与猴病毒SV40病毒连接起来，获得了世界第一例重组DNA。这项研究受到了其他科学家的质疑，因为SV40病毒是一种小型动物的肿瘤病毒，可以将人的细胞培养转化为类肿瘤细胞。如果研究中的一些材料扩散到环境中将对人类造成巨大的灾难。正是转基因技术的这种特殊性，必须对转基因食品采取预先防范作为风险性评估的原则,4、逐步评估的原则（step by step） 转基因生物及其产品的研发是经过了实验室研究、中间试验、环境释放、生产性试验和商业化生产等几个环节。每个环节对人类健康和环境所造成的风险是不相同的。逐步评估的原则就是要求在每个环节上对转基因生物及其产品进行风险评估，并且以前一步的实验结果作为依据来判定是否进行下一阶段的开发研究。 一般，有三种可能： 第一，转基因生物及其产品可以进入下一阶段试验； 第二，暂时不能进入下一阶段试验，需要在本阶段补充必要的数据和信息； 第三，转基因生物及其产品不能进入下一阶段试验。,5、风险效益平衡的原则 （balance of benefits and risks） 发展转基因技术就是因为该技术可以带来巨大的经济和社会效益。但作为一项新技术，该技术所可能带来的风险也是不容忽视的。因此，应该采用风险和效益平衡的原则。 6、熟悉性原则（familiarity） 所谓的熟悉是指了解转基因食品的有关性状、与其他生物或环境的相互作用、预期效果等背景知识。但熟悉并不意味着转基因食品的安全，而仅仅异味着可以采用已知的管理程序；不熟悉也并不能表示所评估的转基因食品不安全。,（三）关于转基因食品安全性评价的内容 1. 过敏原 2. 毒性物质 3. 抗生素抗性标记基因 4. 营养成分和抗营养因子 5. 转基因作为对生态环境可能造成的影响,（三）关于转基因食品安全性评价的内容 1. 过敏原 食物过敏是人类食物食用史上一个由来已久的卫生问题。食物过敏史指在食品中含有某些能引起人产生不适应反应的抗原子，这些抗原子主要是一些蛋白质，这些蛋白质具有对T细胞和B细胞的识别区，可以诱导人免疫系统产生免疫球蛋白E抗体（IgE）。 国际食品生物技术委员会与国际生命科学研究院的过敏性和免疫研究所一起制定了一套分析遗传改良食品过敏性树状分析法。该法重点分析基因的来源、目标蛋白与已知过敏原的序列同源性、目标蛋白与已知过敏病人血清中的IgE能否发生反应，以及目标蛋白的理化特性。,2. 毒性物质 毒性物质是指那些由动物、植物和微生物产生的对其他种生物有毒的化学物质。从化学的角度看，毒性物质包括了几乎所有类型的化合物；从毒理学方面看，毒性物质可以对各种器官和生物靶位产生化学和物理化学的直接作用，而引起机体的各种不良生理效应。 理论上讲，任何外源基因的转入都可能导致遗传工程体产生不可预知的或意外的变化，其中包括多向效应。这些效应需要设计复杂的多因子试验来验证。 模型动物的建立对评价转基因食品的安全性是非常重要的。动物实验是食品安全评价最常用的方法之一，对转基因食品的毒性检测评价涉及免疫毒性、神经毒性、致癌性与遗传毒性等多种动物模型的建立。,3. 抗生素抗性标记基因 美国食品及药物管理局（FDA）评价抗生素抗性标记基因时，认为在采取个案分析原则的基础上，还应考虑： 1、使用的抗生素是否是人类治疗疾病的重要抗生素； 2、是否经常使用； 3、是否口服； 4、在治疗中是否是独一无二不可替代的； 5、在细菌菌群中所呈现的对抗生素的抗性水平状况如何； 6、在选择压力存在时是否会发生转化。,4. 营养成分和抗营养因子 食品的功能就在于它对人类的营养，因此，营养成分和抗营养因子是转基因食品安全性评价的重要组成部分。对转基因食品营养成分的评价主要针对蛋白质、淀粉、纤维素、脂肪等与人类健康营养密切相关的物质。,5. 转基因作为对生态环境可能造成的影响 （1）种群替代实验 （2）转基因植物花粉散布的测度 （3）鉴定转基因存在的方法 （4）外源基因转移的检测 （5）转基因植物潜在风险评估的基本程序 第一步，通过已有知识，将实验对象进行分析分类，判断是属于较高风险一类，还是属于较低风险甚至无风险一类。 第二步，根据第一步的分类进行不同的田间实验，来评价其生态上的表现。 第三步，如果转基因作物经第二步证明具有更高的行为表现，则要进一步检测转基因作物在何种条件下和以什么程度造成潜在危险。,（四）、转基因食品安全性评价应注意的问题 1、在保证人类健康和生态环境的同时，促进转基因食品的发展； 2、小规模试验的结果能否推广应用到大规模商业化生产，需要做具体的分析； 3、转基因食品的安全性评价应进行量化考核； 4、转基因食品安全性评价的方法和标准应实现国际统一化； 5、全食物饲喂进行的动物试验在进行时要十分谨慎，且不能持续时间太长，以避免因营养不平衡等原因掩饰了转基因食品的安全性问题。,（五）、转基因食品的管理,以美国、加拿大为代表的基因工程产品生产和出口大国为代表：针对生物技术产品，而不是生物技术本身； 以欧共体及其成员国为代表：认为基因重组技术本身具有危险性； 介于2者之间，通过政策法规等管理生物安全问题,安全性认证 （1）生产商应提供足够的证据来证明该转基因食品是安全无害的。 （2）转基因食品在世界各国被接受的程度是一个比较重要的参考因素，通常来说，被接受的产品较为可信。 品种管理 品种管理是转基因食品管理的基础，如果对原料品种没有进行必要的管理，就无法确定最终产品是否含有转基因成分。 强制性标注 （1）转基因生物的来源； （2）过敏性； （3）论理学考虑； （4）在成分、营养价值、效果等方面不同于传统食品,（六）中国基因工程产品的安全性管理, 1993年12月24日，国家科委颁布实施了基因工程安全管理办法 1996年7月10日，国家农业部颁布实施了农业生物基因工程安全管理实施办法 2001年6月6日，国务院颁布了农业转基因生物安全管理条例 2002年4月8日，国家卫生部颁布了转基因食品卫生管理办法 2007年，国家卫生部颁布新资源食品管理办法,本章小结与思考题：,1.转基因植株的检测方法有哪些？ 2.谈谈你对转基因食品安全性的看法 3.人们对转基因食品安全性争论有那些方面?,第11章 转基因植物的分子检测 及安全性评价,感谢大家的积极配合与投入,有你的参与生命科学更精彩！,
