抗生素发酵生产工艺处理.ppt

1,第十一章抗生素发酵生产工艺,主讲教师：生科院洪军,2,制药微生物生产菌种如何选育？发酵过程中主要检测的参数有哪些？ 发酵工艺过程如何控制？,知识回顾,3,主要内容,抗生素的概述： （1）抗生素的定义 （2）抗生素的命名 （3）抗生素的分类 青霉素的发酵生产工艺：（重点） （1）青霉素的概述 （2）生产菌的生物学特性 （3）发酵工艺过程,4,1 抗生素的定义和命名 （1）抗生素的定义,早期：一般认为来源于微生物，且主要作用于细菌感染。故认为抗生素(antibiotics)是微生物在代谢过程中产的，在低浓度下就能抑制它种微生物生长和活动，甚至杀死他种微生物的化学物质。由于抗生素的这种杀菌能力，我们曾经把这类物质叫做抗菌素。,5,现在： 来源：随着抗生素研究和生产的发展，新的抗生素的来源正在扩大。可以是微生物、植物（如蒜素、常山碱、黄连素、长春花碱、鱼腥草素等） 、动物（如鱼素、红血球素等） 。但抗生素的工业化生产主要是来自微生物的大量发酵法，微生物是抗生素舞台上的主角。 作用对象：病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生虫、藻类、肿瘤细胞等。因此不能把抗生素仅仅作为抗菌药物。,6,定义：虽然抗生素已被广泛使用，但是由于抗生素的多样性，关于抗生素的定义在专家中一直存在着分歧。 目前，一个大多数专家所接受的定义是：抗生素是由生物（包括某些微生物、植物和动物在内）在其生命活动过程中产生的或（化学合成获得的），能在低浓度下有选择地抑制他种生物机能的低分子量的有机物质。 狭义的定义是：抗生素是低分子量的微生物代谢产物，能在很低的浓度下抑制其他微生物的生长。,7,按生物的来源：凡是在动、植物或微生物产生的，可按来源命名。如青霉素、赤霉素、蒜素 按化学结构命名：化学结构性质清楚的，如四环素（含有四并苯的基本母核），氯四环素（金霉素），氧四环素（土霉素）。,其它：纪念意义、产地、俗名如正定霉素、井冈霉素、金霉素和土霉素等。,（2）抗生素的命名（一般分为三类）,8,natural penicillin R =,CH2-CO-,9,-内酰胺 环,苯甲异噁唑青霉素,氨 苄青霉素,羧苄青霉素,苯氧甲基青霉素,10,2 抗生素的发展简史,2.1治疗和发展 我国的发展： 1953年5月1日，建立了第一个生产青霉素的抗生素工厂（上海第三制药厂）； 1958年6月3日，最大的抗生素联合企业建成投产（华北制药厂,石家庄），也是青霉素发酵总容积居世界首位。 目前，多为原料药基地。但在半合成及成品药的剂型方面与国外相比差距很大。,11,抗生素滥用的重灾区,中国是抗生素使用大国，也是抗生素生产大国：年产抗生素原料大约21万吨，出口3万吨，其余自用（包括医疗与农业使用)，人均年消费量138克左右(美国仅13克)。 2011年4月7日是世界卫生日，首届合理用药大会在这一天召开，恰好契合了世界卫生日的主题“抵御耐药性：今天不采取行动，明天就无药可用”。,12,“后抗生素时代”,如果不再控制抗生素的滥用状态，二十一世纪人类有可能失去抗生素这个有利的治疗武器，重新回到没有抗生素的时代，所谓“后抗生素时代”。 后抗生素时代是倒退，我们可能回到没有药物可使用的状态，大量的传染性疾病将危害人类的身体健康和生命。虽然这是一种悲观的想法，但悲观的很有道理，细菌产生耐药速度比新药物开发的速度快得多，这是一个确实的现象。,13,3 抗生素的分类,可根据生物来源、作用对象、化学结构、作用机制、生物合成途径等方面对抗生素进行分类。 3.1 根据抗生素的生物来源分类 (生物学家) （1）放线菌产生的抗生素：如链霉素、四环类（如四环素）、大环内酯类（如红霉素）、多烯类（如制霉菌素） 、放线菌素类（如放线菌素D）等。（其中链霉菌属最多，诺卡氏菌属、小单孢菌次之） （2）真菌产生的抗生素：如青霉菌属和头孢菌属等分别产生一些很重要的抗生素（青霉素、灰黄霉素、头孢菌素）。,14,（3）细菌产生的抗生素：如多粘杆菌、枯草杆菌、芽孢杆菌等。如多粘菌素。 （4）植物或动物产生的抗生素：从被子植物蒜中制得的蒜素；从动物脏器中制得的鱼素等。 3.2根据抗生素的作用对象分类（医生、病理学家） （1）广谱抗生素：如氨卞青霉素既抑制G+，又抑制G- （2）抗G+的抗生素：如青霉素， （3）抗G-的抗生素：如链霉素 （3）抗真菌的抗生素：如制霉菌素 （4）抗病毒的抗生素：如四环类抗生素对立克次氏体及较大病毒有一定作用。 （5）抗癌的抗生素：如阿霉素,15,3.3根据抗生素的化学结构分类（化学家） 较复杂，目前已确定结构的抗生素习惯如下分类： （1）-内酰胺类抗生素：包括青霉素类，头孢菌素类等 （2）氨基糖苷类抗生素：包括链霉素、庆大霉素等 （3）大环内脂类抗生素：如红霉素、麦迪加霉素 （4）四环类抗生素：如四环素、土霉素 （5）多肽类抗生素：如多粘菌素、杆菌肽 （6）蒽环类抗生素：如阿霉素、柔红霉素 （7）喹诺酮类抗生素：如环丙沙星、诺氟沙星,16,3.4 根据作用机制分类 此种分类的优点：便于进行理论研究，有助于了解抗生素影响病原体新陈代谢的哪些环节，从而找出治疗的规律，使抗生素的使用更为合理。 （1）抑制细胞壁合成的抗生素：如青霉素。 （2）影响细胞膜功能的抗生素：多烯类抗生素。 （3）抑制病原菌蛋白质合成的抗生素：四环素。 （4）抑制核酸合成的抗生素：如影响DNA结构和功能的丝裂霉素C。 （5）抑制生物能作用的抗生素：如抑制电子转移的抗霉素。,17,18,3.5 根据抗生素的合成途径分类 （1）氨基酸、肽类衍生物抗生素：如青霉素类、头孢菌素等寡肽抗生素。 （2）糖类衍生物抗生素：如链霉素等糖苷类抗生素。 （3）以乙酸、丙酸为单位的衍生物抗生素：红霉素等丙酸衍生物。,19,生产方法： 1、生物合成法： 传统方法 “工程菌”制造法 细胞融合技术法 2、化学合成法； 3、生物合成加化学合成法。,4 抗生素的生产工艺,20,1、生物合成法： 传统方法 大多数抗生素是由放线菌和霉菌产生的。菌种是通过从土壤中分离、筛选获得，一般采用深层通风搅拌发酵罐生产。 传统方法目前存在很多不足，因此，人们采用基因工程和细胞融合技术，对抗生素产生菌进行了改造和重新设计，不仅可以制造出许多高效低毒的新型抗生素，还可改革工艺，使抗生素产量成倍地增长。,21, “工程菌”制造法 第一次由“工程菌”制造的全新抗生素麦迪紫红素A，是美国报道的。他们将产放线紫红素的部分基因插入产麦迪霉素的放线菌中，构建的“工程菌”产生了全新的抗生素。 我国新构建的生产丁胺卡那霉素的“工程菌”，就是把酰化酶基因克隆到卡那霉素产生菌中获得的。新的“工程菌” 生产的新抗生素毒副作用小，对耐卡那霉素、庆大霉素致病菌临床疗效显著。,22,细胞融合技术法 对抗生素产生菌采用细胞融合技术的成果更为突出。橄榄色无孢小单孢菌细胞融合株抗生素产率比原菌株提高140倍。 目前DNA重组技术已广泛用于红霉素、链霉素等20多种抗生素的育种工作，可以预见不久将来会有更多的由“工程菌”生产的新型抗生素问世。,23,2、化学合成法 根据某种抗生素的化学组成和结构，通过化学合成的方法，可生产部分抗生素。 如：氯霉素、磷霉素等。 经过化学合成方法和控制条件的不断深入研究，越来越多的抗生素可用化学合成法生产。,24,3、生物合成加化学合成法 许多细菌逐渐出现了抗药性，已经证实某些抗药性因子位于细菌内的质粒上，质粒可以在细菌之间转移，结果抗性菌日益增多，抗生素疗效就越来越低。 为了对付细菌的抗药性，科学家对原有的抗生素进行了“整容手术”，细菌因再无法识别改头换面的抗生素而被抑制或杀死。 现在已能使用克隆了酰化酶基因的“工程菌”（大肠杆菌）高效率的生产半合成抗生素。临床现在使用的贵重特效药物先锋霉素（头孢菌素类）、氨苄青霉素，就是这类半合成抗生素类药物。国外已有几十种这类药物在实验室研制成功。,25,抗生素制备的一般流程图,菌种 孢子制备 种子制备 发酵 发酵液预处理及种子加滤 提取及精制 成品检验,前体,发酵阶段,提取阶段,成品包装,5 青霉素概述,26,27,青霉素的理化性质,青霉素本身为一元酸，可与钾、钠、镁、钙、铝和铵等化合成盐类。 易溶于水，游离酸易溶于醇、酮、醚、酯等一般有机溶剂。 游离酸或盐类的水溶液均不稳定，极易失去抗菌效力。 不耐热，一般保存于冰箱中，但青霉素盐的结晶纯品，在干燥条件下可于室温保存数年。 青霉素的抗菌效力与其分子中的-内酰胺环有关。,28,抗菌作用和临床应用,青霉素主要抑制G+菌，但对某些G-菌，螺旋体及放线菌也有强大的抗菌作用，青霉素的抗菌作用与抑制细胞壁的合成有关。 青霉素临床上用于治疗葡萄球菌传染症如脑膜炎、化脓炎、骨髓炎等，溶血性链球菌传染症如腹膜炎、产褥热，以及肺炎、淋病、梅毒和炭疽等。,29,菌种：产黄青霉 生长发育分七个阶段： 期：菌丝生长期，适宜做种子； 期：青霉素分泌期； 期：菌丝体自溶期。,5.1青霉素生产菌的特性,点青霉,30,青霉素产生菌的生长过程,分生孢子发芽期 菌丝繁殖期 脂肪粒形成期 脂肪粒减少，小空孢 大空孢 自溶,菌丝生长期,青霉素分泌期,菌丝自溶期,第1期：分生孢子萌发，具有小泡。 第2期：菌丝繁殖，嗜碱性，类脂肪小颗粒。 第3期：脂肪包涵体，贮藏物，嗜碱性很强。 第4期：空泡，嗜碱性减弱，开始产生抗生素。 第5期：大空泡，中性染色大颗粒，脂肪包涵体 消失，青霉素产量最高。 第6期：个别细胞自溶，胞内无颗粒，释放氨， pH上升。 第7期：菌丝完全自溶，仅有空细胞壁。,发酵培养下的生长过程及细胞学变化,镜检控制 规定时间取样，显微镜观察7 个时期的 态变化，控制发酵。 1 4 期为菌丝生长期，3 期的菌体适宜 种子。 45期为生产期，生产能力最强，通过 工程措施，延长此期，获得高产。 第6期到来之前结束发酵。,带放补料,工,6.1青霉素生产流程,结晶器,种子罐 1和2,米孢子,预处理罐,过滤器,发酵罐,萃取器,蒸发器,工业盐,提 炼,工,艺,艺,发 冷冻干燥孢子 琼脂斜面 酵 培养基制备,无菌空气,冷至15,6.青霉素发酵工艺过程,(1)、生产孢子制备 斜面种子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成的固 体培养基进行培养，最适温度25-26 ，培养6-8天，形 成单菌落。再传斜面，培养7天，形成绿色斜面孢子。 米孢子：移植到小米或大米固体培养基 上，生长7天，25 注意：每批孢子必需进行严格摇瓶试 验，测定效价及杂菌情况。,6.2 青霉素发酵工艺过程,(2)、种子罐培养工艺 一级种子发酵：发芽罐，孢子萌发，形成菌丝。 培养基：葡萄糖，玉米浆，碳酸钙，玉米油，消沫 剂等。 空气流量1：3（体积比）；充分搅拌300-350rpm； pH自然，温度271, 40h 二级种子罐：繁殖罐，大量繁殖。接种量10 培养基：葡萄糖、玉米浆，玉米油，消沫剂等。 通气量1:1-1.5；搅拌250-280rpm；pH自然，251。 10-14h 质量：菌丝致密，菌丝粗壮，III期，倍增期6-8h,(3)、生产罐培养工艺 三级罐：生产罐；接种量20 培养基：花生饼粉，葡萄糖，尿素，硝酸铵， 硫代硫酸钠，苯乙酰胺，CaCO3, 玉米油, 硅油. 参数条件： 通气量1：0.8-1.2；150-200r/min； 前60小时:pH6.4-6.6，26； 60小时后: pH6.7, 24。,6.3 发酵培养与过程控制 操作方式：反复分批式发酵 发酵罐： 100m3，装料80m3. 带放: 6-10次，带放量10，间隔24h。 发酵周期：180-220h,发酵过程需连续流加葡萄糖、硫酸铵以及前体物质苯乙酸盐，补糖率是最关键的控制指标，不同时期分段控制。,过程控制补料分批操作控制基质浓度 前40小时：培养基中的主要营养物 40小时后：低速连续补加葡萄糖、 氮源和苯乙酸等，维持一定的最适浓度。 半饥饿状态：延长合成期，提高产量。 碳源占成本12以上，采用糖化液流加,降低成本。 糖与6APA结合形成糖基-6APA，影响青霉素产量。,a.流加碳源控制 根据残糖、pH、尾气中CO2和O2含量。 残糖0.3-0.6左右，pH开始升高时流加糖。 葡萄糖的波动范围较窄，浓度过低使抗生素合成 速度减慢或停止，过高则导致呼吸活性下降，甚至 引起自溶。,(1)培养基,b.流加氮源控制 玉米浆: 最好，含有多种氨基酸 及其前体苯乙酸和衍生物。 补加无机氮源： 硫酸铵、氨水、尿素 氨基氮浓度：0.01-0.05%。,c.盐离子控制 无机盐：硫、磷、镁、钾等。 铁对青霉素合成有毒，30-40 ug/ml以下。 罐壁涂环氧树脂保护层。,d.添加青霉素侧链前体 时期：合成阶段 种类：苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、 苯乙酰甘氨酸 毒性：抑制细胞生长和青霉素合成。 策略：低浓度流加 浓度：苯乙酸0.1%，苯乙酰胺0.05-0.08% 控制：保持供应速率略大于生物合成需要。,(2).温度控制 适宜菌丝生长温度30，分泌青霉素25。 20青霉素破坏少，周期很长。 变温控制，不同阶段不同温度。 生长阶段:较高温度，缩短生长时间；生产阶 段适当降低温度，以利于青霉素合成。 前期控制26左右，后期降温控制24,(3). pH控制 合成适宜pH6.46.6左右，避免超过7.0 直接加酸或碱：自动控制 流加葡萄糖：恒速；变速，依赖pH变化快慢。 pH下降：补加CaCO3、通氨、尿素或提高通气量 pH上升：补加糖、生理酸性物质（硫酸铵、油脂）,(4). 溶氧控制 30饱和度，产率急剧下降； 10，造成不可逆的损害。 临界溶氧浓度：30。 通气比：1：0.81.5 。 适宜的搅拌速度:保证气液混合，提高溶氧 调整搅拌转速:各阶段的生长和耗氧量不同。,(5).消沫 天然油脂：玉米油； 化学消沫剂：泡敌。 策略：少量多次。 注意：前期不宜多加入，影响呼吸代谢。,7 青霉素的提炼工艺过程 青霉素不稳定，遇酸、碱、热分解失活 水溶液中不稳定，非极性溶剂中稳定 易溶于有机溶剂，水中溶解度很小 青霉素盐很稳定；降解产物具有致敏性 防止降解，条件温和、快速。,(1)、预处理,青霉素的存在部位：发酵液,浓度较低：1030Kg/m3,含有大量杂质：菌体细胞、核酸、杂蛋白质、细胞壁,多糖等、残留的培养基、色素、盐离子、代谢产物等,目的：浓缩目的产物，去除大部分杂质，改变发酵液,的流变学特征，利于后续的分离纯化过程。,预处理:发酵液加少量絮凝剂沉淀蛋白,(2)、过滤 鼓式真空过滤机过滤： 一次滤液：pH6.2-7.2，略浑，棕黄或绿色，蛋 白质含量0. 5-2.0%。 板框式过滤机过滤： 硫酸调节pH4.5-5.0，加入0.07%溴代十五烷吡 啶，0.07%硅藻土为助虑剂。 二次滤液：澄清透明，用于提取（收率90）,(3)、溶剂萃取 原理：青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而 霉素盐易溶于水。 萃取剂：青霉素分配系数高的有机溶剂。 工业上通常用：醋酸丁酯和醋酸戊酯。 除去蛋白质：加0.05-0.1%乳化剂PPB。 萃取：23次。,逆流萃取过程,正相萃取：酸化pH1.8-2.0，滤液：醋酸丁酯,1：0.3，碟片式离心机分离（浓缩1.5-2.1）,反 相 萃 取 ： pH6.8-7.4 （ 磷 酸 盐 、 碳 酸 盐 缓 冲液）。,把青霉素从丁酯中提取到缓冲液中。,反复萃取23次，达到结晶要求。,萃取条件：10下。萃取罐冷冻盐水冷却。,(4)、脱色 萃取液中添加活性炭，除去色素 过滤，除去活性炭。,(5)、结晶直接结晶 加醋酸钠乙醇溶液反应：得到结晶钠盐。 加醋酸钾乙醇溶液：得到青霉素钾盐。,(5)、结晶共沸蒸馏结晶 萃取液，再用0.5 M NaOH萃取 pH6.4-6.8下得到钠盐水浓缩液。 加 3-4 倍 体 积 丁 醇 ， 16-26 ， 真 空 0.67-1.3KPa）下蒸馏。 水和丁醇形成共沸物而蒸出。钠盐结晶析出。 结 晶 经 过 洗 涤 、 干 燥 （ 60真空16h ） ， 磨粉，装桶，得到青霉素产品。,思考题,（1）青霉素发酵工艺的建立对抗生素工业有何意义？,（2）如何根据青霉素生产菌特性进行发酵过程控制？,（3）青霉素发酵过程的控制原理及其关键点是什么？,（4）青霉素提炼工艺中采用了哪些单元操作，为什么？,