时间分辨荧光免疫分析技术.ppt

时间分辨荧光免疫分析技术,王 征 达瑞抗体,标记免疫学分析技术发展历程,免疫荧光分析(Coons, 1941) 放射免疫分析(Berson和Yalow, 1960) 酶免ELISA (Engvall, 1971) 金标免疫分析(Faulk和Taylor, 1971) 化学发光免疫分析(Arakawa， 1977) 时间分辨荧光免疫分析(Soini和Hemmila，1979) 电化学发光免疫分析(Leland, 1990) 液相芯片(美国Luminex公司, 1997),标记免疫技术的理论检测灵敏度,放射免疫 10-10-10-12 mol 酶联免疫 10-9-10-10 mol 化学发光 10-15 mol 时间分辨荧光 10-18 mol 电化学发光 10-18 mol,一、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）（Time-resolved fluorescence immunoassay）,背景介绍 基本原理 技术特点 反应模式,背景介绍,1979年，芬兰Wallac公司研发部的Soini 和 Hemmila首次提出了建立 稀土离子标记物的“时间分辨荧光免疫分析”理论 1983年，Soini 和 Kojola首先开发出以镧系元素为示踪物的时间分辨 荧光测量仪，建立了新的非放射性微量分析检测技术。同一年， Pettersson等人运用此仪器首次对人绒膜促性腺激素 (hCG)进行了时间 分辨荧光免疫分析 1984年， Hemmila确定了DELFIA(Dissociation Enhanced Lanthanide Fluoroimmunoassay)这种时间分辨免疫分析技术方案,从而使DELFIA成 为Wallac的专利技术 1988年，加拿大CyberFluor公司的Diamandis创立了一种不同于DELFIA 的时间分辨荧光免疫分析，即FIAgen 2003年，时间分辨荧光分析技术获国家科技进步二等奖,基本原理,三价稀土离子包括有铕(Eu)，钐（Sm)，铽 (Tb) ，镝 (Dy) 等，它们的荧光光谱具有特异性强 Stokes位移大寿命长 的特点 DELFIA采用异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕(DTTA-Eu) 为双功能螯合试剂，其一端螯合Eu3+，另一端可与蛋白质的- NH2 连接。在中性或接近中性pH 条件下，DTTA 与Eu3+具 有足够的螯合稳定性，而在增强液（呈酸性）作用下，DTTA- Eu 又能将螯合的Eu3+迅速、彻底地释放出来并与增强液中的 配体螯合进入胶束的疏水内核，使Eu3+荧光得以成千万倍地 放大 FIAgen采用的是以Eu3+螯合物配基BCPDA为标记物， 通过检测其与过量Eu3+形成的螯合物荧光进行定量。由于 BCPDA 的可检测性不够理想，FIAgen 需要利用生物素- 亲合素信号放大来弥补BCPDA 检测灵敏度的不足,DELFIA标记技术,碱性,时间:(s）,0,400,800,1000,340nm激发光,第二个循环,荧光,短寿命荧光,613nm长寿命荧光,延迟时间,测值时间,通过时间延迟，将特异性荧光与非特异性荧光 分辨开来，使理论本底达到0,300,400,500,600,荧光强度,激发光,发射光,波长(nm),Tb,Dy,Eu,Sm,500,发射光强度,200,400,0,延迟时间(s),发射光强度,0,延迟时间(s),TRFIA技术特点,极长的荧光衰退时间 铕：730000ns Stokes位移大 铕：激发光340nm，发射光613nm 狭窄的发射峰 解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍,固相包被抗体,铕标记抗体,孵育,待测抗原,+,+,+,增强液,+,双抗体夹心法示意图,双抗原夹心法示意图,+,+,+,增强液,+,固相包被抗原,待测抗体,铕标记抗原,中和法示意图(回滴定法),+,Eu,+,待测抗体,铕标记抗体,中和抗原,小分子抗原竞争抑制示意图,固相包被二抗,+,增强液,+,+,一抗,时间分辨技术重点和难点,固定相（96孔板） 标准品 铕标记物,二、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）测试仪,目前的TRFIA测试仪：,国外仪器（Wallac公司） 国内其他公司生产的仪器(上海新波、广州丰华等) 达瑞抗体公司自主研发的仪器及软件（DR-M6601）,Wallac AutoDELFIA 1235,半自动 VICTOR2 1420,半自动 ANYTEST2000,DR-M6601时间分辨荧光免疫分析仪,【粤食药管械（准）字2005第2400226】,达瑞公司开发的系列TRF试剂,标准品,铕标记物,Thanks,