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分子生物学课件 现在学习的是第1页，共56页基因操作(gene manipulation) 基因工程(gene engineering)遗传工程gene cloningmolecular cloning 基因操作的核心部分为重组DNA技术。Recombination DNA technology 现在学习的是第2页，共56页生物反应器3现在学习的是第3页，共56页DNA RecombinationDNA Recombination 1 1 定义：定义： 对目的基因进行体外重组，再将重组分对目的基因进行体外重组，再将重组分子导入受体细胞，使这个基因在受体细胞中复制、转子导入受体细胞，使这个基因在受体细胞中复制、转录、翻译表达的过程。录、翻译表达的过程。 克隆（克隆（cloneclone）：）：n,n,无性繁殖系及其后代。基因无性繁殖系及其后代。基因完全相同完全相同; ; v, v,指从同一祖先产生这类同一的指从同一祖先产生这类同一的DNADNA分子群或细胞群的过分子群或细胞群的过程。程。 （Gene, cell,Gene, cell,个体）个体）20世纪70年代发展起来的遗传学的一个分支学科。现在学习的是第4页，共56页理论上三大发现：Avery肺炎双球菌转化实验： 证实了遗传物质的本质是 DNA（1944年）Watson 和Crick： 提出DNA双螺旋结构模型（1953年）Nirenberg等： 确定了遗传信息的传递方向（1961-1966年） DNA RNA 蛋白质现在学习的是第5页，共56页技术上三大发明：工具酶：分子手术刀，切割与缝合基因，包括限制性内切核酸酶、连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等，对DNA或RNA进行各种各样的修饰。 载体(vector, vehicle)：本意是媒介体，在基因工程上指能将目的基因导入宿主细胞的DNA分子。 逆转录酶（reverse transcription,RT)：打破了中心法则，使真核基因制备成为可能，RT-PCR。 RNA DNA现在学习的是第6页，共56页gene manipulation 过过 程程1 1、目的基因的获取、目的基因的获取（PCR,gene libraryPCR,gene library) )；2 2、载体、载体(vector)(vector)的选择与构建的选择与构建( (工具酶工具酶等）等）；3 3、目的基因与载体连接，构建重组、目的基因与载体连接，构建重组DNADNA分子；分子；4 4、重组、重组DNADNA导入受体细胞，转化子筛选；导入受体细胞，转化子筛选；5 5、受体细胞中目的基因的功能表达。、受体细胞中目的基因的功能表达。现在学习的是第7页，共56页基因工程的基本过程 分(合成)、 切、连、转、选、鉴现在学习的是第8页，共56页重组重组DNADNA技术的意义技术的意义 打破了自然种的界限打破了自然种的界限 真核真核/ /原核生物间基因的交流原核生物间基因的交流 对生物进行定向改造对生物进行定向改造 基因治疗（基因矫正基因治疗（基因矫正/ /添加，添加，RNAiRNAi） 基因工程药物基因工程药物（生长激素，细胞生长因子，重组（生长激素，细胞生长因子，重组疫苗等）疫苗等）现在学习的是第9页，共56页组织纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，tPA）One example- 10现在学习的是第10页，共56页？载体，工具酶现在学习的是第11页，共56页基因操作基因操作的工具酶的工具酶 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶(restriction (restriction endonuclease) endonuclease) DNADNA聚合酶聚合酶 连接酶（连接酶（LigaseLigase） 反转录酶反转录酶(Reverse transcriptase)(Reverse transcriptase) 碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（alkaline phosphatasealkaline phosphatase） 末端转移酶等末端转移酶等现在学习的是第12页，共56页1 1、限制性内切酶、限制性内切酶 定义：定义：是一类能够识别和切割双链是一类能够识别和切割双链DNADNA分子分子中特定碱基顺序的核酸水解酶。中特定碱基顺序的核酸水解酶。 EcoREcoRI I, Hand, HandIII, SalIIII, SalI现在学习的是第13页，共56页命名：3-4个字母组成, 方式是:属名+种名+株名+序号 第1字母（大写）产生该酶细菌的属名的第一字母； 第2、3字母（小写）细菌的种名； 第4字母（大写）细菌菌株名； 罗马数字代表该菌株中发现的第几个酶。 EcoRI: Escherichia coli R (大肠杆菌R株)14现在学习的是第14页，共56页限制与修饰（限制与修饰（Restriction - Restriction - modificationmodification） 细菌体内存在限制和修饰系统（细菌体内存在限制和修饰系统（R-MR-M） 对自身的对自身的DNADNA进行甲基化修饰，免受自己限制酶的进行甲基化修饰，免受自己限制酶的分解，分解， 对外来的对外来的DNADNA通过限制性内切酶降解，一般是指对通过限制性内切酶降解，一般是指对外源外源DNADNA侵入的限制侵入的限制 。 应用：应用： 正是对限制和修饰现象的深入研究，导致限制性正是对限制和修饰现象的深入研究，导致限制性内切核酸酶的发现，内切核酸酶的发现， 应用甲基化处理保护免受限制性内切酶降解应用甲基化处理保护免受限制性内切酶降解现在学习的是第15页，共56页分 类 根据限制性内切核酸酶的作用特点，分根据限制性内切核酸酶的作用特点，分为三大类。为三大类。现在学习的是第16页，共56页I类限制性内切核酸酶类限制性内切核酸酶类限制性内切核酸酶 现在学习的是第17页，共56页是基因工程中最常用的酶，该类酶的分子量小，专一性强,切割的方式有平切和交错切。类限制性内切核酸酶:18现在学习的是第18页，共56页类限制性内切核酸酶类限制性内切核酸酶 识别序列的长度识别序列的长度：一般为一般为4-84-8个碱基，最常见个碱基，最常见6 6个碱个碱基。基。 识别序列的结构识别序列的结构：大多数为回文对称结构，切割大多数为回文对称结构，切割位点在位点在 DNA DNA 两条链相对称的位置。两条链相对称的位置。回文结构：回文结构：一条单链以中心轴对折可以形成互补的双链一条单链以中心轴对折可以形成互补的双链。现在学习的是第19页，共56页 粘性末端（粘性末端（cohesive endcohesive end）-在在DNADNA双链的不同位双链的不同位置切割置切割DNADNA，形成有单链突出的末端。，形成有单链突出的末端。 平末端（平末端（Blunt endBlunt end）-在在DNADNA双链的相同位置切双链的相同位置切割割DNADNA分子。分子。 限制酶产生的末端：现在学习的是第20页，共56页常用的限制性内切酶21现在学习的是第21页，共56页DNADNA连接酶（连接酶（ligaseligase） 作用：作用：使使DNADNA的的3 3羟基末端和羟基末端和5 5磷酸末端磷酸末端形成形成3 3-5-5磷酸二酯键，将两段磷酸二酯键，将两段DNADNA连接起连接起来来 种类：种类：T4 DNA ligase T4 DNA ligase （噬菌体来源）（噬菌体来源） E.coliE.coli DNA ligase DNA ligase 注意：注意：连接连接DNADNA片段是否粘端；片段是否粘端； 反应温度（反应温度（1616）和时间）和时间22现在学习的是第22页，共56页23现在学习的是第23页，共56页DNADNA聚合酶聚合酶 复制（复制（DNA ReplicationDNA Replication）: : 亲代亲代DNADNA双链分子双链分子(D.S DNA)(D.S DNA)在在DNADNA聚合酶聚合酶的作用下，分别以每单链的作用下，分别以每单链DNADNA分子分子(S.S DNA)(S.S DNA)为为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTPdNTP，合成两条与亲代分子完全相同的子代，合成两条与亲代分子完全相同的子代DNADNA分子的过程。分子的过程。24现在学习的是第24页，共56页DNA 5 ATGACTG3 3 TACTGAC5RNA 5 AUGACUG3转录：以S.S DNA为模板，在依赖DNA的RNA聚合酶的作用下.逆转录：.依赖RNA的DNA聚合酶DNA聚合酶25现在学习的是第25页，共56页DNA聚合酶与DNA复制26现在学习的是第26页，共56页常用的常用的DNADNA聚合酶：聚合酶： 大肠杆菌大肠杆菌 DNA DNA 聚合酶聚合酶；E.coliE.coli DNA polymerase DNA polymerase 的的KlenowKlenow片片段（段（KlenowKlenow酶）；酶）； 耐热耐热 DNA DNA 聚合酶；聚合酶； 反转录酶反转录酶27现在学习的是第27页，共56页DNADNA聚合酶聚合酶 大肠杆菌大肠杆菌 DNA DNA 聚合酶聚合酶 （E.coliE.coli DNA DNA polymerase polymerase ）及其大片段（）及其大片段（KlenowKlenow片片段）段）35KD 76KD枯草蛋白酶水解Klenow片段28现在学习的是第28页，共56页大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I的酶活性的酶活性 5 5-3-3DNADNA聚合活性聚合活性 3 3-5-5外切酶活性外切酶活性 5 5-3-3外切酶活性外切酶活性 KlenowKlenow片段的酶活性片段的酶活性 5 5-3-3DNADNA聚合酶活性聚合酶活性 3 3-5-5外切酶活性外切酶活性29现在学习的是第29页，共56页主要用途主要用途:用切口平移法（用切口平移法（nick translation nick translation ）标记）标记 DNADNA，制备探针。，制备探针。30现在学习的是第30页，共56页5-3外切酶活性5-3DNA聚合活性3-5外切酶活性31现在学习的是第31页，共56页耐热耐热 DNA DNA 聚合酶聚合酶 Taq DNATaq DNA酶酶 是一类耐热的是一类耐热的DNADNA聚合酶。聚合酶。 具有具有5 5-3-3聚合酶活性和聚合酶活性和5 5-3-3外切酶活性外切酶活性 多数多数TaqTaq酶缺乏酶缺乏3 3-5-5外切酶活性，外切酶活性， 反应温度反应温度70 70 PCRPCR（polymerse chain reaction,polymerse chain reaction,聚合聚合酶链式反应酶链式反应) )32现在学习的是第32页，共56页逆转录酶逆转录酶（Reverse Transcriptase） 催化以催化以RNARNA为模板的聚合反应，称依赖为模板的聚合反应，称依赖RNARNA的的DNADNA聚合酶。聚合酶。 以以mRNAmRNA为模板，催化合成出互补的为模板，催化合成出互补的DNADNA，称为，称为cDNAcDNA(complementary DNA)(complementary DNA)； RT-PCRRT-PCR 常见的逆转录酶常见的逆转录酶: AMV:AMV:禽病毒来源禽病毒来源 反应温度反应温度42 42 MMLV:MMLV:鼠来源病毒鼠来源病毒 反应温度反应温度38 38 33现在学习的是第33页，共56页RT-PCR34现在学习的是第34页，共56页末端转移酶末端转移酶（terminal transferase） 活性：催化活性：催化dNTPdNTP加到加到3 3羟基末端羟基末端 用途：制造人工粘端用途：制造人工粘端 进行末端标记进行末端标记35现在学习的是第35页，共56页碱性磷酸酶碱性磷酸酶alkaline phosphatase 作用：作用：去除去除5 5磷酸基团，防止自身连接。磷酸基团，防止自身连接。 种类：种类：BAP-BAP-细菌性碱性磷酸酶细菌性碱性磷酸酶 CIP-CIP-牛小肠碱性磷酸酶牛小肠碱性磷酸酶 用途：用途：基因克隆中防止载体自身环化基因克隆中防止载体自身环化 36现在学习的是第36页，共56页其它：多聚核苷酸激酶：提供磷酸基团RNase - ribonucleaseDNase - deoxyribonuclaese37现在学习的是第37页，共56页基因操作基因操作的载体的载体携带目的基因进入宿主细胞的运载工具（携带目的基因进入宿主细胞的运载工具（vectorvector）质粒载体噬菌体(Lambda phage )现在学习的是第38页，共56页 克隆载体：克隆载体：目的基因的克隆、扩增序列分析目的基因的克隆、扩增序列分析等等 表达载体（表达载体（expression vectorexpression vector）：）：表达外表达外源基因源基因, ,带有启动子，核糖体结合位点以及带有启动子，核糖体结合位点以及表达标签等。表达标签等。 原核表达载体：原核表达载体：E.coliE.coli 真核表达载体：真核表达载体：酵母，哺乳动物，昆虫细胞酵母，哺乳动物，昆虫细胞表达载体表达载体39现在学习的是第39页，共56页腺苷脱氨酶(adenosine deaminase, ADA) Severe Combined Immunodeficiency,重症联合免疫缺陷 40现在学习的是第40页，共56页n载体的条件：1 含有独立自主复制起点，便于在宿主中扩增；2 一个或多个筛选标记，如抗性基因-氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, ampr)；表型的显色反应等。3 多克隆位点， 便于目的基因的克隆。4 高拷贝，便于分离提纯。现在学习的是第41页，共56页筛选标记：用来区别重组质粒与非重组质粒。当一个外源 DNA 片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。现在学习的是第42页，共56页筛选标记：当一个外源 DNA 片段克隆到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。用来区别重组质粒与非重组质粒。-互补：（-complementation）蓝白斑筛选现在学习的是第43页，共56页 插入失活插入失活(pBR322)(pBR322) 该质粒具有四环素抗性基因（该质粒具有四环素抗性基因（tettetr r）和氨苄青霉素抗性基因（）和氨苄青霉素抗性基因（ampampr r）两种抗性标记。）两种抗性标记。 当外源当外源 DNA DNA 片段插入片段插入 tettetr r 基因后，导致基因后，导致 tettetr r 基因失活，变成基因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。只对氨苄青霉素有抗性。 这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。入到载体中。现在学习的是第44页，共56页多克隆位点多克隆位点（Multiple Cloning SiteMultiple Cloning Site） 是一段人工合成的是一段人工合成的DNADNA序列，含有密集排列序列，含有密集排列的多种限制性酶切位点，以利于不同来源的的多种限制性酶切位点，以利于不同来源的外源外源DNADNA片段插入载体。片段插入载体。现在学习的是第45页，共56页质粒载体(plasmid vector) 1.概念：细菌染色体以外的，能自主复制双链闭合环状DNA分子。其大小可从2-3kb到200kb（kilobase)左右，能够在宿主内利用宿主的酶系统进行复制,赋予寄主一些新的遗传性状。 现在学习的是第46页，共56页2.质粒载体分类质粒拷贝数(plasmid copy numbers)： 指细菌中质粒的分子个数,常用质粒数/每染色体来表示。严紧型质粒和松弛型质粒47现在学习的是第47页，共56页松弛型质粒(relaxed plasmid)： 复制只受本身的遗传结构的控制，有较多的拷贝数。严紧型质粒(stringent plasmid)：在寄主细胞内的复制除了受本身复制机构的控制外，还受染色体的严紧控制，因此拷贝数较少。现在学习的是第48页，共56页Example: pBR322 质粒 现在学习的是第49页，共56页pUC18/19 50现在学习的是第50页，共56页噬菌体phage vector感染细菌的病毒51现在学习的是第51页，共56页噬菌体Life cycle52现在学习的是第52页，共56页噬菌体载体噬菌体载体分类：分类：双链（双链（ 噬菌体噬菌体）单链丝状（单链丝状（M13M13）在在 噬菌体颗粒内，基因组噬菌体颗粒内，基因组 DNA DNA 呈线性，其两端的呈线性，其两端的 5 5 末端带有末端带有 12 12 个碱基的互补单链（个碱基的互补单链（coscos粘性末端粘性末端）， 12 12 个碱基的序列为个碱基的序列为 5 5-GGGCGGCGACCT-3-GGGCGGCGACCT-3。当当 噬菌体噬菌体 DNA DNA 进入宿主细胞后，其两端互补单链通进入宿主细胞后，其两端互补单链通过碱基配对形成环状过碱基配对形成环状 DNA DNA 分子。分子。现在学习的是第53页，共56页 噬菌体载体types:1 插入型载体：外源DNA直接插入噬菌体，容量小，容量6-8Kb的DNA片段， 用于cDNA的克隆和cDNA文库构建。2 置换型载体：噬菌体基因组中非必需基因被外源DNA替代，容量10-20Kb，用于基因组DNA的克隆和基因组DNA文库的构建。 现在学习的是第54页，共56页粘粒载体（cosmid） cos site-carrying plasmid, 带有粘性末端位点的质粒。 由质粒和噬菌体的cos粘性末端构建成，容量大（45Kb），用于基因组文库构建。现在学习的是第55页，共56页病毒载体: 逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒（AAV）载体等 56现在学习的是第56页，共56页