呼吸系统疾病动物模型.ppt

关于呼吸系统疾病动物模型现在学习的是第1页，共81页呼吸系统疾病是一种常见病、多发病，主呼吸系统疾病是一种常见病、多发病，主要病变在气管、支气管、肺部及胸腔，病变轻者要病变在气管、支气管、肺部及胸腔，病变轻者多咳嗽、胸痛、呼吸受影响，重者呼吸困难、缺多咳嗽、胸痛、呼吸受影响，重者呼吸困难、缺氧，甚至呼吸衰竭而致死。在城市的死亡率占第氧，甚至呼吸衰竭而致死。在城市的死亡率占第位，而在农村则占首位。更应重视的是由于大位，而在农村则占首位。更应重视的是由于大气污染、吸烟、人口老龄化及其他因素，使国内气污染、吸烟、人口老龄化及其他因素，使国内外的慢性阻塞性肺病（简称慢阻肺，包括慢性支外的慢性阻塞性肺病（简称慢阻肺，包括慢性支气管炎、肺气肿、肺心病）、支气管哮喘、肺癌气管炎、肺气肿、肺心病）、支气管哮喘、肺癌、肺部弥散性间质纤维化，以及肺部感染等疾病、肺部弥散性间质纤维化，以及肺部感染等疾病的发病率、死亡率有增无减。的发病率、死亡率有增无减。现在学习的是第2页，共81页咳嗽动物模型咳嗽动物模型支气管哮喘动物模型支气管哮喘动物模型慢性支气管炎模型慢性支气管炎模型肺气肿和肺心病动物模型肺气肿和肺心病动物模型肺水肿动物模型肺水肿动物模型肺纤维化动物模型肺纤维化动物模型肺结核病动物模型肺结核病动物模型肺硅沉着症动物模型肺硅沉着症动物模型现在学习的是第3页，共81页第一节 咳嗽动物模型咳嗽动物模型 现在学习的是第4页，共81页 咳嗽是呼吸系统多种疾病的常见症状。确定受试药物的咳嗽是呼吸系统多种疾病的常见症状。确定受试药物的镇咳作用镇咳作用, ,可采用小鼠氨水或二氧化硫引咳法及豚鼠枸橼酸可采用小鼠氨水或二氧化硫引咳法及豚鼠枸橼酸引咳法两种模型加以确定引咳法两种模型加以确定, , 并与阳性药物进行同步观察。并与阳性药物进行同步观察。 豚鼠是筛选镇咳药豚鼠是筛选镇咳药(antitussives)(antitussives)的常用动物。小的常用动物。小鼠和大鼠给予化学刺激虽然能诱发咳嗽，但其咳嗽与喷嚏鼠和大鼠给予化学刺激虽然能诱发咳嗽，但其咳嗽与喷嚏动作很难区别，变异较大，特别是反复刺激时变异更大，动作很难区别，变异较大，特别是反复刺激时变异更大，故小鼠主要作为初筛镇咳药时使用。故小鼠主要作为初筛镇咳药时使用。现在学习的是第5页，共81页一、小鼠氨水引咳法一、小鼠氨水引咳法 造模原理造模原理 浓氨水是一种较强的化学刺激物，动物吸入氨水气雾浓氨水是一种较强的化学刺激物，动物吸入氨水气雾后，刺激呼吸道感受器，引起咳嗽。后，刺激呼吸道感受器，引起咳嗽。 动物和主要器材动物和主要器材 成年小鼠成年小鼠, ,性别不拘。性别不拘。500500mlml玻璃罩玻璃罩; ; 空气压缩机空气压缩机( (或脚踏风箱或脚踏风箱) )。 现在学习的是第6页，共81页 操作步骤操作步骤 1.1.小鼠置玻璃罩内小鼠置玻璃罩内空气压缩机以空气压缩机以400400mmHgmmHg恒压将氨恒压将氨水喷入罩内水喷入罩内喷雾喷雾5 5s s记录动物咳嗽潜伏期和记录动物咳嗽潜伏期和2 2minmin内咳内咳嗽次数。也可用引起一半小鼠咳嗽的喷雾时间嗽次数。也可用引起一半小鼠咳嗽的喷雾时间( (FDTFDT5050) )为为指标。指标。 2.2.观察药物的止咳作用观察药物的止咳作用 小鼠按体重均分小鼠按体重均分3 3组，每组至少组，每组至少1515只小鼠。给药组灌服受试药，模型组灌服等体积生理只小鼠。给药组灌服受试药，模型组灌服等体积生理盐水，阳性对照药组腹腔注射磷酸可待因盐水，阳性对照药组腹腔注射磷酸可待因30mg/kg30mg/kg体重。体重。灌胃给予受试药灌胃给予受试药1 h1 h后、腹腔注射给予受试药后、腹腔注射给予受试药30min30min后开始后开始喷雾。喷雾一定时间，终止喷雾，观察咳嗽反应。喷雾。喷雾一定时间，终止喷雾，观察咳嗽反应。 现在学习的是第7页，共81页 模型评价与注意事项模型评价与注意事项 1. 1.氨水诱发小鼠咳嗽反应变异性较大氨水诱发小鼠咳嗽反应变异性较大, ,可在初筛止咳药时应可在初筛止咳药时应用。用。 2. 2.咳嗽潜伏期是指从喷入氨水开始至发生咳嗽所需的时间咳嗽潜伏期是指从喷入氨水开始至发生咳嗽所需的时间( (秒数秒数) )。小鼠咳嗽以腹肌收缩。小鼠咳嗽以腹肌收缩( (缩胸缩胸) )，同时张大嘴为准，有，同时张大嘴为准，有时可有咳嗽声，观察必须仔细，也可用听诊器听咳嗽声。时可有咳嗽声，观察必须仔细，也可用听诊器听咳嗽声。 3.3.避免腹腔注射给予受试药避免腹腔注射给予受试药, ,以免干扰动物的咳嗽反应。以免干扰动物的咳嗽反应。 现在学习的是第8页，共81页二、小鼠二氧化硫引咳法二、小鼠二氧化硫引咳法 造模原理造模原理 二氧化硫是一种强的化学刺激物质二氧化硫是一种强的化学刺激物质, ,动物吸入其动物吸入其气雾后刺激呼吸道感受器气雾后刺激呼吸道感受器, ,反射性引起咳嗽。无水亚硫反射性引起咳嗽。无水亚硫酸钠与硫酸反应生成酸钠与硫酸反应生成SOSO2 2。 现在学习的是第9页，共81页操作步骤操作步骤用一带侧口的三角烧瓶用一带侧口的三角烧瓶, ,侧口通过橡皮管与球囊侧口通过橡皮管与球囊连接连接, ,烧瓶内盛有无水亚硫酸钠烧瓶内盛有无水亚硫酸钠, ,烧瓶塞上装一滴定管烧瓶塞上装一滴定管, ,内灌硫酸，打开滴定管的活塞使硫酸滴到亚硫酸钠上，内灌硫酸，打开滴定管的活塞使硫酸滴到亚硫酸钠上，在烧瓶内产生在烧瓶内产生SOSO2 2气体，气体储存于球囊内，用血管钳夹紧气体，气体储存于球囊内，用血管钳夹紧，应用时用注射器吸取，应用时用注射器吸取4 410ml10ml，注入放置实验小鼠的广，注入放置实验小鼠的广口瓶内。口瓶内。 现在学习的是第10页，共81页现在学习的是第11页，共81页 3.3.观察药物的止咳作用观察药物的止咳作用 小鼠按体重均分小鼠按体重均分3 3组，给药组灌胃给予组，给药组灌胃给予受试药，模型组灌胃给予等体积生理盐水，阳性对照药组腹腔注受试药，模型组灌胃给予等体积生理盐水，阳性对照药组腹腔注射磷酸可待因射磷酸可待因30 mg/kg30 mg/kg体重。灌胃给予受试药体重。灌胃给予受试药1 h1 h或腹腔注射给药或腹腔注射给药30 min30 min后，将小鼠置于充满后，将小鼠置于充满SO2SO2的烧杯内，观察咳嗽潜伏期，按下的烧杯内，观察咳嗽潜伏期，按下式计算药物止咳率：式计算药物止咳率： 给药组咳嗽潜伏期给药组咳嗽潜伏期 药物止咳率（药物止咳率（%） 100% 模型组咳嗽潜伏期模型组咳嗽潜伏期现在学习的是第12页，共81页 注意事项注意事项 1. 1.烧杯内烧杯内SOSO2 2的浓度要求在的浓度要求在1:500001:50000，该浓度足以引起咳嗽，该浓度足以引起咳嗽，如浓度过高，如浓度过高( (如如1:10000)1:10000)易造成动物中毒死亡。易造成动物中毒死亡。 2. 2.实验中实验中SOSO2 2产生的多少与实验室温度、无水亚硫酸钠的量关系产生的多少与实验室温度、无水亚硫酸钠的量关系密切，故无水亚硫酸钠的称量应准确。密切，故无水亚硫酸钠的称量应准确。 3.SO 3.SO2 2引咳的个体差异较大引咳的个体差异较大, ,实验时应尽量减少各方面误实验时应尽量减少各方面误差。差。现在学习的是第13页，共81页三、豚鼠枸橼酸引咳法三、豚鼠枸橼酸引咳法 造模原理造模原理 豚鼠吸入枸橼酸溶液喷雾后，刺激呼吸道粘膜感受器，反射性引豚鼠吸入枸橼酸溶液喷雾后，刺激呼吸道粘膜感受器，反射性引起咳嗽。起咳嗽。 动物和主要器材动物和主要器材 体重体重200200250250g g豚鼠。豚鼠。 2 24 4L L玻璃罩玻璃罩; ; 空气压缩机。空气压缩机。现在学习的是第14页，共81页豚鼠豚鼠体型短粗而圆，头较大，眼大而圆还明亮，耳圆，上唇分裂，耳朵短小；四肢短，前脚具4趾，后脚3趾，无外尾。 现在学习的是第15页，共81页 操作步骤操作步骤 1.1.将豚鼠置于玻璃干燥器内将豚鼠置于玻璃干燥器内, ,用超声雾化器喷入用超声雾化器喷入17.5%17.5%枸橼酸枸橼酸雾化气雾化气5 510s10s，观察、记录豚鼠咳嗽潜伏期或记录，观察、记录豚鼠咳嗽潜伏期或记录5min5min内豚鼠的内豚鼠的咳嗽次数。咳嗽次数。 2.2.观察药物的止咳作用观察药物的止咳作用 将豚鼠按体重随机分为将豚鼠按体重随机分为3 3组组, ,给药给药组灌胃给予受试药组灌胃给予受试药, ,模型组灌胃给予等体积生理盐水模型组灌胃给予等体积生理盐水, ,阳性对照阳性对照药组腹腔注射磷酸可待因药组腹腔注射磷酸可待因5mg/kg5mg/kg体重。灌胃给予受试药体重。灌胃给予受试药1 h1 h或或腹腔注射给药腹腔注射给药30min30min后，按上述方法引咳后，按上述方法引咳, ,评受试药的止咳效果评受试药的止咳效果。 现在学习的是第16页，共81页 模型评价与注意事项模型评价与注意事项 1. 1.豚鼠对化学性刺激物很敏感豚鼠对化学性刺激物很敏感, ,刺激后能诱发咳嗽刺激后能诱发咳嗽, ,动物容动物容易得到。二氧化硫引咳法、氨水引咳法和枸橼酸引咳法易得到。二氧化硫引咳法、氨水引咳法和枸橼酸引咳法是研究止咳药的三种常用方法，前二者系用小鼠，费用是研究止咳药的三种常用方法，前二者系用小鼠，费用较低廉，适合于研究止咳药效果的初筛，确定效果后，较低廉，适合于研究止咳药效果的初筛，确定效果后，再用豚鼠作进一步研究。再用豚鼠作进一步研究。 2.2.豚鼠的咳嗽声响亮，应以能听到声音为咳嗽。豚鼠的咳嗽声响亮，应以能听到声音为咳嗽。 3. 3.实验前实验前1 1日豚鼠应预先挑选，喷雾后日豚鼠应预先挑选，喷雾后5 min5 min内咳嗽次数内咳嗽次数少于少于1010次者应予以淘汰。次者应予以淘汰。现在学习的是第17页，共81页第二节第二节 支气管哮喘动物模型支气管哮喘动物模型 支气管哮喘支气管哮喘(bronchial asthma)(bronchial asthma)简称哮喘，是气道的简称哮喘，是气道的一种慢性变态反应性炎症性疾病。哮喘是由嗜酸性粒细一种慢性变态反应性炎症性疾病。哮喘是由嗜酸性粒细胞、肥大细胞和胞、肥大细胞和T T淋巴细胞等多种炎症细胞参与的慢性气淋巴细胞等多种炎症细胞参与的慢性气道炎症，由此导致患者的道炎症，由此导致患者的气道高反应性气道高反应性（气道对各种刺（气道对各种刺激因素出现过强或过早的收缩反应），造成气道缩窄，气激因素出现过强或过早的收缩反应），造成气道缩窄，气流受阻。流受阻。 现在学习的是第18页，共81页 临床上表现为反复发作性喘息、呼气性呼吸困难临床上表现为反复发作性喘息、呼气性呼吸困难和胸闷等症状。哮喘是一种常见疾病，全球约有和胸闷等症状。哮喘是一种常见疾病，全球约有1 1亿亿5 5千万，我国约有千万，我国约有1 1千千5 5百万哮喘病人，已成为严重威胁人类百万哮喘病人，已成为严重威胁人类健康的疾病之一。健康的疾病之一。 哮喘的发病机制尚不完全清楚，有许多因素参与。过哮喘的发病机制尚不完全清楚，有许多因素参与。过去认为哮喘是去认为哮喘是IgEIgE介导的介导的I I型超敏反应性疾病，目前认识型超敏反应性疾病，目前认识到哮喘是以到哮喘是以气道高反应性气道高反应性为主要特征的慢性气道炎症性为主要特征的慢性气道炎症性疾病。哮喘发病分为速发相和迟发相两个阶段。疾病。哮喘发病分为速发相和迟发相两个阶段。现在学习的是第19页，共81页 速发相阶段速发相阶段: :肥大细胞是主要效应细胞，致敏抗原肥大细胞是主要效应细胞，致敏抗原与肥大细胞表面与肥大细胞表面IgEIgE抗体结合。当相同抗原再次进入机抗体结合。当相同抗原再次进入机体后，引发肥大细胞脱颗粒，释放组胺、体后，引发肥大细胞脱颗粒，释放组胺、5-5-羟色胺等羟色胺等炎症介质，导致支气管痉挛、气管粘膜微血管通透性增炎症介质，导致支气管痉挛、气管粘膜微血管通透性增加、气管粘膜水肿和粘液分泌亢进。加、气管粘膜水肿和粘液分泌亢进。 迟发相反应迟发相反应: :特征是大量嗜酸性粒细胞局部浸润。特征是大量嗜酸性粒细胞局部浸润。 现在学习的是第20页，共81页一、过敏性哮喘模型一、过敏性哮喘模型 造模原理造模原理 过敏性哮喘过敏性哮喘(allergic asthma)(allergic asthma)的发病机制涉及引起的发病机制涉及引起过敏的抗原。抗原一般具备两种特性：过敏的抗原。抗原一般具备两种特性： 一是免疫原性一是免疫原性，即能刺激机体产生免疫应答，包括，即能刺激机体产生免疫应答，包括特异性抗体和致敏特异性抗体和致敏T T细胞；细胞； 二是抗原性二是抗原性，系指能与抗体或致敏，系指能与抗体或致敏T T细胞在体内外发细胞在体内外发生特异性结合。生特异性结合。现在学习的是第21页，共81页 过敏性哮喘模型的复制需要过敏性哮喘模型的复制需要致敏致敏和和激发激发两个步骤。动物两个步骤。动物以卵清蛋白以卵清蛋白(ovalbumin(ovalbumin，卵白蛋白，卵白蛋白) )为致敏的抗原为致敏的抗原( (有时有时并用免疫佐剂如氢氧化铝、灭活百日咳杆菌菌苗等并用免疫佐剂如氢氧化铝、灭活百日咳杆菌菌苗等) )，经腹腔或皮下注射，刺激机体产生经腹腔或皮下注射，刺激机体产生IgEIgE，并结合在肥大，并结合在肥大细胞等细胞表面，使机体处于细胞等细胞表面，使机体处于致敏状态致敏状态。 一定时间后当动物一定时间后当动物再次再次接触到接触到相同抗原相同抗原后，发生后，发生I I型速发型速发型过敏反应，呼吸道粘膜肥大细胞等合成并释放多种生物型过敏反应，呼吸道粘膜肥大细胞等合成并释放多种生物活性物质，引起支气管平滑肌收缩、粘液分泌增多、血管活性物质，引起支气管平滑肌收缩、粘液分泌增多、血管通透性增高和炎症细胞浸润等通透性增高和炎症细胞浸润等( (激发激发) )，导致哮喘发作。，导致哮喘发作。现在学习的是第22页，共81页 ( (一一) )腹腔注射致敏剂豚鼠模型腹腔注射致敏剂豚鼠模型 动物、试剂与器材动物、试剂与器材 体重体重250250300g300g豚鼠，雌雄不限。豚鼠，雌雄不限。10%10%和和0.5%0.5%1%1%卵清蛋卵清蛋白生理盐水溶液；超声雾化器。白生理盐水溶液；超声雾化器。 操作方法操作方法 1.1.致敏致敏 腹腔注射腹腔注射10%10%卵清蛋白生理盐水溶液卵清蛋白生理盐水溶液1.0ml1.0ml（含卵清（含卵清蛋白蛋白100mg100mg）使豚鼠处于致敏状态。）使豚鼠处于致敏状态。 2.2.激发激发 注射卵清蛋白后注射卵清蛋白后2 2周，将豚鼠置于密闭有机玻璃周，将豚鼠置于密闭有机玻璃箱内，用箱内，用0.5%0.5%1%1%卵清蛋白生理盐水溶液超声雾化吸入卵清蛋白生理盐水溶液超声雾化吸入30s30s2min2min，诱发豚鼠哮喘发作。，诱发豚鼠哮喘发作。 3. 3.支气管支气管- -肺泡灌洗。肺泡灌洗。 现在学习的是第23页，共81页 结果及模型评价结果及模型评价 1. 1.豚鼠可出现气喘表现，咳嗽、烦躁、口唇和四肢紫豚鼠可出现气喘表现，咳嗽、烦躁、口唇和四肢紫绀，呼吸费力挣扎，呼吸频率加快和呼吸加深。病理检查绀，呼吸费力挣扎，呼吸频率加快和呼吸加深。病理检查可发现肺毛细血管扩张、嗜酸性粒细胞浸润和腺体分泌亢可发现肺毛细血管扩张、嗜酸性粒细胞浸润和腺体分泌亢进。进。 2. 2.豚鼠是能最好显示气道高反应性的动物，其哮喘发作豚鼠是能最好显示气道高反应性的动物，其哮喘发作与人类的表现相似。与人类的表现相似。 3.3.用于复制过敏性哮喘动物模型的抗原物质主要有卵清蛋用于复制过敏性哮喘动物模型的抗原物质主要有卵清蛋白、蛔虫卵、尘螨、豚草花粉、真菌孢子、蟑螂等。白、蛔虫卵、尘螨、豚草花粉、真菌孢子、蟑螂等。卵清蛋卵清蛋白白为蛋清提取物，免疫原性强，来源方便，价格低廉，最为蛋清提取物，免疫原性强，来源方便，价格低廉，最常用于复制哮喘模型。常用于复制哮喘模型。现在学习的是第24页，共81页 4.4.卵清蛋白激发豚鼠哮喘发作是目前国内外常用的方卵清蛋白激发豚鼠哮喘发作是目前国内外常用的方法，操作简单，可重复性强。本模型主要用于哮喘发病法，操作简单，可重复性强。本模型主要用于哮喘发病机制研究和治疗效果观察。动物每日引喘机制研究和治疗效果观察。动物每日引喘1 1次，反复次，反复101014d14d，可成为哮喘慢性发作模型。，可成为哮喘慢性发作模型。 5.5.本模型最大的本模型最大的缺点缺点是豚鼠对卵清蛋白反应的个体差是豚鼠对卵清蛋白反应的个体差异很大，少数豚鼠可能不出现哮喘反应，而一些动物则可异很大，少数豚鼠可能不出现哮喘反应，而一些动物则可发生急性过敏性休克。发生急性过敏性休克。现在学习的是第25页，共81页 注意事项注意事项 1. 1.宜选用等级高、溶解性好的卵清蛋白。宜选用等级高、溶解性好的卵清蛋白。 2. 2.超声雾化器应气雾流量较大、雾化颗粒较小。超声雾化器应气雾流量较大、雾化颗粒较小。 3. 3.激发用的抗原量和吸入时间非常重要，雾化吸入的卵清蛋白溶激发用的抗原量和吸入时间非常重要，雾化吸入的卵清蛋白溶液必须用较低浓度，以减少动物死亡。液必须用较低浓度，以减少动物死亡。 4.4.动物一旦出现腹肌明显收缩，应立即将其移出有机玻璃动物一旦出现腹肌明显收缩，应立即将其移出有机玻璃箱，以免因窒息而死亡。箱，以免因窒息而死亡。 现在学习的是第26页，共81页二、二、哮喘离体哮喘离体实验方法实验方法 ( (一一) )豚鼠气管片法豚鼠气管片法 基本原理基本原理 将制备的气管片置于盛有营养液的恒温浴槽内将制备的气管片置于盛有营养液的恒温浴槽内, ,加一定负加一定负荷荷, ,通过拉力换能器通过拉力换能器, ,将致痉剂或受试药对气管作用所产将致痉剂或受试药对气管作用所产生的张力转换为电信号生的张力转换为电信号, ,放大后由记录仪描记出标本的舒放大后由记录仪描记出标本的舒缩曲线缩曲线, ,可反映大气道的舒缩变化。可反映大气道的舒缩变化。现在学习的是第27页，共81页取出气管取出气管, , 制备气管片制备气管片 现在学习的是第28页，共81页 制备气管螺旋条制备气管螺旋条现在学习的是第29页，共81页连接到描记装置供氧的离体器官浴槽内现在学习的是第30页，共81页观察药物作用观察药物作用 加组胺或乙酰胆碱加组胺或乙酰胆碱气管条气管条张力达到最高点时张力达到最高点时, ,分别加入不同剂量受试药分别加入不同剂量受试药, ,记录气记录气管条张力变化管条张力变化. .求受试药的解痉百分率求受试药的解痉百分率 给药前曲线高度给药后曲线高度给药前曲线高度给药后曲线高度解痉百分率（解痉百分率（%） 100 给药前曲线高度给药前曲线高度现在学习的是第31页，共81页 第三节第三节慢性支气管炎模型慢性支气管炎模型现在学习的是第32页，共81页 慢性支气管炎慢性支气管炎(chronic bronchitis,(chronic bronchitis,简称慢支简称慢支) )是指气是指气管、支气管粘膜及其周围组织的慢性非特异性炎症。临床管、支气管粘膜及其周围组织的慢性非特异性炎症。临床上以反复发作咳嗽、咳痰或伴有喘息症状为特征上以反复发作咳嗽、咳痰或伴有喘息症状为特征, ,且症状且症状每年至少持续每年至少持续3 3个月个月, ,连续两年以上。病情持续多年者连续两年以上。病情持续多年者常并发常并发肺气肿肺气肿和和慢性肺心病慢性肺心病。 慢支的病因和发病机制较复杂，是由多种因素长慢支的病因和发病机制较复杂，是由多种因素长期综合作用所致。已确定的致病因素包括细菌和病期综合作用所致。已确定的致病因素包括细菌和病毒感染、吸烟、空气污染、过敏和机体内在因素等毒感染、吸烟、空气污染、过敏和机体内在因素等。现在学习的是第33页，共81页一一、大鼠烟熏模型、大鼠烟熏模型 造模原理造模原理 烟雾中含有许多有害物质烟雾中含有许多有害物质, ,如焦油、如焦油、COCO、尼古丁及、尼古丁及氧化物等氧化物等, ,它们随烟雾被吸入支气管它们随烟雾被吸入支气管, ,抑制粘膜上皮细胞抑制粘膜上皮细胞的纤毛运动的纤毛运动, ,刺激分泌增加刺激分泌增加, ,降低巨噬细胞的吞噬功能而降低巨噬细胞的吞噬功能而有利于感染。随着烟雾刺激时间的延长有利于感染。随着烟雾刺激时间的延长, ,气管炎症逐渐加重气管炎症逐渐加重, ,一般在一般在21d21d后开始出现呼吸道慢性炎症后开始出现呼吸道慢性炎症, ,约至第约至第7 7周可形周可形成慢性支气管炎的典型病理变化。成慢性支气管炎的典型病理变化。 现在学习的是第34页，共81页 操作方法操作方法 成年雄性大鼠。将大鼠置于成年雄性大鼠。将大鼠置于27m27m3 3烟室内烟室内, ,吸入混合烟吸入混合烟150150200mg/m200mg/m3 3(200g(200g锯末锯末,15,1520g20g烟叶烟叶,6,67g7g干辣椒及干辣椒及1g1g硫磺混合硫磺混合,20,2030 min30 min内烧化内烧化, ,颗粒在颗粒在0.50.51m1m以上以上) )，每，每周吸入周吸入6 6次次,44d,44d后即可形成慢性支气管炎病变。后即可形成慢性支气管炎病变。 现在学习的是第35页，共81页第四节第四节肺气肿和肺心病动物模型肺气肿和肺心病动物模型现在学习的是第36页，共81页 阻塞性肺气肿阻塞性肺气肿( (简称肺气肿简称肺气肿) )是呼吸性细支气管、肺泡是呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊和肺泡因过度充气呈持久性扩张，并伴有管、肺泡囊和肺泡因过度充气呈持久性扩张，并伴有肺泡间隔破坏，肺组织弹性减弱，导致肺体积膨大、肺泡间隔破坏，肺组织弹性减弱，导致肺体积膨大、功能降低的病理状态。肺气肿常继发于其他肺阻塞性功能降低的病理状态。肺气肿常继发于其他肺阻塞性疾病，尤以慢性支气管炎最为常见。疾病，尤以慢性支气管炎最为常见。 肺气肿发病机制与慢性支气管炎引起的呼吸道阻肺气肿发病机制与慢性支气管炎引起的呼吸道阻塞塞( (特别是小气管特别是小气管) )、体内、体内- -抗胰蛋白酶或抗胰蛋白酶或- -巨球巨球蛋白缺乏、遗传因素、变态反应等有关。目前复制肺气肿蛋白缺乏、遗传因素、变态反应等有关。目前复制肺气肿动物模型的主要方法有利用弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、氯动物模型的主要方法有利用弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、氯化镉、饥饿、吸烟诱发肺气肿和转基因肺气肿模型等。化镉、饥饿、吸烟诱发肺气肿和转基因肺气肿模型等。 现在学习的是第37页，共81页现在学习的是第38页，共81页现在学习的是第39页，共81页 肺源性心脏病肺源性心脏病(cor (cor pulmonalepulmonale，简称肺心病，简称肺心病) )是呼是呼吸系统的常见病，是指由支气吸系统的常见病，是指由支气管管- -肺组织、胸廓或肺动脉病变肺组织、胸廓或肺动脉病变引起肺血管阻力增加，产生肺引起肺血管阻力增加，产生肺动脉高压等多种因素的心脏病动脉高压等多种因素的心脏病。根据起病的缓急和病程长短。根据起病的缓急和病程长短，可分为急性和慢性两种，以，可分为急性和慢性两种，以后者为多见。后者为多见。现在学习的是第40页，共81页一、弹性蛋白酶诱发兔肺气肿模型一、弹性蛋白酶诱发兔肺气肿模型 造模原理造模原理 肺组织中参与肺泡壁降解的蛋白酶主要是弹性蛋肺组织中参与肺泡壁降解的蛋白酶主要是弹性蛋白酶白酶(elastase)(elastase)。弹性蛋白酶和弹性蛋白酶抑制因子。弹性蛋白酶和弹性蛋白酶抑制因子( (主主要为要为- -抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶) )失平衡可能在肺气肿发生中起一失平衡可能在肺气肿发生中起一定作用。定作用。 现在学习的是第41页，共81页 在正常情况下在正常情况下,弹性蛋白酶抑制因子可以抑制此酶的弹性蛋白酶抑制因子可以抑制此酶的活性活性,使使弹性蛋白酶弹性蛋白酶与与弹性蛋白酶抑制因子弹性蛋白酶抑制因子之间处于平之间处于平衡状态衡状态,维持肺组织正常结构维持肺组织正常结构,避免肺气肿的发生避免肺气肿的发生,但当但当弹性蛋白酶活性过强时可造成肺气肿。弹性蛋白酶活性过强时可造成肺气肿。 本模型主要基于肺气肿形成的弹性蛋白酶和弹性蛋白本模型主要基于肺气肿形成的弹性蛋白酶和弹性蛋白酶抑制因子之间的失平衡学说。弹性蛋白酶注入肺内后酶抑制因子之间的失平衡学说。弹性蛋白酶注入肺内后,穿越肺泡上皮细胞进入肺间质穿越肺泡上皮细胞进入肺间质,降解弹性纤维降解弹性纤维, 从而形从而形成肺气肿。成肺气肿。现在学习的是第42页，共81页 操作方法操作方法 体重体重2.52.53.0 kg3.0 kg雄性新西兰白兔。雄性新西兰白兔。 1.1.家兔用氯胺酮麻醉后家兔用氯胺酮麻醉后, ,仰卧位固定在操作台上仰卧位固定在操作台上, ,将内径将内径3.0mm3.0mm的的气管插管插入家兔气管内。气管插管插入家兔气管内。 2.2.经气管插管缓慢注入胰弹性蛋白酶经气管插管缓慢注入胰弹性蛋白酶2000U/kg2000U/kg体重体重3 ml3 ml。将。将兔直立旋转，使药液均匀分布于两肺内。兔直立旋转，使药液均匀分布于两肺内。 3.3.气管内注入胰弹性蛋白酶后气管内注入胰弹性蛋白酶后2 2、4 4和和6 6周分别处死动物，切周分别处死动物，切取肺组织取肺组织, ,在在10%10%中性缓冲甲醛液中固定后中性缓冲甲醛液中固定后, ,常规制备石蜡切片常规制备石蜡切片, ,观观察肺病变。察肺病变。 4.4.用图像分析仪进行形态定量分析用图像分析仪进行形态定量分析 每只动物观察每只动物观察2 2张切片张切片, ,每每张切片随机观察测量张切片随机观察测量8 8个视野。测量平均肺泡面积、单位面积肺个视野。测量平均肺泡面积、单位面积肺泡数和平均内衬间隔。泡数和平均内衬间隔。 现在学习的是第43页，共81页 结果结果 注入胰弹性蛋白酶后注入胰弹性蛋白酶后2 2周，肺组织充血、水肿周，肺组织充血、水肿, ,各级各级支气管、血管周围、肺间质内有大量中性粒细胞、巨支气管、血管周围、肺间质内有大量中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞浸润。噬细胞等炎症细胞浸润。 4 4周时上述改变进一步加重，部分肺泡腔明显扩大。周时上述改变进一步加重，部分肺泡腔明显扩大。 6 6周时，呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊及肺泡扩周时，呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊及肺泡扩大，肺泡壁变薄、断裂，有的已融合成肺大泡，形成中大，肺泡壁变薄、断裂，有的已融合成肺大泡，形成中度肺气肿。度肺气肿。 现在学习的是第44页，共81页 注意事项注意事项 1. 1.在弹性蛋白酶诱发肺气肿模型时在弹性蛋白酶诱发肺气肿模型时, ,目前应用较多的弹目前应用较多的弹性蛋白酶为猪胰弹性蛋白酶，也可使用从人中性粒细胞性蛋白酶为猪胰弹性蛋白酶，也可使用从人中性粒细胞中提取的弹性蛋白酶中提取的弹性蛋白酶, ,前者作用较强。前者作用较强。 2.2.可有多种给药途径给弹性蛋白酶，如雾化吸入、气管可有多种给药途径给弹性蛋白酶，如雾化吸入、气管穿刺滴入、气管插管滴入和静脉注射等。穿刺滴入、气管插管滴入和静脉注射等。现在学习的是第45页，共81页二、野百合碱诱发大鼠肺心病模型二、野百合碱诱发大鼠肺心病模型 造模原理造模原理 野百合碱能损伤肺小动脉内皮细胞野百合碱能损伤肺小动脉内皮细胞, ,引起动脉壁增厚引起动脉壁增厚, ,管腔缩小管腔缩小, ,血管阻力增加血管阻力增加, ,使右心负荷加重使右心负荷加重, ,导致肺心导致肺心病。病。 现在学习的是第46页，共81页 主要试剂主要试剂 用纯乙醇与生理盐水用纯乙醇与生理盐水( (体积比体积比2:8)2:8)混合液配制混合液配制2%2%野野百合碱水溶液。百合碱水溶液。 操作方法操作方法 雄性成年大鼠。对照组大鼠腹腔注射等体积纯乙醇雄性成年大鼠。对照组大鼠腹腔注射等体积纯乙醇与生理盐水与生理盐水( (体积比体积比2:8)2:8)混合液，模型组大鼠一次性腹混合液，模型组大鼠一次性腹腔注射腔注射2%2%野百合碱水溶液野百合碱水溶液60mg/kg60mg/kg体重。体重。现在学习的是第47页，共81页 结果结果 对照组大鼠肺血管内皮细胞扁平、连续、分布均匀，对照组大鼠肺血管内皮细胞扁平、连续、分布均匀，大小、薄厚较一致。注射野百合碱后大小、薄厚较一致。注射野百合碱后13d13d即可出现肺心即可出现肺心病。可见肺血管明显损伤病。可见肺血管明显损伤, ,内皮细胞变性肿胀内皮细胞变性肿胀, ,突向管突向管腔腔, ,甚至坏死脱落。肺内肌型动脉中膜比例增大甚至坏死脱落。肺内肌型动脉中膜比例增大, ,血血管壁增厚管壁增厚, ,管腔变窄管腔变窄, ,有的可完全闭塞有的可完全闭塞, ,可见血管周围可见血管周围炎。另外右心肥大指数增加。炎。另外右心肥大指数增加。 现在学习的是第48页，共81页第五节第五节肺水肿动物模型肺水肿动物模型现在学习的是第49页，共81页 肺水肿肺水肿(pulmonary edema)(pulmonary edema)是指液体在肺泡间质和是指液体在肺泡间质和( (或或) )肺泡内过多聚积所致的综合征。肺泡内过多聚积所致的综合征。 肺水肿是常见的危重急症肺水肿是常见的危重急症, ,可由多种原因引起可由多种原因引起, ,大多数大多数是由于肺毛细血管壁通透性增加和是由于肺毛细血管壁通透性增加和( (或或) )毛细血管内流体毛细血管内流体静压升高所致。静压升高所致。 现在学习的是第50页，共81页一、油酸诱发大鼠肺水肿模型一、油酸诱发大鼠肺水肿模型 造模原理造模原理 可能是由于油酸进入机体后，激活补体，产生可能是由于油酸进入机体后，激活补体，产生C5a,C5a,后后者趋化炎细胞聚集在肺内者趋化炎细胞聚集在肺内, ,释放自由基释放自由基, ,损伤肺毛细血管损伤肺毛细血管内皮细胞内皮细胞, ,使之通透性增加使之通透性增加, ,引起肺水肿。引起肺水肿。 现在学习的是第51页，共81页 操作方法操作方法 体重体重250g250g的的SDSD或或WistarWistar大鼠大鼠, ,性别不限。通过静脉性别不限。通过静脉缓慢注射油酸缓慢注射油酸0.1ml/kg0.1ml/kg体重，注射油酸后不同时间处体重，注射油酸后不同时间处死动物死动物, ,称体重称体重, ,开胸，结扎气管后取出心肺，分离心开胸，结扎气管后取出心肺，分离心脏脏, ,称肺重，测量肺系数称肺重，测量肺系数。 现在学习的是第52页，共81页二、肾上腺素诱发家兔肺水肿模型二、肾上腺素诱发家兔肺水肿模型 操作方法操作方法 家兔家兔2.52.53kg3kg。家兔耳缘静脉缓慢注射。家兔耳缘静脉缓慢注射0.1%0.1%肾上腺素肾上腺素1.0ml/kg1.0ml/kg体重。体重。 解剖可见肺脏明显肿大、膨隆、淤血、出血解剖可见肺脏明显肿大、膨隆、淤血、出血, ,切面有切面有粉红色泡沫样液体溢出。肺湿重和肺系数可增至正常对粉红色泡沫样液体溢出。肺湿重和肺系数可增至正常对照的照的2 23 3倍或以上。间质和肺泡内充满富含蛋白的水倍或以上。间质和肺泡内充满富含蛋白的水肿液肿液, ,肺不张肺不张, ,萎陷萎陷, ,出血。出血。 现在学习的是第53页，共81页第六节第六节肺纤维化动物模型肺纤维化动物模型现在学习的是第54页，共81页 肺纤维化（肺纤维化（pulmonary fibrosispulmonary fibrosis）是多种原因引起慢）是多种原因引起慢性肺疾病的共同结局，是呼吸衰竭的主要病理基础，其病性肺疾病的共同结局，是呼吸衰竭的主要病理基础，其病理改变过程是肺部炎症导致肺泡持续性损伤，经反复破坏理改变过程是肺部炎症导致肺泡持续性损伤，经反复破坏、修复、重建，最后引起细胞外基质过度沉积。、修复、重建，最后引起细胞外基质过度沉积。现在学习的是第55页，共81页 造模原理造模原理 博莱霉素博莱霉素(bleomycin)(bleomycin)致肺纤维化的机制迄今未明，可致肺纤维化的机制迄今未明，可能与自由基损伤、免疫机制和胶原调节失调等有关能与自由基损伤、免疫机制和胶原调节失调等有关, ,其其中自由基损伤可能是主要机制中自由基损伤可能是主要机制, ,活性氧造成急性肺泡炎活性氧造成急性肺泡炎, ,进而发展为肺纤维化。进而发展为肺纤维化。 现在学习的是第56页，共81页 实验动物实验动物 体重体重200g200g左右的左右的SDSD或或WistarWistar大鼠。大鼠。 主要试剂主要试剂 博莱霉素博莱霉素, , 用生理盐水配成用生理盐水配成4mg/ml4mg/ml溶液溶液. .立式照明灯立式照明灯或额戴式喉镜；斜端聚乙烯塑料管或额戴式喉镜；斜端聚乙烯塑料管( (作为气管插管用作为气管插管用) )。 现在学习的是第57页，共81页 操作步骤操作步骤 1.1.乙醚麻醉后乙醚麻醉后, , 仰位以上门齿为悬挂点使大鼠斜仰位以上门齿为悬挂点使大鼠斜挂在挂在6060鼠台上鼠台上, , 颈前放置照明灯颈前放置照明灯现在学习的是第58页，共81页 2.2.垫小块纱布将鼠舌拉出垫小块纱布将鼠舌拉出, , 用压舌板压住舌腹用压舌板压住舌腹, , 趁动物趁动物吸气瞬间吸气瞬间迅速将平端聚乙烯塑料管迅速将平端聚乙烯塑料管( (连连1ml1ml注射器注射器, ,内盛博莱内盛博莱霉素霉素NSNS溶液溶液) )通过声带开口插入气管通过声带开口插入气管4 45cm, 5cm, 用棉絮试验导用棉絮试验导管是否进入气管管是否进入气管, ,确定后缓慢注入博莱霉素溶液确定后缓慢注入博莱霉素溶液, ,剂量为剂量为5mg/kg (0.25ml/5mg/kg (0.25ml/只只) )。 3.3.注入药物后将动物注入药物后将动物直立搓动旋转直立搓动旋转, , 尽量使药液在肺内分布尽量使药液在肺内分布均匀。均匀。 4.4.注入药液后注入药液后3 3、7 7、1414和和28d28d处死动物处死动物, , 收集肺标本收集肺标本, , 部部分用于检测肺分用于检测肺羟脯氨酸羟脯氨酸含量等含量等, , 部分用中性福尔马林固定部分用中性福尔马林固定, , 常规石蜡切片常规石蜡切片, HE(, HE(苏木精苏木精- -伊红伊红) )和结缔组织染色和结缔组织染色。现在学习的是第59页，共81页 结果结果 注入药液后注入药液后3d3d和和7d7d表现为肺明显表现为肺明显急性炎症急性炎症, ,肺间隔水肺间隔水肿肿, ,炎症细胞浸润炎症细胞浸润, ,以嗜中性粒细胞和单核巨噬细胞为主以嗜中性粒细胞和单核巨噬细胞为主, , 伴有轻度出血。伴有轻度出血。 14d14d肺脏系数肺脏系数( (肺重肺重/ /体重体重) )增加增加, ,肺泡壁肺泡巨噬细胞、肺泡壁肺泡巨噬细胞、淋巴细胞等炎症细胞明显减少淋巴细胞等炎症细胞明显减少, ,成纤维细胞增多成纤维细胞增多, ,肺泡隔肺泡隔明显增宽明显增宽, ,有胶原沉积有胶原沉积, ,呈斑片状纤维化改变。呈斑片状纤维化改变。 28d28d时肺组织结构破坏时肺组织结构破坏, , 肺泡腔明显缩小肺泡腔明显缩小, , 部分肺泡部分肺泡塌陷或消失塌陷或消失, , 肺间质出现大量胶原纤维和成纤维细胞肺间质出现大量胶原纤维和成纤维细胞, , 形成弥漫性肺纤维化。形成弥漫性肺纤维化。现在学习的是第60页，共81页 模型评价模型评价 1. 1. 博莱霉素是多肽类抗肿瘤药物博莱霉素是多肽类抗肿瘤药物, , 单次气管内注单次气管内注入可复制出与人类肺纤维化相似的动物模型入可复制出与人类肺纤维化相似的动物模型, , 具有具有操作简便、造模稳定的优点操作简便、造模稳定的优点, , 是目前最常用的肺纤维是目前最常用的肺纤维化动物模型。化动物模型。 2. 2. 适当掌握适当掌握麻醉深度麻醉深度, , 气管气管插管操作插管操作应熟练应熟练, , 否否则可能造成咽喉、声带损伤。则可能造成咽喉、声带损伤。 3. 3. 除前述的气管插管外除前述的气管插管外, , 也可在麻醉下也可在麻醉下, , 切开颈切开颈前皮肤分离气管前皮肤分离气管, , 用用4 4号针头在气管环状软骨之间号针头在气管环状软骨之间刺入气管内注药刺入气管内注药, , 这在小鼠较为常用这在小鼠较为常用. . 也可采用也可采用经经鼻吸入鼻吸入的方法的方法. .现在学习的是第61页，共81页 4. 4.