基因的表达与调控上 (3).ppt

关于基因的表达与调控上 (3)现在学习的是第1页，共56页自然选择倾向于保留高效率的生命过程。在每30分钟增殖一次的109细菌群体中，若一个细菌变成29.5分钟增殖，经过 80天 的连续生长后，这个群体中的99.9%都将具有29.5分钟增殖一倍的生长速度。原核生物细胞的基因和蛋白质种类较少，如大肠杆菌基因组约为4.20106bp共有 4 288个开放读码框 。据估计，一个细胞中总共含有107个蛋白质分子。现在学习的是第2页，共56页每个大肠杆菌细胞有约15 000个 核糖体，50种 核糖体蛋白、糖酵解体系的酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等都是代谢过程中必需的，其合成速率不受环境变化或代谢状态的影响，这一类蛋白质被称为永久型（constitutive）合成的蛋白质。另一类则被称为适应型或调节型(adaptive or regulated)，因为这类蛋白质的合成速率明显地受环境的影响而改变。如大肠杆菌细胞中一般只有15个-半乳糖苷酶 ，但若将细胞培养在只含乳糖的培养基中，每细胞中这个酶的量可高达几万个分子。现在学习的是第3页，共56页随着生物个体的发育，DNA分子能有序地将其所承载的遗传信息，通过密码子-反密码子系统转变成蛋白质，执行各种生理生化功能。科学家把从DNA到蛋白质的过程称为基因表达（gene expression），对这个过程的调节就称为基因表达调控（gene regulation或gene control）。8. 1 原核基因表达调控总论现在学习的是第4页，共56页图8-1 基因表达 DNA分子有序地将其所承载的遗传信息，通过密码子-反密码子系统，转变成蛋白质分子，这个过程称为基因表达。基因表达的第一步是由RNA聚合酶拷贝DNA双链中的模板链，生成与该序列完全互补（除了T被置换成U之外）的RNA链。现在学习的是第5页，共56页基因表达调控主要表现在以下二方面：转录水平上的调控( transcriptional regulation)；转录后水平上的调控(post-transcriptional regulation)，包括mRNA加工成熟水平调控(differential processing of RNA transcript)以及翻译水平调控(differential translation of mRNA)。细菌的转录与翻译过程几乎发生在同一时间间隔内，转录与翻译相耦联（coupled transcription and translation）。真核生物中，转录产物（primary transcript）只有从核内运转到核外，才能被核糖体翻译成蛋白质（图8-2）。现在学习的是第6页，共56页现在学习的是第7页，共56页原核生物的基因调控主要是转录调控，包括负转录调控和正转录调控。现在学习的是第8页，共56页在负转录调控系统中，调节基因的产物是阻遏蛋白（repressor），阻止结构基因转录。根据其作用特征又分为负控诱导和负控阻遏二大类。在负控诱导系统中，阻遏蛋白与效应物（诱导物）结合时，结构基因转录；在负控阻遏系统中，阻遏蛋白与效应物结合时，结构基因不转录。阻遏蛋白作用于操纵区。现在学习的是第9页，共56页在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白（activator）。根据其作用特性分为正控诱导系统和正控阻遏系统。在正控诱导系统中，效应物分子（诱导物）的存在使激活蛋白处于活性状态；在正控阻遏系统中，效应物分子的存在使激活蛋白处于非活性状态。现在学习的是第10页，共56页现在学习的是第11页，共56页因子 在结构上具有同源性，所以统称 70家族，含有4个保守区（图8-4），其中第2个和第4个保守区参与结合启动区DNA，第2个保守区的另一部分还参与双链DNA 解开成单链的过程。参与大肠杆菌中基因表达调控最常见的蛋白质可能是因子现在学习的是第12页，共56页图8-4 大肠杆菌中的因子大肠杆菌中的因子（以 70 为例）主要包括4个结构域，其中 第2个和第4个保守区参与结合启动区DNA，第2个保守区的另一部分还参与双链DNA解开成单链的过程 。 因子特异性结合DNA上的-35区和-10区。现在学习的是第13页，共56页 70因子特异性结合DNA上的 -35区和-10区 ，而 54因子识别并与DNA上的 -24和-12区相结合。在与启动子结合的顺序上，70类启动子在核心酶结合到DNA链上之后才能与启动子区相结合，而54则类似于真核生物的TATA区结合蛋白（TBP），可以在无核心酶时独立结合到启动子上。现在学习的是第14页，共56页现在学习的是第15页，共56页原核基因表达调控的主要特点主要分为：可诱导调节和可阻遏调节可诱导调节： 是指一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态，及在某些物质的诱导下使基因活化。 大肠杆菌的乳糖操纵子现在学习的是第16页，共56页可阻遏调节： 这类基因平时都是开启的，处于产生蛋白质或酶的工作工程中，由于一些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭，阻遏了基因的表达。 大肠杆菌的色氨酸操纵子现在学习的是第17页，共56页弱化子对基因活性的影响 当操纵子被阻遏，RNA合成终止时，起终止转录信号作用的那一段核苷酸被称为弱化子 特殊负载的氨基酰-tRNA现在学习的是第18页，共56页降解物对基因活性的调节 有葡萄糖存在的情况下，即使在细菌培养基中加入乳糖，半乳糖，阿拉伯糖或麦芽糖等诱导物，与其相对应的操纵子也不会启动，产生出代谢这些糖的酶来。这种现象称为葡萄糖效应现在学习的是第19页，共56页细菌的应急反应 细菌有时会碰到紧急状况，比如氨基酸饥饿，及氨基酸全面匮乏，为了紧缩开支，渡过难关，细菌将会产生一个应急反应，包括生产各种RNA，糖，脂肪和蛋白质在内的几乎全部生物化学反应过程均被停止。信号是：鸟苷四磷酸（ppGpp）和鸟苷五磷酸（pppGpp）现在学习的是第20页，共56页8. 2 乳糖操纵子与负控诱导系统大肠杆菌乳糖操纵子（ lactose operon）包括3个结构基因：Z、Y和A，以及启动子、控制子和阻遏子等。转录的调控是在启动区和操纵区进行的。现在学习的是第21页，共56页现在学习的是第22页，共56页3个结构基因各决定一种酶：Z编码-半乳糖苷酶，是一种-半乳糖苷键的专一性酶，除能将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，还能水解其他-半乳糖苷（如苯基半乳糖苷） ；Y编码-半乳糖苷透过酶，它能使外界的-半乳糖苷透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内；A编码-半乳糖苷乙酰基转移酶，把乙酰辅酶A上的乙酰基转移到半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。现在学习的是第23页，共56页8. 2. 1 酶的诱导lac体系受调控的证据一般情况下，lac + 基因型大肠杆菌细胞内 -半乳糖苷酶和透过酶的浓度很低，每个细胞只有12个酶分子。但是，在乳糖培养基上酶的浓度很快达到细胞总蛋白量的6%或7%，超过105个酶分子/细胞。现在学习的是第24页，共56页在无葡萄糖有乳糖的培养基中，lac + 细菌中将同时合成-半乳糖苷酶和透过酶。用32P标记的mRNA与模板DNA进行定量分子杂交，表明培养基中加入乳糖12分钟 后，编码-半乳糖苷酶和透过酶的lac mRNA量就 迅速增加，去掉乳糖后，lac mRNA量 立即下降。现在学习的是第25页，共56页图8-7现在学习的是第26页，共56页实验室常用两种乳糖类似物异丙基巯基半乳糖苷（IPTG）和巯甲基半乳糖苷（TMG），在酶活性分析中常用发色底物O-硝基半乳糖苷（ONPG）。因为它们都不是半乳糖苷酶的底物，所以又称为安慰性诱导物（ gratuitous inducer）。图88现在学习的是第27页，共56页用35S标记大肠杆菌细胞（培养基中没有半乳糖），将这些带有放射性的细菌转移到不含35S的培养基中，加入诱导物后-半乳糖苷酶便开始合成。分离纯化-半乳糖苷酶， 发现这种酶无35S标记，说明这种酶是加入诱导物后新合成的。现在学习的是第28页，共56页8. 2. 2 操纵子模型及其影响因子Jacob和Monod认为 诱导酶（他们当时称为适应酶）现象是个基因调控问题，而且可以用实验方法进行研究，他们通过大量实验及分析，建立了现在已经被人们广泛接受的乳糖操纵子的控制模型。现在学习的是第29页，共56页现在学习的是第30页，共56页1. Z、Y、A基因 产物由同一条多顺反子 mRNA分子所编码。2. 该mRNA分子的 启动区(P)位于阻遏基因( I )与操纵区( O ) 之间，不能单独起始半乳糖苷酶和透过酶基因的高效表达。3. 操纵区是DNA上的一小段序列（仅为26bp），是 阻遏物的结合位点。4. 当 阻遏物与操纵区相结合 时，lac mRNA的 转录起始受到抑制。5. 诱导物通过与阻遏物结合，改变其三维构象， 使之不能与操纵区相结合，诱发lac mRNA的合成。这就是说，有诱导物存在时，操纵区没有被阻遏物占据，所以 启动子能够顺利起始mRNA的转录。现在学习的是第31页，共56页现在学习的是第32页，共56页阻遏物lacI基因产物及功能lac操纵子阻遏物mRNA是由弱启动子控制下永久型合成的，该阻遏蛋白有4个相同的亚基，每个亚基均含有347个氨基酸残基，并能与1分子IPTG结合,每个细胞中有510个阻遏物分子。现在学习的是第33页，共56页如果将葡萄糖和乳糖同时加入培养基中，大肠杆菌在耗尽外源葡萄糖之前不会诱发lac操纵子（图7-11）。现在学习的是第34页，共56页现在学习的是第35页，共56页某大肠杆菌突变体，它不能将葡萄糖-6-磷酸转化为下一步代谢中间物，该细菌的lac基因能在葡萄糖存在时被诱导合成。所以，不是葡萄糖而是它的某些降解产物抑制lac mRNA的合成 ，科学上把葡萄糖的这种效应称之为代谢物阻遏效应（cataboliterepression）。现在学习的是第36页，共56页cAMP与代谢物激活蛋白cAMP是在 腺苷酸环化酶的作用下由ATP 转变而来的，在真核生物的激素调节过程中也起着十分重要的作用。将细菌放在含葡萄糖的培养基中培养，cAMP的浓度就低；如果培养基中只有甘油或乳糖等不进行糖酵解途径的碳源，cAMP的浓度就会很高 。现在学习的是第37页，共56页现在学习的是第38页，共56页大肠杆菌中的代谢物激活蛋白，由Crp 基因编码，能与cAMP形成复合物 。CRP和cAMP都是合成lac mRNA所必需的，cAMP-CRP 是一个不同于阻遏物的正调控因子，而lac操纵子的功能是在这两个相互独立的调控体系作用下实现的。现在学习的是第39页，共56页半乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖、山梨醇等在降解过程中均转化成葡萄糖或糖酵解途径中的其他中间产物，这些糖代谢中有关的酶都是由 可诱导操纵子控制的，只要有葡萄糖存在，这些操纵子就不表达，被称为 降解物敏感型操纵子(catabolite sensitive operon），实验证明这些 操纵子都是由cAMP-CRP 调控。现在学习的是第40页，共56页图7-13gal，lac和ara操纵子上游启动子区与CRP-cAMP结合位点的相对位置分析现在学习的是第41页，共56页CRP和cAMP都是合成lac mRNA所必需的， cAMP-CRP复合物 是激活lac的重要组成部分。细菌对于此复合物的需要是独立的，转录必须有cAMP-CRP复合物结合在DNA的启动子区域上 。凡Crp及腺苷酸环化酶基因突变的细菌都不能合成lac mRNA 。cAMP-CRP是一个不同于阻遏物的正调控因子， lac操纵子的功能是在这两个相互独立的调控体系作用下实现的。现在学习的是第42页，共56页现在学习的是第43页，共56页图 7-15 CRP-cAMP 与上游DNA位点结合后造成模板DNA沿对称序列中央发生90的弯曲cAMP-CRP复合物与启动子区的结合是lac mRNA合成起始所必需的，因为这个复合物结合于 启动子上游，使DNA双螺旋发生弯曲 ，有利于形成稳定的开放型启动子-RNA聚合酶结构。现在学习的是第44页，共56页8. 2. 3 lac操纵子的调控区域P、O区P区（即启动子区）一般是从I基因结束到mRNA转录起始位点下游510bp ，而 O区（即阻遏物结合区）位于-7+28 位，该区的碱基序列有对称性，其对称轴在+11位碱基对。现在学习的是第45页，共56页图8-16 不同操纵子启动区及O区相对位置的比较。实验表明，阻遏物与O区的结合影响了RNA聚合酶与启动区结合形成转录起始复合物的效率。现在学习的是第46页，共56页1、lac基因产物数量上的比较在完全被诱导的细胞中， -半乳糖苷酶、透过酶及乙酰基转移酶 的拷贝数比例为1：0.5：0.2 ，这个比例在一定程度上反映了以-半乳糖苷作为唯一碳源时细胞的需要。不同的酶在数量上的差异是由于在翻译水平上受到调节所致。8. 2. 4 lac操纵子中的其他问题现在学习的是第47页，共56页lac mRNA可能与翻译过程中的核糖体相脱离，从而终止蛋白质链的翻译。因此，存在着从mRNA的5 末端到3末端的蛋白质合成梯度，这对于多顺反子mRNA分子具有普遍性。在lac mRNA分子内部，A基因比Z基因更易受内切酶作用发生降解，因此，在任何时候Z基因的完整拷贝数要比A基因多。现在学习的是第48页，共56页2、操纵子的融合与基因工程负责嘌呤合成的pur操纵子 在染色体上位于lac操纵子沿转录方向的下游，中间只隔了一个控制细胞对T6噬菌体敏感性的tsx基因。 pur操纵子被“嫁接”到lac启动子上，形成融合基因。因为lac启动子是一个很强的启动子，通过它可以使较弱启动子的转录增强。现在学习的是第49页，共56页8. 3 色氨酸操纵子与负控阻遏系统trp体系参与生物合成，它 不受葡萄糖或cAMP-CRP的调控。色氨酸的合成主要分5步完成，有7个基因 参与整个合成过程。现在学习的是第50页，共56页色氨酸的合成分5步完成，有7个基因参与：trpE和trpG编码邻氨基苯甲酸合酶，trpD编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶，trpF编码异构酶，trpC编码吲哚甘油磷酸合酶，trpA和trpB则分别编码色氨酸合酶的和亚基。在许多细菌中，trpE和trpG，trpC和trpB分别融合成一个基因，产生具有双重功能的蛋白质。现在学习的是第51页，共56页图8-17细菌中色氨酸生物径。现在学习的是第52页，共56页在色氨酸的合成过程中，细菌中还有pabA，pabB 基因分别编码ADC合酶的两个亚基， pabC 基因编码ADC裂解酶， ubiC 基因编码分枝酸裂解酶，entC 基因编码异构分枝酸合酶，这些基因产物都在不同程度上参与了分枝酸代谢，与色氨酸合成有一定关系。现在学习的是第53页，共56页现在学习的是第54页，共56页trp操纵子中产生阻遏物的基因是trpR，该基因距trp基因簇很远。后者位于大肠杆菌染色体图上25分钟处，而前者则位于90分钟处。在位于65分钟处还有一个trpS（色氨酸tRNA合成酶），它与携带有色氨酸的tRNA Trp共同参与trp操纵子的调控作用。trpE基因是第一个被翻译的基因，与trpE紧邻的是启动子区和操纵区。前导区和弱化子区分别定名为trpL和trpa。现在学习的是第55页，共56页感谢大家观看感谢大家观看现在学习的是第56页，共56页