中药制剂分析新技术新方法讲稿.ppt

中药制剂分析新技术新方法第一页，讲稿共四十九页哦中国药典中药分析方法发展趋势中国药典中药分析方法发展趋势u1977版药典收载显微鉴别版药典收载显微鉴别u1985版药典收载版药典收载TLC鉴别鉴别u1990版药典收载对照药材的版药典收载对照药材的TLC鉴别和色谱方法的含量测定鉴别和色谱方法的含量测定u2000版药典建立了以色谱法含量测定为主导的质控方法版药典建立了以色谱法含量测定为主导的质控方法u2005版药典大幅度增加版药典大幅度增加HPLC方法，重视特征成分、活性成分的测方法，重视特征成分、活性成分的测定定u2010版药典增加了指纹图谱的测定版药典增加了指纹图谱的测定趋势：新方法新技术不断引入中药的质量控制中。趋势：新方法新技术不断引入中药的质量控制中。第二页，讲稿共四十九页哦高效毛细管电泳2中药指纹图谱3中药化学指纹图谱技术、中药DNA指纹图谱技术现代色谱技术1顶空气相色谱法、超高效液相色谱、超临界流体色谱提纲 OUTLINE第三页，讲稿共四十九页哦 1 现代色谱技术现代色谱技术v1、顶空气相色谱法、顶空气相色谱法（液上气相色谱法、顶空分析法（液上气相色谱法、顶空分析法） 对样品对样品基质上方基质上方的的气体成分气体成分进行进行GC分析分析来测定这些组分在原样品中的含量来测定这些组分在原样品中的含量v顶空气相色谱的分类顶空气相色谱的分类静态顶空静态顶空GC动态顶空动态顶空GC第四页，讲稿共四十九页哦v1、顶空气相色谱法、顶空气相色谱法主要特点：主要特点：l样品前处理简单样品前处理简单l检测限低检测限低l可分析含量低、组成复杂的样品可分析含量低、组成复杂的样品l适用于易挥发或易分解或无法直接进样分适用于易挥发或易分解或无法直接进样分析的液体或固体样品的分析析的液体或固体样品的分析 1 现代色谱技术现代色谱技术第五页，讲稿共四十九页哦v顶空气相色谱法应用实例顶空气相色谱法应用实例顶空固相微萃取顶空固相微萃取 - 气相色谱法测定鱼腥草注射液中甲基正壬酮气相色谱法测定鱼腥草注射液中甲基正壬酮含量含量样品制备：样品制备：精密量取鱼腥草注射液 1ml，置顶空取样瓶中，精密加入内标物溶液 50l，摇匀，密封，作为供试品溶液。色谱条件色谱条件 （略）（略）顶空分析条件顶空分析条件 平衡温度为50，平衡时间为10分钟（快速搅拌下），阀、输送管及定量管温度为80，加压为13.8kPa，加压时间、充样时间和压力平衡时间均为0.15分钟，定量管为1.0ml。 1 现代色谱技术现代色谱技术第六页，讲稿共四十九页哦 1 现代色谱技术现代色谱技术v2、超高效液相色谱、超高效液相色谱（UPLC，Ultra Performance Liquid Chromatography）主要特点主要特点v固定相固定相双（三乙氧基硅）乙烷在硅胶中形成桥式乙基双（三乙氧基硅）乙烷在硅胶中形成桥式乙基基团基团颗粒粒度小，仅为颗粒粒度小，仅为1.7m耐压，颗粒度分布范围很窄耐压，颗粒度分布范围很窄第七页，讲稿共四十九页哦 1 现代色谱技术现代色谱技术v2、超高效液相色谱、超高效液相色谱（UPLC，Ultra Performance Liquid Chromatography）主要特点主要特点v检测器检测器响应快响应快样品池样品池10mm的光程（与普通的光程（与普通HPLC相同）而体积相同）而体积只有只有500nL（普通（普通HPLC的的20分之一）分之一） 优点优点v更高的分析速度，更好分离效果和更高的灵敏更高的分析速度，更好分离效果和更高的灵敏度，速度、灵敏度及分离度，分别是度，速度、灵敏度及分离度，分别是HPLC的的9倍、倍、 1.7倍及倍及3倍倍 第八页，讲稿共四十九页哦样品的前处理v分子印迹技术制备对特定目标分子具有分子识别性能的分子印迹聚合物的技术。分子印迹聚合物兼备了生物识别体系和化学识别体系的优点, 具有抗恶劣环境、选择性高、稳定性好、机械强度高、制备简单等特点, 可选择性识别富集复杂样品中的目标物。用于固相萃取、固相微萃取、膜萃取等样品前处理技术。第九页，讲稿共四十九页哦 1 现代色谱技术现代色谱技术v3、超临界流体色谱、超临界流体色谱（SFC, supercritical fluid chromatography）以超临界流体（低黏度、高密度以及较高的扩散系数）作为以超临界流体（低黏度、高密度以及较高的扩散系数）作为流动相。流动相。对对GC及及HPLC的检测器均可兼容使用的检测器均可兼容使用适用于分析适用于分析GC难以处理的高沸点、不挥发性样品难以处理的高沸点、不挥发性样品分离速度较分离速度较HPLC，分离效果更好。，分离效果更好。v应用实例应用实例超临界流体色谱法测定怀牛膝制剂中齐墩果酸的含量超临界流体色谱法测定怀牛膝制剂中齐墩果酸的含量第十页，讲稿共四十九页哦 2 高效毛细管电泳高效毛细管电泳v电泳电泳: 在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象。 由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。1937年 Tiselius (瑞典) 利用自由溶液电泳自由溶液电泳将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和、球蛋白1981年 Jorgenson 和 Luckas 发展了高效毛细管电泳分离分高效毛细管电泳分离分析技术析技术 (使用75m内径石英毛细管和采用了高达数千伏的电压)，第十一页，讲稿共四十九页哦 2 高效毛细管电泳高效毛细管电泳 各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为： + + = =电渗流电渗流 + + +ef+ef 阳离子运动方向与电渗流一致阳离子运动方向与电渗流一致 - - = =电渗流电渗流 - - -ef-ef 阴离子运动方向与电渗流相反阴离子运动方向与电渗流相反 0 0 = =电渗流电渗流 中性粒子运动方向与电渗流一致中性粒子运动方向与电渗流一致 可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离v分离原理分离原理 电场作用下，毛细管柱中出现：电电泳现象和电渗流泳现象和电渗流现象现象。 第十二页，讲稿共四十九页哦 2 高效毛细管电泳高效毛细管电泳v仪器装置仪器装置电压：030KV。分离柱不涂敷任何固定液，紫外或激光诱导荧光检测器可检测到：10-1910-21mol/L第十三页，讲稿共四十九页哦 2 高效毛细管电泳高效毛细管电泳v主要特点主要特点优点优点v高分辨率：理论塔板数高达数百万块，甚至数千万块。v高灵敏度：可检测出低至10-21mol/L浓度的物质。v高分析速度：可在3分钟内分离30种阴离子；1.7分钟分离19种阳离子;4分钟可分离10种蛋白质.v试样用量少：仅需几nL（10-9L）的试样v仪器简单，操作成本低：分析一个试样仅需几毫升流动液第十四页，讲稿共四十九页哦 2 高效毛细管电泳高效毛细管电泳v常见的毛细管电泳模式常见的毛细管电泳模式毛细管区带电泳(CZE)毛细管胶束电动色谱(MECC)（胶束作为假固定相的电动色谱）毛细管凝胶电泳(CGE)（凝胶作为支持物，起分子筛的作用）毛细管等电聚焦电泳(CIEF)（用于蛋白质、多肽等两性物质的分离）毛细管等速电泳(CITP)第十五页，讲稿共四十九页哦 2 高效毛细管电泳高效毛细管电泳v应用应用离子分析离子分析药物分析药物分析手性化合物分析手性化合物分析氨基酸分析氨基酸分析核酸分析及核酸分析及DNA测序测序vHPCE在在中药制剂分析中的应用中药制剂分析中的应用v生物碱的测定、动物类药材的鉴别、指纹图谱生物碱的测定、动物类药材的鉴别、指纹图谱第十六页，讲稿共四十九页哦高效毛细管电泳法测定心舒口服液中腺苷、芦丁和阿魏酸的高效毛细管电泳法测定心舒口服液中腺苷、芦丁和阿魏酸的含量含量对照品溶液对照品溶液 （略）（略）供试品溶液的配制供试品溶液的配制取心舒口服液10 mL，加热浓缩至约1 mL，加60 %甲醇定容10 mL，冰箱放置过夜，经0. 45 mm滤膜滤过备用。电泳条件电泳条件以熔融石英毛细管( 50 mm 66 . 5 cm，有效分离长度58 cm) 为分离通道，以105 mmol/L硼砂液为运行缓冲液，压力进样50 mpa，6 s，毛细管柱温度为20 ，运行电压为0 30 min : 24 kV，30 60 min : 28 kV，检测波长为210 nm，毛细管柱使用前以0.1 mol/L 氢氧化钠溶液、注射用水和运行缓冲液依次冲洗5 ,5 ,8 min，每次电泳后以运行缓冲液冲洗8 min 。在此条件下，同时测定腺苷、芦丁和阿魏酸的含量。第十七页，讲稿共四十九页哦 3 中药指纹图谱中药指纹图谱 从整体上评价中药的内在质量v中药（化学）指纹图谱法中药（化学）指纹图谱法现代光谱（红外光谱，紫外光谱）色谱（气相色谱、薄层色谱、高效液相色谱、毛细管电泳）其它（X光衍射）第十八页，讲稿共四十九页哦 3 中药指纹图谱中药指纹图谱v中药中药DNA指纹图谱法指纹图谱法DNA分子遗分子遗传标记传标记 v DNA分子：遗传信息的直接载体，物种鉴别更为准确可靠分子：遗传信息的直接载体，物种鉴别更为准确可靠v90年代，年代，PCR (Polymorase Chain Reaction)技术，快速而灵技术，快速而灵敏地检测。敏地检测。v近年来，基于近年来，基于PCR的的RFLP、RAPD、SSR、AFLP等检测等检测DNA多态性的分子标记技术（多态性的分子标记技术（DNA指纹技术）。指纹技术）。v应用：在药材鉴定方面应用：在药材鉴定方面第十九页，讲稿共四十九页哦v广义的分子标记（molecular marker）是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。常用的是狭义的分子标记概念，即DNA分子标记。DNA分子标记主要分为以下三类 限制性片段长度多态性（RFLP）：是发展最早的分子标记技术，以分子杂交为核心技术。DNA序列测定第二十页，讲稿共四十九页哦基于基于PCR的分子标记：根据引物的选择可分的分子标记：根据引物的选择可分为随机引物扩增和特定序列位点扩增。为随机引物扩增和特定序列位点扩增。随机扩增多态性随机扩增多态性DNA（Random amplified polymorphic DNA,RAPD）。）。随机引物扩增随机引物扩增PCR（Arbitrary Primer-PCR,AP-PCR）第二十一页，讲稿共四十九页哦2、DNA扩增产物指纹分析（DNA amplification fingerprinting,DAF）:与RAPD技术不同的是引物浓度更高，长度更短（58个bp），只有2个温度循环（在RAPD中是3个温度循环），一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳。3、特征扩增区段测序（Sequence-characterized amplified regions，SCAR）：先做RAPD分析，然后克隆目标RAPD片段进行测序，根据RAPD片段两末端的序列设计特定引物（一般比RAPD引物长，24bp），再进行PCR扩增，可把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴定出来，可重复性高。第二十二页，讲稿共四十九页哦RFLP技术及其应用技术及其应用 vRFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性内切酶切片段长度多态性)是70年代发展起来的DNA片段分析技术。该技术不仅在生物学、医学、农学的许多领域都有了成功的应用，而且在中药材品种基源及其地理品系、栽培品系的质量评价方面也有许多应用。 第二十三页，讲稿共四十九页哦基本原理基本原理 v生物在进化过程中，由于种种原因引起基因突变和DNA分子结构重排，造成了分子内核苷酸排列顺序的改变，当这种改变涉及到限制性酶切位点时，酶切后产生的DNA片段长度将发生变化，限制性片段的长度在不同个体间呈多态性现象，即称为限制性片段长度多态(Restriction Fragment Length Polymorphism,简称RFLP) 第二十四页，讲稿共四十九页哦Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)Enzymes cut DNA at specific sequencesRestriction sites are often palindromes: 6-cutter GAATTC4-cutter TCGA CTTAAGAGCT第二十五页，讲稿共四十九页哦第二十六页，讲稿共四十九页哦DNA多态性根据其产生的两种基本方式v碱基对突变类型(基因点突变),即限制性内切酶识别位点上发生了单个碱基替换(转换或颠换)，使原有切点消失或产生新的切点。v结构重排型，这是由DNA内部发生较大的顺序变化所引起的 。第二十七页，讲稿共四十九页哦第二十八页，讲稿共四十九页哦RFLP与镰状细胞贫血第二十九页，讲稿共四十九页哦基本实验步骤基本实验步骤v靶DNA的准备 v核酸探针的标记 v杂交显示 第三十页，讲稿共四十九页哦RFLP的优点及局限性的优点及局限性 v优点： (1)普遍存在 (2)稳定性 (3)共显性 (4)探针与限制酶的组合数量无限 v局限性： （1）用RFLP仅能检测出影响到限制性内切酶识别位点的突变 （2）步骤多，工作量大，而且接触的放射性污染也多 （3）RFLP分析技术要求DNA无显著降解，因此只适用于新鲜的材料，难适用于干燥药材的鉴别 （4）限制性内切酶价格较贵 第三十一页，讲稿共四十九页哦RFLP用于亲缘关系分析“Ladder”第三十二页，讲稿共四十九页哦RFLP在中药材鉴别中的应用在中药材鉴别中的应用 （一）近缘种的鉴别（一）近缘种的鉴别 如：海马的如：海马的PCR-RFLP分析分析 （二）药用植物亲缘关系的研究二）药用植物亲缘关系的研究 如：羽扇豆属植物系统发育关系及与生如：羽扇豆属植物系统发育关系及与生 物碱分布的关系物碱分布的关系 第三十三页，讲稿共四十九页哦RAPD技术及其应用技术及其应用 vRAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)技术是1990年由杜邦公司Williams和Welsh两个研究小组同时发展起来的一项DNA多态检测技术。该技术高效、灵敏、简便、快速，一经出现就被普遍用于物种种属分类、亲缘关系分析、物种起源鉴定、目的基因筛选、农作物育种等研究领域。近年，RAPD技术又进入了中药材的鉴别研究领域，并得到广泛应用，已成为目前用于中药材鉴定报道最多的分子遗传标记技术。第三十四页，讲稿共四十九页哦RAPD技术基本原理技术基本原理vRAPD的核心技术是PCR反应，但又不同于经典的PCR。它是以任意序列的寡核苷酸为引物进行PCR扩增，Williams称之为RAPD，引物通常为10个碱基；Welsh称之为AP-PCR(Arbitrary Primer PCR)，引物为2030个碱基。对于任一引物，如在一定范围内模板DNA上有与之互补的反向重复序列时，就可扩增出此范围的DNA片段。第三十五页，讲稿共四十九页哦RAPD: randomly amplified polymorphic DNA第三十六页，讲稿共四十九页哦基本实验步骤基本实验步骤 v模板DNA的制备 vPCR扩增，通常RAPD扩增条件为：93预变性200s，开始如下循环：94变性lmin，36退火1min，72延伸2min；经过40个循环后，72延伸5min，循环结束后反应产物置于4保存。 v扩增产物20l反应产物走凝胶电泳，经溴化乙锭染色检测扩增的情况 vRAPD图谱的数据处理 第三十七页，讲稿共四十九页哦RAPD分析的优越性和不足分析的优越性和不足v优越性： (1)无需预知被研究的生物基因组核苷酸顺序，也无需专门设计RAPD扩增反应的引物，引物随机合成或是任意选定的,长度一般为9-10个寡核苷酸； (2)扩增没有特异性； (3)退火温度较低，一般为36，这能保证短核苷酸引物与模板的稳定配对，同时也允许了适当的错误配对，以扩大引物在基因组DNA中配对的随机性。 (4)简便易行，省力省时。 （5）检测灵敏方便； （6）所需样品DNA量极少，仅为10ng,为RFLP的1/l000l/2000。 （7）能自动化。第三十八页，讲稿共四十九页哦v不足： （1）重复性不高。RAPD在扩增反应时使用的是低温复性(通常为36),特异性不高,引物与模板间有较高的错配率,结果容易受到多种因素的影响,不同的实验室这间有时不能重复； （2）对模板DNA质量要求高，操作要求严格，检验成本相对较高； （3）由于存在共迁移，分子量相同的片段可能不是同源的；另外一条带中可能含有不同的扩增产物； （4）RAPD标记难以区分开杂合子和纯合子基因型，不能有效的鉴定出杂合子。第三十九页，讲稿共四十九页哦RAPD分析在中药研究中的应用分析在中药研究中的应用 v道地药材的评价道地药材的评价 例：当归药材道地性的RAPD分析v野生与栽培种及不同农家品种野生与栽培种及不同农家品种 亲缘关系分析 例：人参及山参RAPD指纹v动物药的鉴定动物药的鉴定 例：蛇类药材分子遗传标记鉴别的研究 第四十页，讲稿共四十九页哦AFLP技术及其应用技术及其应用 v扩增酶切片段多态性 (Amplified Restriction FragmentPolymorphism)是一种基于PCR的DNA指纹技术 ，AFLP是近几年来继RFLP、RAPD之后发展最快的DNA分子标记技术。被誉为新一代的分子标记技术，近年来已得到广泛的应用。 第四十一页，讲稿共四十九页哦AFLP基本原理基本原理 vAFLP的基本原理是对基因组DNA限制性酶切片段进行选择性扩增。 先将基因组DNA用限制性酶消化，产生粘性末端。然后使用人工合成的双链接头（artificial adapter）,与基因组DNA的酶切片段相连接形成扩增反应的模板。接头和与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列作为引物的结合位点。AFLP反应的结果是主要扩增那些由上述两种酶共同酶切的片段。 第四十二页，讲稿共四十九页哦基本实验步骤基本实验步骤 v模板的制备：即DNA酶切及人工接头的连接（Restriction of the DNA and ligation of oligonucleotide adapters） v限制性片段的选择性扩增（Selective amplification of sets of restriction fragments） v扩增产物凝胶电泳分析（Gel analysis of the amplified fragments） 第四十三页，讲稿共四十九页哦AFLP的实验过程第四十四页，讲稿共四十九页哦AFLP反应流程：vAFLP反应程序主要包括模板DNA制备，酶切片段扩增及凝胶电泳分析这3个基本步骤。各步骤具体的过程有：v首先要制备高分子量(HMW)基因组DNA，选择6个碱基识别位点的限制性内切酶(通常是EcoRI或PstI或SacI)。 v酶切后的限制性片段在T4连接酶的作用下与特定的接头相连接，形成带有接头的特异性片段。 vDNA片段的预扩增。 v在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的选择性扩增。 vPCR产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上电泳。 v多态性比较分析，特异片段回收克隆分析。第四十五页，讲稿共四十九页哦第四十六页，讲稿共四十九页哦AFLPs第四十七页，讲稿共四十九页哦第四十八页，讲稿共四十九页哦荧光标记全自动AFLPFor ABI 377 DNA Sequencer and AFLP Kits第四十九页，讲稿共四十九页哦