病毒感染的分子诊断-2018年度.ppt

病毒感染的分子诊断,刘映乐,病毒学国家重点实验室,武汉大学,2018-4-23,病毒感染的分子诊断,利用分子生物学方法对病毒进行检测 分子生物学方法包括核酸扩增、核酸杂交、等温反应、质谱、普通测序、二代测序等 检测对象主要是病毒核酸,病毒感染的核酸检测,普通PCR、real-time PCR、巢式PCR、多重PCR FISH 一代测序 高通量测序,PCR,Kary B. Mullis USA,美国教授Kary B. Mullis于1983年发明了PCR技术，他因此获得了1993年诺贝尔奖,PCR,PCR优缺点及应用,优点 灵敏度高，特异性强 操作简单 设备要求低 缺点 PCR产物分析较繁琐，容易出现人为判读错误 只能进行定性检测，无法实现定量分析 应用 病毒鉴定 联合测序用于病毒分型和病毒耐药突变位点分析,Real-time PCR,2020/10/30,Real-time PCR,Real-time PCR的优缺点及应用,优点 灵敏度极高，特异性极强 机器分析判读结果，减少人工判读失误 可实现高通量检测 缺点 易出现污染，对人员操作要求高 要求房间分区，对场地硬件条件要求较高 不同种属病毒之间没有相似核酸序列，多种病毒同时检测较难实现 应用 几乎应用于所有病毒感染的检测，且在不同国家地区应用最为广泛,诺如病毒荧光探针法检测试剂盒,全国首家获批诺如病毒核酸检测试剂盒,诺如病毒核酸检测试剂盒（国械注准 20153400293）（核酸类国内空白） 人鼻病毒核酸检测试剂盒（国械注准20153400295） （国内空白） 人博卡病毒核酸检测试剂盒（国械注准20153400294） （国际空白）,眼部病毒感染多重real-time PCR检测试剂盒,一个反应管中可同时检测肠道病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒 探针分别用FAM, HEX， CY3和CY5四种荧光标记的探针 有内参，构建好了标准品，可进行绝对定量 加入了UNG酶，可有效控制污染 检出限可达1-10 copiesml 成本仅为市售试剂盒的1/10 效益成本比：TAKARARocheBio-RadThermo,FluorescenceIn SituHybridization (FISH),Carlo Foresta et al., PLOS ONE, 2011,Clare Connor, Nature, 2008,HPV感染,FISH的优缺点及应用,优点 直接检测病变组织细胞标本，对疾病的诊断意义更大 可检测病毒是否整合到人基因组 缺点 操作繁琐，对人员素质要求高 需要单独的细胞培养间 应用 HPV, EBV, 登革热病毒，HIV,基于转录的扩增,种酶：逆转录酶、酶和聚合酶 条特别设计的寡核苷酸引物 恒温反应，不需要PCR仪 能将病原体RNA扩增109倍，比常规PCR高个数量级,基于转录的扩增的优缺点及应用,优点 扩增时间短，恒温反应条件，不需要PCR仪 在等温条件下，快速降解的RNA可极大减少扩增过程中污染的可能性 缺点 缺点是不能用于DNA病毒的检测 以及多种酶混合体系的不稳定性 应用 在临床上应用于HCV、HIV、肠道病毒和呼吸道RNA病毒的检测,loop-mediated isothermal amplification（LAMP）,LAMP的优缺点及应用,优点 等温扩增，不需PCR仪，可实现床旁或野外环境 灵敏度和特异性均较高 缺点 引物设计极为复杂，研发门槛高，获批检测试剂盒少 应用 目前仅结核分枝杆菌获得CFDA认证，病毒检测尚处于研发阶段,数字PCR,数字PCR的优缺点及应用,优点 无需标准品，可直接进行绝对定量 对标本中的抑制剂有较高耐受性 为跨实验室比较提供绝对参照标准 缺点 样品分散技术的稳定性有待提高，且成本较高 通量较低，目前通常能检测的信号为FAM和VIC 应用 目前仅用于科研，但在临床病毒检测和定量方面极具应用前景,Sanger测序,Sanger测序的优缺点及应用,优点 能对病毒进行分型、突变分析 为病毒的传播路径等流行病学提供信息 缺点 通量低，一个反应体系只能分析一种病毒 应用 HBV、HCV、HIV、HSV、CMV、VZV、EBV、流感病毒等的抗病毒药物适用性分析,深度测序,深度测序的优缺点及应用,优点 不需要对标本中的病毒有预期判断，可以发现新发病毒感染 通量高，可检测到标本中含量少的病毒 对于无菌体液中发现的病毒诊断价值高 缺点 海量数据，分析有难度 部分标本中发现的病毒不一定与疾病相关 应用 重症感染及新发突发传染病疫情，比如埃博拉病毒，寨卡病毒，H7N9均是通过深度测序被诊断发现,法国梅里埃公司FilmArray 病原体全自动多重real-time PCR检测系统,终点熔解曲线分析,法国梅里埃公司FilmArray 病原体全自动多重real-time PCR技术原理,FilmArray 呼吸道病原体检测组套,美国FDA认证 一个反应板能能同时检测呼吸道相关的17种病毒和3种细菌 仅需2分钟将样本加入反应管中，剩下的病原体核酸提取、PCR和结果判断均为全自动操作 1小时出结果 但费用高昂,病毒： 腺病毒 冠状病毒229E 冠状病毒HKU1 冠状病毒OC43 冠状病毒NL63 人偏肺病毒 人鼻病毒/肠道病毒 甲型流感病毒 甲型流感病毒H1亚型 甲型流感病毒H1-2009亚型 甲型流感病毒H3亚型 乙型流感病毒 副流感病毒1型 副流感病毒2型 副流感病毒3型 副流感病毒4型 呼吸道合胞病毒,细菌： 百日咳杆菌 肺炎支原体 肺炎衣原体,FilmArray 腹泻病原体检测组套,美国FDA认证 一个反应板能能同时检测腹泻相关的5种病毒，6种细菌，6种致泻性大肠杆菌和4种寄生虫 仅需2分钟将样本加入反应管中，剩下的病原体核酸提取、PCR和结果判断均为全自动操作 1小时出结果 但费用高昂,细菌： 弯曲杆菌 艰难梭菌 类志贺邻单胞菌 沙门氏菌 小肠结肠炎耶尔森氏菌 弧菌,病毒： 腺病毒F40/F41亚型 星状病毒 诺如病毒GI/GII亚型 轮状病毒 札如病毒,致泻性大肠杆菌： EAEC EPEC ETEC STEC O157 EIEC,寄生虫： 隐孢子虫 环孢子虫 溶组织内阿米巴 兰氏贾第鞭毛虫,FilmArray 脑炎脑膜炎病原体 检测组套,美国FDA认证 一个反应板能能同时检测腹泻相关的7种病毒，6种细菌，1种真菌 仅需2分钟将样本加入反应管中，剩下的病原体核酸提取、PCR和结果判断均为全自动操作 1小时出结果 但费用高昂,真菌： 隐球菌/新型隐球菌,病毒： 巨细胞病毒 肠道病毒 单纯疱疹病毒1型 单纯疱疹病毒2型 人疱疹病毒6型 人细小病毒 水痘带状疱疹病毒,细菌： 大肠杆菌K1 流感嗜血杆菌 产单核细胞李斯特菌 脑膜炎奈瑟氏菌 无乳链球菌 肺炎链球菌,美国Luminex公司xTAG 多重PCR微球探针检测系统,20 mins,1 hr,2.5 hrs,45 mins,美国Luminex公司xTAG 多重PCR微球探针检测技术原理,病毒核酸提取,美国Luminex公司xTAG 多重PCR微球探针检测技术原理,Multiplex RT-PCR using target-specific TAGged primers & biotinylated primers,GGCTA CCGAT,TAG 1,3 5,B,B ds biotinylated, TAGged TS-PCR product,CCGAT GGCTA,3 TAG 1,5,GGCTA,TAG 1,CCGAT,3 TAG 2,5,B,5,TARGET PRESENT,TARGET ABSENT,病毒核酸扩增,TAGged products are captured by their complementary Anti-TAG sequence,Streptavidin-phycoerythrin reporter (SA-PE) molecule used to detect biotinylated primer,Universal array made up of different bead populations with SA-PE reporter present,Anti-TAG 2,TAG 2,Anti-TAG 1,B,PE,Region 29,SA,TAG 1,Region 34,美国Luminex公司xTAG 多重PCR微球探针检测技术原理,扩增的病毒核酸与固定有特异性探针的纳米微球杂交并检测,美国Luminex公司xTAG 多重PCR微球探针检测技术原理,Luminex 100/200 xMAP Technology based on flow cytometry,Red Laser & APDs: classify anti-TAG coupled beads,Green Laser & PMT: quantifies reporter, representing specific hybridization events,MAGPIX xMAP Technology using LEDs and CCD,Red LED & CCD camera: classify anti-TAG coupled beads,Green LED & CCD camera: quantifies reporter, representing specific hybridization events,Read on Luminex 200 or MAGPIX,信号数据获取并分析,美国FDA认证 一个反应板能能同时检测呼吸道相关的19种病毒，3种细菌 需要进行病原体核酸提取、PCR、杂交和结果判断 需要手工加样、扩增产物的人工转移 5小时出结果 费用相对Flimarray较为经济,细菌： 肺炎衣原体 肺炎衣原体 军团菌,病毒： 腺病毒 冠状病毒229E 冠状病毒HKU1 冠状病毒OC43 冠状病毒NL63 人博卡病毒 人偏肺病毒 人鼻病毒/肠道病毒 甲型流感病毒 甲型流感病毒H1亚型 甲型流感病毒H1-2009亚型 甲型流感病毒H3亚型 乙型流感病毒 副流感病毒1型 副流感病毒2型 副流感病毒3型 副流感病毒4型 呼吸道合胞病毒A型 呼吸道合胞病毒B型,xTAG呼吸道病原体检测组套,美国FDA认证 一个反应板能能同时检测腹泻相关的3种病毒，6种细菌，3种致泻性大肠杆菌和3种寄生虫 需要进行病原体核酸提取、PCR、杂交和结果判断 需要手工加样、扩增产物的人工转移 5小时出结果 费用相对Flimarray较为经济,细菌： 弯曲杆菌 艰难梭菌 志贺菌 沙门氏菌 小肠结肠炎耶尔森氏菌 霍乱弧菌,病毒： 腺病毒F40/F41亚型 诺如病毒GI/GII亚型 轮状病毒A型,致泻性大肠杆菌： ETEC O157 EIEC,寄生虫： 隐孢子虫 溶组织内阿米巴 兰氏贾第鞭毛虫,xTAG腹泻病原体检测组套,美国赛沛公司的Xpert病原体全自动real-time检测系统,美国赛沛公司的Xpert病原体全自动real-time检测技术原理,高度集成化、自动化 在一个反应杯里实现了标本病原体核酸的提取、PCR、检测和数据分析,Xpert病原体检测项目,美国FDA认证 一个反应管仅能检测1-2种病原体 仅需2分钟将样本加入反应管中，剩下的病原体核酸提取、PCR和结果判断均为全自动操作 1-2小时出结果,可检测的病毒： 甲型流感病毒乙型流感病毒 呼吸道合胞病毒 肠道病毒 HIV-1病毒载量定量 HCV病毒载量定量 诺如病毒 人乳头瘤病毒 埃博拉病毒,可检测的细菌： 艰难梭菌 MRSA CRE,美国GeneMark公司eSensor 探针-传感器分子检测系统,多重RT-PCR之后用探针杂交 再用伏安法电子传感器检测探针并分析信号,eSensor呼吸道病毒检测组套,美国FDA认证 能同时检测8种呼吸道病毒 腺病毒：B, C和E组 冠状病毒：229E, HKU1, OC43和NL63型 甲型流感病毒：检测并分型 乙型流感病毒 人偏肺病毒 副流感病毒：1, 2, 3和4型 呼吸道合胞病毒：A和B组 人鼻病毒 需要进行病原体核酸提取、PCR、杂交和结果判断 需要手工或机器提取核酸、扩增产物的人工转移 4-5小时出结果,美国雅培公司Plex-id PCR-质谱串联分子检测系统,多重RT-PCR 利用电喷雾电离质谱分析产物,美国FDA认证 同时检测influenza A 和 B virus 需要进行病原体核酸提取、多重PCR、质谱分析 6-8小时出结果,Plex-id 流感病毒检测试剂盒,传染病长效防控能力的提升和网络实验室持续竞争力的增强,在“十一五”、“十二五”基础上，进一步完善监测技术体系，大幅推动监测技术普及下沉，全面提升病原发现鉴定能力和新发传染病的识别能力。最终提高对传染病暴发疫情监测预警的敏感度和有效应对国内外重大传染病疫情的处置能力。,较为完善的监测技术体系和质控管理体系 较为丰富的重大疫情监测实战经验 较为高效的检测技术平台运转和团队协作机制,国家科技重大专项牵头建设单位,常规监测从30种扩大为98种全覆盖覆盖样本数15000份,扩大病原体监测范围,五大症候群扩大监测范围病原体,病原体变异变迁研究,综合利用三个五年计划的数据，深度解析中部地区重要病原进化变异与疫情暴发和临床重症发病之间的关系,生物信息学分析方法,体内体外评估技术,环境因子分析,对 30 种以上五大症候群传染病重要病原的变异变迁特征进行深入研究,分子时钟进化 基因重组重配 核苷酸变异速率 阴阳性选择突变 多肽极性分析 蛋白结构模拟,毒力 抗原性 组织细胞嗜性 耐药性,地域传播路径 宿主传播链 易感人群,病原体变异变迁研究,对重要病原的重组株和变异株的流行特征、抗原性、复制力和环境抵抗力等特性进行密切跟踪，及时预警散发尤其是暴发疫情,全基因水平扫描重要病原基因重组片断和重组断裂点,重组变异的病毒蛋白预测分析,优化重要病原的常见型别与未知型别的分步筛查流程,MEGA Simplot GARD,ProtScal Predict Protein Swiss-Mode Workspace,筛查未知病原体,聚焦可疑的病原体后再通过核酸检测、血清学检测和基因序列分析等方式进一步确认,优势技术,策略方案,最终目标,对常规筛查为“阴性”的新发传染病标本中的所有微生物核酸进行深度测序,MLST 技术 PFGE 技术 质谱技术 二、三、四代测序技术,“渐进互证式”测序策略,确认真正的致病原 尝试分离这类病原,武汉国家生物安全实验室,口岸-P4实验室-烈性传染病病原监测,谢谢！,