透射电子显微镜样品制备技术.doc

透射电子显微镜样品制备技术样品制备的方法随生物材料的类型以及研究目的而各有不同。对生物组织与细胞等，一般多用超薄切片技术，将大尺寸材料制成适当大小的超薄切片，并且利用电子染色、细胞化学、免疫标记及放射自显影等方法显示各种超微结构、各种化学物质的部位及其变化。对生物大分子（蛋白质、核酸）、细菌、病毒与分离的细胞器等颗粒材料,常用投影、负染色等技术以提高反差,显示颗粒的形态与微细结构。此外还有以冷冻固定为基础的冷冻断裂冰冻蚀刻、冷冻置换、冷冻干燥等技术。 超薄切片术 将小块生物材料，用液态树脂单体浸透与包埋，并固化成塑料块，后用超薄切片机切成厚度为500埃左右,甚至只有50埃的超薄切片。超薄切片的制备程序与光学显微镜的切片程序类似，但各步骤的要求以及所使用的试剂与操作方法有很大差别。 固定 选用适宜的物理或化学的方法迅速杀死组织与细胞,力求保持组织与细胞的正常结构,并使其中各种物质的变化尽可能减小。固定能提高细胞承受包埋、切片、染色以及电子束轰击的能力。主要固定方法有： 快速冷冻，用致冷剂（如液氮、液体氟利昂、液体丙烷等）或其他方法使生物材料急剧冷冻，使组织与细胞中的水只能冻结成体积极小的冰晶甚至无定形的冰玻璃态。这样，细胞结构不致被冰晶破坏，生物大分子可保持天然构型，酶及抗原等能保存其生物活性，可溶性化学成分（如小分子有机物与无机离子）也不致流失或移位。用冷冻的组织块，可进行切片、冷冻断裂、冷冻干燥与冷冻置换等处理。用此法固定的样品既可提供组织、细胞结构的形态学信息，又可提供相关的细胞化学信息。化学固定，固定剂有凝聚型与非凝聚型两种，前者如光学显微术中常用的乙醇、二氯化汞等，此法常使大多数蛋白质凝聚成固体,结构发生重大变化,常导致细胞的细微结构出现畸变。非凝聚型固定剂包括戊二醛、丙烯醛与甲醛等醛类固定剂与四氧化锇，四氧化钼等，适用于电子显微。它们对蛋白质有较强的交联作用,可以稳定大部分蛋白质而不使之凝聚,避免了过分的结构畸变。它们与细胞蛋白质有较强的化学亲与力，固定处理后，固定剂成为被固定的蛋白质的一部分。如用含有重金属元素的固定剂四氧化锇（也是良好的电子染色剂）进行固定，因为锇与蛋白质结合，增强了散射电子的能力，提高了细胞结构的反差。采用一种以上固定剂的多重固定方法，如采用戊二醛与四氧化锇的双固定法，能较有效地减少细胞成分的损失。此外，固定剂溶液的浓度、pH及所用的缓冲剂类型、渗透压、固定时间与温度等对固定效果都有不同程度的影响。 固定操作方法通常是先将材料切成 1立方毫米左右小块，浸在固定液中，保持一定温度（通常为4）,进行一定时间的固定反应。取材操作要以尽可能快的速度进行，以减少组织自溶作用造成的结构破坏。对某些难以固定的特殊组织，如脑、脊髓等，最好使用血管灌注方法固定，即通过血管向组织内灌注固定液，使固定液在组织发生缺氧症或解剖造成损伤之前，快速而均匀地渗透到组织的所有部分。灌注固定的效果比浸没固定好得多。 脱水 化学固定后，将材料浸于乙醇、丙酮等有机溶剂中以除去组织的游离水。为避免组织收缩，所用溶剂需从低浓度逐步提高到纯有机溶剂，逐级脱水。 浸透 脱水之后，用适当的树脂单体与硬化剂的混合物即包埋剂，逐步替换组织块中的脱水剂，直至树脂均匀地浸透到细胞结构的一切空隙中。 包埋 浸透之后,将组织块放于模具中,注入树脂单体与硬化剂等混合物，通过加热等方法使树脂聚合成坚硬的固体。用作包埋剂的树脂有甲基丙烯酸酯、聚酯与环氧树脂等。最广泛使用的是某些类型的环氧树脂，如618树脂、Epon812、Araldite与 Spurr等商品树脂。它们具有良好的维持样品特性、低收缩率与较强的耐电子轰击能力等优点。 切片 制备超薄切片要使用特制超薄切片机（大多是根据精密机械推进或金属热膨胀推进原理制成）与特殊的切片刀（用断裂的玻璃板制成的玻璃刀或用天然金刚石研磨而成的金刚石刀）。先将树脂包埋块中含有生物材料的部分，用刀片在立体显微镜下修整成细小的金字塔形,再用超薄切片机切成厚度适中（500埃左右）的超薄片，切片应依次相互联接形成切片带。切片带漂浮于装在切片机上的水槽中的水面上。 通过装置在切片机上的解剖显微镜，监控切片过程。用荧光灯照射水面上的切片，并根据由此产生的干涉光颜色来判断切片的实际厚度（见表）。 透射电子显微镜样品制备技术切片通常用敷有薄的支持膜的特制金属载网，从水面上捞取。快速冷冻固定的生物材料，可用冷冻超薄切片装置制成切片。用醛类或冷冻方法固定的组织，可通过超薄切片术与生物化学技术、免疫技术等结合使用,进行超微结构水平上的蛋白质、核酸、酶及抗原等生物活性物质的定位甚至定量研究。这就是电镜细胞化学技术（见细胞化学）与电镜免疫细胞化学技术。 染色 电子显微镜主要是依赖散射电子成像，为了增强细胞结构的电子反差，需要对切片进行染色。染色是依据各种细胞结构与染色剂（重金属盐）结合的选择性，而形成不同的对电子散射能力，从而产生借以区别各种结构的反差。电子染色方法分块染色与切片染色两种：块染色法，在脱水剂中加入染色剂，在脱水过程中对组织块进行电子染色。切片染色法，最常用，即将载有切片的金属载网漂浮或浸没在染色液中染色。也可使用有微处理机控制的染色机进行自动化染色。一般切片染色所使用的染色剂为金属铀盐与铅盐的双重染色。为显示某种特殊结构，则可采用与该结构有特异性结合的选择性染色剂。 冷冻置换法 用有机溶剂（如丙酮、乙醚等）在低温条件下（通常，-80-90），缓慢地置换冷冻固定的小块组织中的冰（“惰性脱水”），这样可减少常规方法脱水过程中有机溶剂对组织中化学组分的抽取。然后再按常规方法进行树脂包埋、超薄切片与染色等。用冷冻置换法，可以很好地保存快速变化过程中物质的状态与非常脆弱的超微结构以及细胞内某些化学组分。 电镜放射自显影技术 用超薄切片术与放射性同位素标记技术相结合的电镜放射自显影术(见同位素技术)可获得同位素标记的化合物在组织细胞内存在部位，以及在代谢过程中物质的合成、分解、转运及分泌的信息。 负染色与投影技术 研究分散的颗粒状生物材料,为增强其反差，常采用的方法。 负染色 研究以蛋白质为主要成分的颗粒状材料的最常用方法。以某些在电子束轰击下稳定而又不与蛋白质相结合的重金属盐类作为负染色剂，使之在支持膜上将颗粒材料包围，形成具有高电子散射能力的背景，衬托出低电子散射能力的颗粒的形态细节。其所成的电子显微像的反差与常规电子染色相反，即暗的背景与亮的颗粒形态的所谓阴性反差。负染色方法简便，所获得的颗粒的电子显微图像反差强,分辨率也高于超薄切片,可广泛用于研究蛋白质分子、细菌鞭毛、蛋白质结晶，以及生物膜及分离的细胞的细微结构，特别适用于蛋白质大分子及病毒颗粒结构的三维重建研究。常用的负染色剂有醋酸铀、磷钨酸钠或磷钨酸钾、 硅钨酸、 铜酸铵及甲酸铀等。用液滴法或喷雾法将颗粒材料的悬液加在载网的支持膜上，然后滴加负染色剂溶液。或将颗粒的悬液与负染色剂按一定浓度混合滴加或喷撒到支持膜上，吸去多余液体，待干燥后，即可用电镜观察。样品颗粒在支持膜上的均匀分散是成功的关键之一。染色剂溶液的pH则是成功的另一关键。一般染色剂的pH应在中性偏酸范围（pH 57）,但对不同种类的颗粒材料与染色剂，最适pH也不尽相同。 投影 在真空蒸发器的高真空腔中,加热某些金属至熔化后，金属以细小颗粒沿直线方向蒸发出来。当金属微粒以一定入射角喷镀在载有颗粒材料的载网支持膜表面上时,颗粒向蒸发源的一面即被镀上一层金属薄膜,而背蒸发源的一面及附近区域形成无金属沉积的“阴影”，并且由于各部位散射电子能力存在着差别，这样就能构成具有强烈反差与立体感的电子显微图像。常用于投影的蒸发材料，有金、 铬、 铂、钯以及铂-铱、铂-钯、铂-碳等金属或合金。此外，还可利用电子枪投影装置使钨、钽等高熔点金属以极微细颗粒蒸发，从而获得高分辨率投影。 蛋白质展膜技术 用电子显微镜研究核酸分子常用的方法。某些碱性球蛋白，如细胞色素c,可以在低浓度盐溶液或蒸馏水表面展成单分子层，在展开过程中，能为蛋白质的碱性氨基酸侧链基团所吸附的、带负电荷的核酸分子同时展开成完整的线状分子。然后，用带有支持膜（有机膜或碳膜）的载网捞起这些蛋白质核酸展膜,并用染色或金属投影法提高核酸分子的反差,可在电镜下直接观察核酸分子的形态、DNA的双螺旋结构,并可通过分子长度的测量来计算核酸分子量。 冷冻断裂与冰冻蚀刻技术 研究细胞超微结构，特别是生物膜结构的一种独特的样品制备技术。利用快速冷冻方法固定的生物组织块具有刚性与脆性。在对其施加外力后，组织即在结构上结合最薄弱的部位发生“脆性断裂”，这就是“冷冻断裂”。对于生物膜，断裂沿膜内部疏水区发生，从而暴露出膜内部结构。利用投影与复型技术，制备断裂面的复型,然后将组织腐蚀掉,并用载网捞起复型膜，就可用电镜来研究组织断裂表面所显示的细胞的或生物膜内部超微结构。在高于 10-5毫米汞柱真空度与-100温度下，冷冻组织的断裂表面上的冰升华为水蒸汽，而使原表面高度下降，即谓之“冰冻蚀刻”。由于组织各部分结构的含水量不同，冰的升华造成各部分结构的表面高度下降程度有差异，因此冰冻蚀刻的断裂表面的投影、复型所显示的断裂表面形态具有很强的立体感。冷冻断裂与冰冻蚀刻技术，为细胞超微结构，特别是关于细胞联接、细胞融合、细胞分化以及生物膜的通透性的研究提供了许多重要信息。也为流行的生物膜结构模型，即“流动镶嵌模型”的研究提供了有利的证据。第 9 页