大肠杆菌感受态细胞.ppt

关于大肠杆菌感受态细胞现在学习的是第1页，共23页1. 实验目的和要求实验目的和要求通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。了细胞的技术以及筛选转化体的技术。了解细胞转化的概念及其在分子生物学研解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。究中的意义。现在学习的是第2页，共23页2. 相关知识及原理相关知识及原理感受态细胞感受态细胞(Competent cells):受体细胞经过一些特殊方法（如：受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的的载体分子通过的感受态细胞载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。 现在学习的是第3页，共23页转化（转化（transformation）：是将异源是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。究领域的基本实验技术。 进入细胞的进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。现在学习的是第4页，共23页转化的方法：转化的方法：化学的方法化学的方法(热击法热击法)；使用化学试剂（如；使用化学试剂（如CaCl）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞；分子导入受体细胞；1. 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子分子导入受体细胞。导入受体细胞。现在学习的是第5页，共23页克隆的筛选：克隆的筛选：主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；四环素、链霉素等；现在学习的是第6页，共23页将经过转化后的细胞在选择性抗生素培养基中培将经过转化后的细胞在选择性抗生素培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，如果将转化后的分子的受体细胞。否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含有被转克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上生长化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不能和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不能确定哪个克隆含有插入片段。确定哪个克隆含有插入片段。现在学习的是第7页，共23页重组质粒克隆的鉴定重组质粒克隆的鉴定鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有 -互补互补、小规模制备质粒、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、插入失进行酶切分析、插入失活、活、PCR以及杂交筛选的方法。最常用的方以及杂交筛选的方法。最常用的方法是小规模制备质粒法是小规模制备质粒DNA进行酶切分析，对进行酶切分析，对于带有于带有LacZ基因的载体还可以结合基因的载体还可以结合 -互补现象来互补现象来筛选。筛选。现在学习的是第8页，共23页 -互补现象：互补现象：因为有些载体都带有一个因为有些载体都带有一个LacLacZ Z基因的调控序列和头基因的调控序列和头146146个氨基酸的编码信息，编码个氨基酸的编码信息，编码 - -互补肽，该肽互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型段能与宿主编码的缺陷型 - -半乳糖苷酶实现基因半乳糖苷酶实现基因内互补（内互补（ -互补互补）。）。当这种载体转入可编码当这种载体转入可编码 半乳糖苷酶半乳糖苷酶C C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基基- - -D-D硫代半乳糖苷（硫代半乳糖苷（IPTGIPTG）的诱导下，）的诱导下，宿主可宿主可同时合成这两种肽段，同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为白质。所以称这种现象为 - -互补现象。互补现象。现在学习的是第9页，共23页由互补产生的由互补产生的 半乳糖苷酶半乳糖苷酶( (LacLacZ)Z)能够作用于能够作用于生色底物生色底物5 5溴溴4 4氯氯3 3吲哚吲哚 D D半乳半乳糖苷糖苷(X-gal)(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源多克隆位点，当插入一个外源DNADNA片段时，会造成片段时，会造成LacLacZ(Z( ) )基因的失活，破坏基因的失活，破坏 -互补作用，互补作用，就不能产就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。，而没有重组质粒的菌落为蓝色。现在学习的是第10页，共23页现在学习的是第11页，共23页重组重组DNADNA转化细菌过程示转化细菌过程示意图意图现在学习的是第12页，共23页3仪器、材料和试剂仪器、材料和试剂无菌超净台，电热恒温水浴，分光光度计，离心机，无菌超净台，电热恒温水浴，分光光度计，离心机，移液器，微型离心管等；移液器，微型离心管等；菌株：菌株：E.coliE.coli DH5 DH5质粒：质粒：pBluscript KS+DNA 片段的重组质粒以及片段的重组质粒以及pBluscript KS 空质粒；空质粒；LBLB培养基；含抗菌素的培养基；含抗菌素的LBLB平板培养基（氨苄青霉素平板培养基（氨苄青霉素，浓度，浓度50-10050-100g gmLmL，X-gal 20-48X-gal 20-48g/ml, IPTG g/ml, IPTG 100 100 g/mlg/ml。一般将抗生素、。一般将抗生素、X-galX-gal和和IPTGIPTG配制成配制成10001000 储备液，用时按培养基的量再加入储备液，用时按培养基的量再加入）；）；预冷预冷CaClCaCl2 2溶液（溶液（0.1mol0.1molL L） 现在学习的是第13页，共23页4操作步骤操作步骤 1）大肠杆菌感受态细胞的制备）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法法) （1）从新活化的）从新活化的E.coli DH5菌平板上挑取一单菌平板上挑取一单菌落，接种于菌落，接种于35ml LB液体培养中，液体培养中，37振荡振荡培养培养12h左右，直至对数生长期。将该菌悬液以左右，直至对数生长期。将该菌悬液以1:1001:50转接于转接于100ml LB液体培养基中，液体培养基中，37振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每 隔每 隔2 0 3 0 m i n测 一 次测 一 次O D 6 0 0 n m， 至， 至OD600nm0.5时停止培养；时停止培养；现在学习的是第14页，共23页（2）每组取培养液）每组取培养液3个个2ml转入转入2ml离心管中，离心管中，在冰上冷却在冰上冷却20-30min，于，于4，4000rmin离离心心10min（从这一步开始，所有操作均在冰上进（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；行，速度尽量快而稳）；（3）倒净上清培养液，用）倒净上清培养液，用1ml冰冷的冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴；溶液轻轻悬浮细胞，冰浴；（4）04，4000rmin离心离心10min；（5）弃去上清液，加入）弃去上清液，加入500l冰冷的冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。溶液，小心悬浮细胞。04，4000rmin离心离心10min；现在学习的是第15页，共23页（6）弃去上清液，加入）弃去上清液，加入100l冰冷的冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；制成了感受态细胞悬液；（7）制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化）制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积实验，也可加入占总体积15左右高压灭菌过左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于离心管中，置于-70条件下，可保存半年至一年。条件下，可保存半年至一年。现在学习的是第16页，共23页2）细胞转化）细胞转化 (1) 分别取分别取3个个100l感受态细胞悬液感受态细胞悬液(如是冷冻保如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作存液，则需化冻后马上进行下面的操作)，第一组，第一组，加入，加入10 l重组质粒重组质粒DNA(体积不超过体积不超过10l)+ 100l感受态细胞，此管为转化实验组。第二组感受态细胞，此管为转化实验组。第二组，插入，插入DNA片段对照组，即酶切后片段对照组，即酶切后DNA片段片段25ng+100l感受态细胞悬液；第三组，质粒感受态细胞悬液；第三组，质粒DNA对照组，即对照组，即1ng 未酶切未酶切pBluescript 质粒质粒DNA十十100l感受态细胞悬液。感受态细胞悬液。 现在学习的是第17页，共23页(2) 将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置20-30min，于于42水浴中保温水浴中保温12min，然后迅速冰上冷却，然后迅速冰上冷却2min(3) 立即向上述管中分别加入立即向上述管中分别加入0.4ml LB液体培养液体培养基（不需在冰上操作），使总体积到基（不需在冰上操作），使总体积到0.5ml，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37振荡培养振荡培养约约45-60min ，使受体菌恢复正常生长状态，并使，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物转化体表达抗生素基因产物(Ampr)。现在学习的是第18页，共23页3) 平板培养（有时需要稀释）平板培养（有时需要稀释）(1)取各样品培养液取各样品培养液0.1ml，分别接种于含，分别接种于含抗菌素抗菌素LB平板培养基上，涂匀（如果平板培养基上，涂匀（如果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫）。一下再用，不要过烫）。现在学习的是第19页，共23页(2) 菌液完全被培养基吸收后菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于，倒置培养皿，于37恒温培养箱内培养过夜恒温培养箱内培养过夜(12-16小时小时)，待菌落，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养，对于可生长良好而又未互相重叠时停止培养，对于可以蓝白斑筛选的质粒和菌株来说，此时应该能以蓝白斑筛选的质粒和菌株来说，此时应该能清楚地看到蓝色和白色菌落。清楚地看到蓝色和白色菌落。用用 CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克超法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒螺旋质粒 DNA产生产生5 106-2 107个转化菌落。在个转化菌落。在实际工作中，每微克有实际工作中，每微克有105以上的转化菌落足以以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。满足一般的克隆实验。现在学习的是第20页，共23页4) 检出转化体和计算转化率检出转化体和计算转化率统计每个培养皿中的菌落数，各实验组培统计每个培养皿中的菌落数，各实验组培养皿内菌落生长状况应如表所示养皿内菌落生长状况应如表所示: 现在学习的是第21页，共23页各实验组在培养皿内菌落生长状况及结果分析各实验组在培养皿内菌落生长状况及结果分析现在学习的是第22页，共23页感谢大家观看感谢大家观看现在学习的是第23页，共23页