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关于动物基因工程关于动物基因工程现在学习的是第1页，共38页第一节第一节 基因工程概述基因工程概述 基因工程基因工程(Genetic engineering)是一种是一种DNA重组技术，它是在分重组技术，它是在分子水平上进行的遗传操作，即把供体细胞中的基因或基因子水平上进行的遗传操作，即把供体细胞中的基因或基因组提取出来，按照预先设计的蓝图，经过体外加工重组，组提取出来，按照预先设计的蓝图，经过体外加工重组，或者把人工合成的基因转移到受体细胞并获得新的遗传特或者把人工合成的基因转移到受体细胞并获得新的遗传特性的技术。由于被转移的基因必须与载体性的技术。由于被转移的基因必须与载体DNA重组后才能重组后才能实现转移，所以基因工程也叫做重组实现转移，所以基因工程也叫做重组DNA技术。技术。基因工程的基本操作程序包括：基因工程的基本操作程序包括：(1)目的基因的分离或合成；目的基因的分离或合成；(2)用用工具酶对目的基因和载体（工具酶对目的基因和载体（Vector）进行加工处理，把目的）进行加工处理，把目的基因与载体结合成重组基因与载体结合成重组DNA分子；分子；(3)把重组把重组DNA分子引入分子引入受体细胞，并使目的基因和载体上其他基因得以表达；受体细胞，并使目的基因和载体上其他基因得以表达；（4）转化体细胞的扩增；（）转化体细胞的扩增；（5）重组体细胞的鉴定与筛选。）重组体细胞的鉴定与筛选。现在学习的是第2页，共38页基因克隆示意图现在学习的是第3页，共38页第二节第二节 工具酶工具酶限制性核酸内切酶切割DNADNA连接酶生成3-5磷酸二酯键DNA聚合酶探针标记、补平3末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5磷酸化、探针标记末端转移酶3末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基常用的工具酶常用的工具酶现在学习的是第4页，共38页限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶细菌限制修饰体系细菌限制修饰体系 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 甲基化酶甲基化酶识别特异的位点识别特异的位点酶切位点酶切位点回文结构回文结构 46 bp出现两种末端出现两种末端粘性末端粘性末端 粘端粘端 平头末端平头末端 平端平端 配伍末端配伍末端现在学习的是第5页，共38页二、二、DNA聚合酶聚合酶（一）（一）DNA聚合酶聚合酶I(全酶全酶)(E.coli DNA Polymease)（二）（二）K1enow片段片段(E.co1i)（三）（三）T4 DNA聚合酶聚合酶(T4噬茵体感染的噬茵体感染的Eco1i)（四）（四）Taq DNA聚合酶聚合酶(Thermusaqraticus)（五）逆转录酶（五）逆转录酶（reverse transcriptase）（六）末端转移酶（六）末端转移酶 现在学习的是第6页，共38页三、三、DNA连接酶连接酶 在大肠杆菌和动物细胞中都发现了在大肠杆菌和动物细胞中都发现了DNA连接酶，这种酶能够催化连接酶，这种酶能够催化DNA中相邻的中相邻的 3一一OH和和5一磷酸基末端之间形成磷酸二酯键。连接反应的最适一磷酸基末端之间形成磷酸二酯键。连接反应的最适温度是温度是37，但在此温度下粘性末端之间氢键结合很不稳定。实验表明，但在此温度下粘性末端之间氢键结合很不稳定。实验表明，15对于连接反应和粘性末端氢键结合的稳定性都是合适的。对于连接反应和粘性末端氢键结合的稳定性都是合适的。四四、甲基化酶、甲基化酶 细胞的限制一修饰系统中的修饰作用是由甲基化酶细胞的限制一修饰系统中的修饰作用是由甲基化酶(methylase)(methylase)米完成的。米完成的。甲基化酶同限制性内切酶具有完全相同的识别顺序。甲基化酶使识别顺序中甲基化酶同限制性内切酶具有完全相同的识别顺序。甲基化酶使识别顺序中的某个碱基发生甲基化，保护的某个碱基发生甲基化，保护DNADNA不被限制性内切酶切开。真核生物中目前不被限制性内切酶切开。真核生物中目前只发现只发现5 5甲基胞嘧啶甲基胞嘧啶(M5C)(M5C)。现在学习的是第7页，共38页 五、核酸酶五、核酸酶（一）核酸酶（一）核酸酶S1(Nuclease S1)核酸酶核酸酶S1主要用于：主要用于：(1)分析分析DNA：RNA杂交体结构。通过降解成熟杂交体结构。通过降解成熟mRNA与放与放射性标记基因组、射性标记基因组、DNA的杂交体确定内含子部位。的杂交体确定内含子部位。(2)切除切除DNA片段上的单链末端，片段上的单链末端，形成平末端。形成平末端。(3)切开切开cDNA合成过程中形成的发夹环。合成过程中形成的发夹环。(4)在限制酶位点上产生小缺在限制酶位点上产生小缺失。失。(二二)核酸外切酶核酸外切酶III（三）核酸外切酶（三）核酸外切酶VII（四）（四）DNA酶酶I（五）（五）RNA酶酶A(牛胰牛胰)（六）（六）RNA酶酶TI（七）（七）RNA酶酶H 现在学习的是第8页，共38页第三节基因工程的载体第三节基因工程的载体（Vector）到目前为止，用于基因工程的载体有到目前为止，用于基因工程的载体有8类：类：细菌质粒载体；包括大肠杆菌和枯草杆菌质粒载体。细菌质粒载体；包括大肠杆菌和枯草杆菌质粒载体。噬菌体衍生载体。噬菌体衍生载体。柯斯质粒柯斯质粒(Cosmid)载体：一种由质粒和载体：一种由质粒和A噬菌体噬菌体cos尾巴构建尾巴构建 的复合载体。的复合载体。噬菌体噬菌体M13衍生载体一类专门用于衍生载体一类专门用于Sanger法测序的载体。法测序的载体。Phag9m5d载体：一类由噬菌体功能片段和质粒构建的复合载体：一类由噬菌体功能片段和质粒构建的复合 载体。载体。酵母质粒载体：由酵母酵母质粒载体：由酵母2u质粒构建的酵母基因工程载体。质粒构建的酵母基因工程载体。真核病毒载体：包括动物病毒、植物病毒衍生载体。真核病毒载体：包括动物病毒、植物病毒衍生载体。杆状病毒和杆状病毒和Bacmid载体；载体；现在学习的是第9页，共38页作为基因工程的载体它们都具备以下一些共同的作为基因工程的载体它们都具备以下一些共同的基本特点：基本特点：作为基因工程的载体它们都具备以下一些共同的基作为基因工程的载体它们都具备以下一些共同的基本特点：本特点：在宿主细胞中能独立自主地复制。在宿主细胞中能独立自主地复制。表达载体含有强启动于，能驱动靶基因在宿表达载体含有强启动于，能驱动靶基因在宿 主细胞中表达。主细胞中表达。容易从宿主细胞中分离纯化。容易从宿主细胞中分离纯化。载体载体DNA基因组中有一段不影响它们复制的非必基因组中有一段不影响它们复制的非必需区域，插在其中的靶片段能被动地跟着载体需区域，插在其中的靶片段能被动地跟着载体DNA一起复制，就像载体的正常成分一样。一起复制，就像载体的正常成分一样。现在学习的是第10页，共38页一、质粒载体一、质粒载体(plasmid vector)（1）质粒的一般性质）质粒的一般性质 1质粒的概念质粒的概念 质粒是细菌细胞染色体外存在于细胞质质粒是细菌细胞染色体外存在于细胞质中能进行自我复制的一类小型中能进行自我复制的一类小型DNA分子，大部分质粒分子，大部分质粒为双链环状。为双链环状。2质粒的大小质粒的大小 3质粒的拷贝数质粒的拷贝数 4质粒的不亲和性质粒的不亲和性 5质粒的宿主范围质粒的宿主范围 现在学习的是第11页，共38页质粒质粒存在于细菌染色体外的小型环状双存在于细菌染色体外的小型环状双链链DNA分子分子理想的质粒理想的质粒 1.拷贝数多拷贝数多;2.两三个抗药性基因两三个抗药性基因 terr ampr 筛选标志筛选标志3.合适的限制性内切酶酶切位点（单一）合适的限制性内切酶酶切位点（单一）现在学习的是第12页，共38页现在学习的是第13页，共38页（二）（二）噬菌体载体噬菌体载体(Phage vector)噬菌体是一种温和噬菌体，由于它的遗传结构和噬菌体是一种温和噬菌体，由于它的遗传结构和宿主大肠杆菌的遗传结构研究得比较清楚，并能在细菌宿主大肠杆菌的遗传结构研究得比较清楚，并能在细菌中大量繁殖，所以成为广泛采用的载体。中大量繁殖，所以成为广泛采用的载体。噬菌体还有噬菌体还有一大优点，即使它的一大优点，即使它的DNA丢失丢失25仍不失活，这仍不失活，这部分丢失的空档正好可以装载外源部分丢失的空档正好可以装载外源DNA。与质粒载体相比，与质粒载体相比，噬菌体作为载体可以克隆更大一噬菌体作为载体可以克隆更大一些的些的DNA片段，欲构件一个基因文库，往往可以减片段，欲构件一个基因文库，往往可以减少文库中克隆的数量。少文库中克隆的数量。现在学习的是第14页，共38页（三）柯斯质粒载体（三）柯斯质粒载体（Cosmid vector）柯斯质粒载体又叫粘粒载体，这是柯斯质粒载体又叫粘粒载体，这是一种由人工构建的含有一种由人工构建的含有DNA的的cos序列和序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。柯质粒复制子的特殊类型的质粒载体。柯斯质粒在结构组成上具有斯质粒在结构组成上具有 噬菌体的特性、噬菌体的特性、也具有质粒载体的特性和高容量的克隆也具有质粒载体的特性和高容量的克隆能力，一般可插入能力，一般可插入3540kb的外源基因，的外源基因，这是构建真核生物基因文库的主要载体。这是构建真核生物基因文库的主要载体。柯斯质粒适用于作基因簇和大基因的克柯斯质粒适用于作基因簇和大基因的克隆。隆。现在学习的是第15页，共38页（四）（四）YAC载体载体 YAC YAC是酵母人工染色体（是酵母人工染色体（Yeast artificial chromosomeYeast artificial chromosome）的缩）的缩写，是目前能容纳最大外源写，是目前能容纳最大外源DNADNA片段的载体。简单地说，酵母人工片段的载体。简单地说，酵母人工染色体载体有两个臂，之间有着丝粒，每个臂的末端有一个端粒，染色体载体有两个臂，之间有着丝粒，每个臂的末端有一个端粒，另外，染色体上还有供选择的标记基因；当外源另外，染色体上还有供选择的标记基因；当外源DNADNA片段连接进两片段连接进两个臂中以后，通过选择标记人们可以从酵母宿主细胞中筛选出重个臂中以后，通过选择标记人们可以从酵母宿主细胞中筛选出重组的人工染色体。组的人工染色体。实验结果证明，每个实验结果证明，每个YACYAC都可以装进都可以装进100100万碱基以上的万碱基以上的DNADNA片段，这种大小比柯斯质粒的装载能力要大数倍，所片段，这种大小比柯斯质粒的装载能力要大数倍，所以可以保证基因结构的完整性。以可以保证基因结构的完整性。现在学习的是第16页，共38页(五五)动物病毒动物病毒 动物病毒作为载体可用于外源基因向真核细胞的转入。作动物病毒作为载体可用于外源基因向真核细胞的转入。作为基因介导的动物为基因介导的动物DNA载体，必须具备以下条件：载体，必须具备以下条件：(1)具有具有动物病毒的复制起始部位及启动子，以便外源基因能有效的转染动物病毒的复制起始部位及启动子，以便外源基因能有效的转染动物细胞，以及提供必要的转录信号：动物细胞，以及提供必要的转录信号：(2)具有可供选择的标志具有可供选择的标志基因，因为重建的病毒转染力很低，一般仅为基因，因为重建的病毒转染力很低，一般仅为105107，只有，只有利用标志基因才能选出转化细胞株；利用标志基因才能选出转化细胞株；(3)具有适当的多种具有适当的多种单一内切酶位点供外源基因插入。单一内切酶位点供外源基因插入。目前常用的基因转移载体有：目前常用的基因转移载体有：(1)猴空泡病毒猴空泡病毒(Simian virus 40简称简称SV40)；(2)腺病毒腺病毒(Adenovirus)；(3)乳头状病毒乳头状病毒(Papilloma virus)；(4)逆转录病毒逆转录病毒(Retrovirus);(5)牛痘牛痘(Vaccinia)病毒病毒;(6)牛疣病毒牛疣病毒(Bovine papilloma virus)等。等。现在学习的是第17页，共38页 三、获得目的基因的方法三、获得目的基因的方法 (一一)利用理化方法分离基因利用理化方法分离基因 理化方法分离基因是依据理化方法分离基因是依据DNADNA双链结构双链结构的特点和四种碱基互补的氢键差异，其的特点和四种碱基互补的氢键差异，其方法有以下四种：方法有以下四种：1 1密度梯度超速离心法密度梯度超速离心法 2 2单链酶法单链酶法 3 3多聚赖氨酸法多聚赖氨酸法 4 4分子杂交法分子杂交法现在学习的是第18页，共38页(二二)利用生物学方法分离基因利用生物学方法分离基因 利用噬菌体转染或质粒转化等微生物学技术分离利用噬菌体转染或质粒转化等微生物学技术分离基因的方法，我们把它叫做生物学方法。这种方法应基因的方法，我们把它叫做生物学方法。这种方法应用于原核基因的分离提取。用于原核基因的分离提取。用 适 当 的 限 制 性 内 切 酶用 适 当 的 限 制 性 内 切 酶(R e s t r i c t i o n (R e s t r i c t i o n endonuclease)endonuclease)将整个染色体或将整个染色体或DNADNA分子切成许多相分子切成许多相当于一个或略大于一个基因的片段，然后把全部当于一个或略大于一个基因的片段，然后把全部DNADNA片段与质粒组成重组片段与质粒组成重组DNADNA分子，并转化到某特定基因分子，并转化到某特定基因营养缺陷型受体菌内，进行纯系繁殖，再经分离鉴定，营养缺陷型受体菌内，进行纯系繁殖，再经分离鉴定，选出所需基因。选出所需基因。现在学习的是第19页，共38页(三三)基因的人工合成基因的人工合成 化学合成法化学合成法 逆转录法逆转录法(Reverse transcription)(Reverse transcription)逆转录法也叫逆转录法也叫cDNAcDNA法，它是一种酶促合法，它是一种酶促合成法，即以成法，即以mRNAmRNA为模板，在反转录酶的作为模板，在反转录酶的作用下，以四种脱氧核苷三磷酸为材料合成用下，以四种脱氧核苷三磷酸为材料合成DNA(cDNA)DNA(cDNA)，再经复制后即成双链，再经复制后即成双链DNADNA。3.聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)现在学习的是第20页，共38页四、重组四、重组DNADNA分子分子 1.粘性末端连接粘性末端连接 连接效率高连接效率高相同酶切末端相同酶切末端配伍末端配伍末端2.平端连接平端连接 连接效率低连接效率低3.同聚物接尾法同聚物接尾法4.人工接头法人工接头法现在学习的是第21页，共38页现在学习的是第22页，共38页五、基因的转移五、基因的转移(Gene transfer)(一一)、重组、重组DNA向细菌细胞转入向细菌细胞转入 把以质粒为载体的重组把以质粒为载体的重组DNA分子引入受体细胞的过分子引入受体细胞的过程叫做转化程叫做转化(Transformation)；把以噬菌体或病毒为；把以噬菌体或病毒为载体的重组载体的重组DNA分子引入受体细胞的过程叫做转染分子引入受体细胞的过程叫做转染(Transfetion)。对细菌细胞进行转化或转染的关键是细胞处在感受对细菌细胞进行转化或转染的关键是细胞处在感受态，所谓感受态细胞，就是受体细胞处于摄入外源态，所谓感受态细胞，就是受体细胞处于摄入外源DNA的状态。一般用的状态。一般用0.010.05 M/L氯化钙处理受氯化钙处理受体细胞，可以引起细胞膨胀，增大细胞的通透性，体细胞，可以引起细胞膨胀，增大细胞的通透性，使重组使重组DNA进入细胞，提高转化效率。进入细胞，提高转化效率。现在学习的是第23页，共38页转导作用转导作用 transduction病毒、噬菌体介导病毒、噬菌体介导溶菌途径溶菌途径溶原菌途径溶原菌途径现在学习的是第24页，共38页(二二)、外源目的基因向真核细、外源目的基因向真核细胞转入胞转入 向真核细胞中转移基因的方法可分为向真核细胞中转移基因的方法可分为两大类，两大类，类需借助于载体，另类需借助于载体，另类不类不需借助于载体。需借助于载体。1 借助于载体的基因转移借助于载体的基因转移 2不需载体的基因转移不需载体的基因转移 磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法 脂质体介导法脂质体介导法 血影细胞血影细胞(Blood shadow cell)介导法介导法 现在学习的是第25页，共38页六、转化细胞的筛选与鉴定六、转化细胞的筛选与鉴定 转化或转染的效率是很低的转化或转染的效率是很低的(一般为一般为105106)，也就是说，只有极少数细胞接受到，也就是说，只有极少数细胞接受到重组重组DNA分子，能实现基因的转移。所分子，能实现基因的转移。所以必须从大量的培养细胞中筛选出已被以必须从大量的培养细胞中筛选出已被外源外源DNA转化了的细胞，然后建立无性转化了的细胞，然后建立无性繁殖系，使所需基因大量扩增和表达。繁殖系，使所需基因大量扩增和表达。现在学习的是第26页，共38页重组体的筛选重组体的筛选 screening/selection 1.直接选择法直接选择法 抗药性标志选择抗药性标志选择 标志补救标志补救 表达产物与营养缺陷互补表达产物与营养缺陷互补 互补互补 蓝白斑筛选蓝白斑筛选 分子杂交分子杂交 探针探针原位杂交原位杂交/Southern印迹法印迹法 限制性酶切图谱限制性酶切图谱/PCR 2.非直接选择法非直接选择法 免疫学方法免疫学方法现在学习的是第27页，共38页七七 克隆基因的表达克隆基因的表达 载体有转录、翻译的元件载体有转录、翻译的元件 密码子通用密码子通用1、原核表达体系原核表达体系 原核表达载体的标准原核表达载体的标准 合适的筛选标志合适的筛选标志 强启动子强启动子 翻译控制序列翻译控制序列 多克隆位点多克隆位点现在学习的是第28页，共38页融合蛋白融合蛋白 包涵体包涵体大肠杆菌表达体系的不足大肠杆菌表达体系的不足缺乏转录后加工机制，只能表达缺乏转录后加工机制，只能表达cDNA缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化化融合蛋白形成包涵体，复性后才有活性融合蛋白形成包涵体，复性后才有活性1.很难表达大量的可容性蛋白很难表达大量的可容性蛋白现在学习的是第29页，共38页现在学习的是第30页，共38页真核表达体系真核表达体系 筛选标志筛选标志 Neor G418转染方法转染方法磷酸钙沉淀磷酸钙沉淀DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染电穿孔电穿孔脂质体转染脂质体转染显微注射显微注射瞬时转染瞬时转染 目的基因不整合进宿主基因组目的基因不整合进宿主基因组稳定转染稳定转染 目的基因整合进宿主基因组目的基因整合进宿主基因组 现在学习的是第31页，共38页第三节第三节 转基因动物技术转基因动物技术 一、转基因动物的概念一、转基因动物的概念 转基因技术是将外源转基因技术是将外源DNA导入细胞的一种技术。导入细胞的一种技术。它是在它是在DNA重组技术的基础上发展起来的。重组技术的基础上发展起来的。1981年年G o r d o n和和 R u d d l e首 次 用 显 微 注 射 法首 次 用 显 微 注 射 法(Microinjection)把外源基因导入小鼠受精卵的雄核，把外源基因导入小鼠受精卵的雄核，并将注射后的受精卵植入假孕母鼠子宫，产生了的并将注射后的受精卵植入假孕母鼠子宫，产生了的78只小鼠，其中有只小鼠，其中有2只的所有细胞中只的所有细胞中(包括生殖细胞包括生殖细胞)都都含有外源基因，但因缺乏启动子而不能表达，他们把出含有外源基因，但因缺乏启动子而不能表达，他们把出生后带外源基因的小鼠叫做转基因小鼠生后带外源基因的小鼠叫做转基因小鼠(Transgenic Mice)，自此以后，凡带有外源基因的动物都叫做转基，自此以后，凡带有外源基因的动物都叫做转基因动物因动物(Transgenic animal)。现在学习的是第32页，共38页二、转基因动物技术的一般步骤二、转基因动物技术的一般步骤(1)选择能有效表达的蛋白质；选择能有效表达的蛋白质；(2)克隆与分离编码这些蛋白质的基因；克隆与分离编码这些蛋白质的基因；(3)选择能与所需组织特异性表达方式相适应的基因调节选择能与所需组织特异性表达方式相适应的基因调节序列；序列；(4)把调节序列与结构基因重组拼接，并在培养细胞或把调节序列与结构基因重组拼接，并在培养细胞或小鼠中预先检验其表达情况；小鼠中预先检验其表达情况；(5)把拼接的基因注射到受精卵的细胞核中；把拼接的基因注射到受精卵的细胞核中；(6)把注射后的受精卵移植到子宫，完成胚胎发把注射后的受精卵移植到子宫，完成胚胎发(7)检测幼畜是否整合外源基因、外源基因的表达情况以检测幼畜是否整合外源基因、外源基因的表达情况以及外源基因在其后代中的传递情况。及外源基因在其后代中的传递情况。现在学习的是第33页，共38页三、导入基因的方法三、导入基因的方法 导入外源基因的方法有多种，一些方导入外源基因的方法有多种，一些方法已在上一节作过叙述，如：法已在上一节作过叙述，如：反转录反转录病毒转染法；病毒转染法；磷酸钙沉淀法；磷酸钙沉淀法；脂质脂质体介导法；体介导法；血影细胞血影细胞(Blood shadow cell)介导法。在此再介绍一些方法，介导法。在此再介绍一些方法，1）DNA微注射法；微注射法；2）精子载体法；）精子载体法；3)胚胎胚胎干细胞（干细胞（ES）介导法；）介导法；4)染色体片段注染色体片段注入法；入法；5)电转移法等。在转基因动物中，电转移法等。在转基因动物中，DNA微注射法比较常用。微注射法比较常用。现在学习的是第34页，共38页四、基因的选择与转基因动物四、基因的选择与转基因动物的研究现状的研究现状(一一)转入基因的选择转入基因的选择 (二二)转基因动物的研究意义转基因动物的研究意义1提高动物生长、生产性能的研究提高动物生长、生产性能的研究 2改变奶蛋白成分和性质的设想改变奶蛋白成分和性质的设想 3利用家畜产品生产药物蛋白的研究利用家畜产品生产药物蛋白的研究 现在学习的是第35页，共38页第四节第四节 动物克隆技术动物克隆技术 一、动物克隆的概念一、动物克隆的概念 所谓克隆所谓克隆(Cloning)(Cloning)就是无性繁殖，就是无性繁殖，动物克隆动物克隆(Animal cloning)(Animal cloning)就是不经过就是不经过受精过程而获得动物新个体的方法。克受精过程而获得动物新个体的方法。克隆动物隆动物(cloning animal)就是指不经过生就是指不经过生殖细胞而直接由体细胞获得新的动物个殖细胞而直接由体细胞获得新的动物个体。体。现在学习的是第36页，共38页二、克隆动物的一般步骤二、克隆动物的一般步骤 送入子宫，完成胚胎发育送入子宫，完成胚胎发育克隆的动物克隆的动物现在学习的是第37页，共38页感谢大家观看感谢大家观看9/5/2022现在学习的是第38页，共38页