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小鼠断髓法 Tca8113肿瘤微环境诱导小鼠髓源性树突状细胞免疫耐受性的研究 R73 A1672-3873（2011）03-0019-03 目的：tca8113肿瘤微环境诱导骨髓CD34+细胞分化为免疫耐受树突状细胞体外试验探讨。方法：利用无菌小鼠长骨骨髓细胞，比照组在常规重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组小鼠白介素-4（rmIL-4）培育液中培育，诱导分化为DCs，试验组在培育样体系中再加入舌鳞癌细胞株培育上清液，比照组不加任何干预因素。培育六天后加入（LPS）视察其对外源性刺激的反应,流式细胞术检测DCs表型CD86、CD11C、MHC-表达，混合淋巴细胞增殖试验比较其在体外刺激T淋巴细胞增殖实力。结果：tca8113肿瘤微环境不能抑制DCs成熟；tca8113-DC和LPS+tca8113-DC MCH-表达高于DC 和LPS+DC，p0.05; tca8113-DC刺激T淋巴细胞增殖的实力弱于比照组， p 1.4.3 树突状细胞培育 将收集到的小鼠骨髓细胞以含10g/ml rmGM-CSF+10g/ml rmIL-4的10胎牛血清RPMI1640培育液配成2×109/L骨髓细胞悬液，6ml/瓶接种于50ml培育瓶。将其分为试验组（tca8113-DC）：培育体系中再加入含 cs-Tca8113 1.4ml；比照组（DC）：不加任何干预因素。全部细胞置37、5CO2，饱和湿度条件下培育48h换液，仅保留贴壁细胞，同时再加入培育液试验组加入含培育液6ml；试验组再加入1.4mlcs-tca8113；之后隔日半量换液，试验组额外补入3ml培育液+0.7ml cs-Tca8113；培育至第六天收集悬浮细胞计。每组取1/3细胞送流式细胞仪检测，每组剩余2/3细胞10胎牛血清RPMI1640 4ml重悬后接种于20ml培育瓶，同时加入LPS至10g/ml，接着全部细胞置37、5CO2，饱和湿度条件下培育24小时后，收集各组悬浮细胞（LPS+DC、LPS+tca8113-DC），送流式细胞仪检测及混合淋巴细胞反应。 1.4.4 DCs表型CD11c、CD86、MCH-检测 于培育第六天收集各组悬浮细胞部分送流式细胞仪检测，部分细胞加入LPS培育24小时后送流式细胞仪检测 1.4.5 混合淋巴细胞反应 制备C57BL/6小鼠脾细胞悬液，用淋巴细胞分层液李显获得单核细胞，尼龙毛刷吸附获得T淋巴细胞，与经50微克/ml丝裂霉素C灭活的各组DC（2×105/孔）以不同浓度梯度混合培育与96孔原地细胞培育板中（含10胎牛血清RPMI 1640培育液），并设置阴性比照和无细胞空白比照，混合培育48h后在待测空中加入MTT液（5mg/ml），4h后吸去培育液和MTT混合液，加入DMSO液150 ul，酶标仪检测每孔OD值，波长设为570nm。刺激指数(SI)=（各测试孔OD值 -空白比照OD平均值）/（阴性比照组OD值-空白比照组OD值） 1.5 统计学处理 试验数据均以±s表示，两组数据的比较采纳t检测，所获得数据用统计软件SPSS 130分析，计算P 值, P 0.05，说明肿瘤微环境不抑制骨髓CD34+细胞分化为DCs；tca8113-DC、 LPS+tca8113-DC MCH-、DC 和LPS+DC 组MCH-+CD86 表达无统计学意义 p>0.05,说明肿瘤微环境不抑制DCs 成熟；比照组DC经LPS刺激前后,MCH-+CD86表达增加 p0.05，说明tca8113-imDC具有反抗成熟实力。见表1. 肿瘤微环境抑制髓源性小鼠树突状细胞刺激T淋巴细胞增殖实力 比照组DC刺激T淋巴细胞增殖SI=2.86±0.29,，经LPS刺激后LPS+DC诱导T细胞增殖活性明显提高SI=4.02±0.09 p 4Alessandro P, Maria RZ .Mechanisms of tumor escape: role of tumor microenvironment in inducing apoptosis Of cytolytic effector cellsJ.Arch Immunol Ther Exp,2006,54:323-333. 5Inaba K，Pack M，Inaba M，et a1High levels 0f a major histocompatibility complex -self peptide complex on dendritic from the T cell areas of lymph nodeJJ Exp Med，1997，186(5)：665-672 6 Lipscomb MF, Master BJ. Ddendritic cells: immune regulators in health and diseaseJ. Physiol Rev,2002,82(1):97 7 Casas R, Skarsvik , Lindstrom A ,et al. Casas R. Skarsvik S. Lindstrom A Impaired maturation of monocyte-derived dendritic cells from birch allergic individuals in association with birch-specific immune responsesJ. Scand J Immunol 2007,66(5):591 8 The Ministry of Science and Technology of the Peoples Republic of China. Guidance Suggestions for the Care and Use of Laboratory Animals. 2006-09-30. 9 Lutz MB ,Suri RM, Nmi M,et al. Immature dendritic cells generated with low doses of GM-CSF in the absence of IL-4 are maturation resistant and prolong allograft surivival in vivoJ.Eur Immunnol,2000,30:1813-1822 10 Thomson AW，Robbins PD. Tolerogenic dendritic cells for autoimmune disease and transplantationJ .Ann Rheum Dis.2008,67 Suppl 3:90-96 11 Stepkowski SM，Phan T，Zhang H ，et al .Immature syngeneic dendritic cells potentiate tolerance to pancreatic islet allografts depleted of donor dendritic cells in microgravity culture condition J.Transplantion.2006,82（12）1756-1763. 12 Lutz MB，Schuler G .Immuatura，semi-mature and full mature dendritic cells ：which signal induce tolerance or immunity？J .Trends Immunol.2002,23(9):445-449 13 Adema GJDendritic cells from bench to bedside and backJImmunol Lett,2009，122(2)：128-130. 14 Chang C C，Ciubotariu R，Manavalan J S，Yuan J，et a1Tolerization of dendritic cells by T(S)cells：the crucial role of inhibitory receptors ILT3 and ILT4JNat Immunol，2002，3：237243 15 王志勇，李声伟，胡勤刚，田卫东， 树突状细胞体外诱导淋巴细胞抑制舌癌细胞生长的试验探讨，好用口腔医学杂志，2004 ，20(5)：517-521 16 张伟，胡可胜，孙继国. TGF-1对单核细胞来源的树突状细胞表型和功能的影响J.细胞与分子免疫学杂志，2009,25（12）：1101-1102. 注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
