核酸的提取及相关.ppt

关于核酸的提取及相关现在学习的是第1页，共89页I.I.质粒质粒DNADNA的提取、分离和纯化的提取、分离和纯化现在学习的是第2页，共89页一、质粒的基本性质一、质粒的基本性质 质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，不等，为双链、共价闭合环状为双链、共价闭合环状DNA分子分子（covalently closed circular DNA,简称简称cccDNA），并以，并以超螺旋状态超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主的复制和转录系统，但质于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主的复制和转录系统，但质粒的复制和转录需要宿主细胞编码的某些酶和蛋白质。此外，质粒还粒的复制和转录需要宿主细胞编码的某些酶和蛋白质。此外，质粒还具有编码某些酶的基因，如对抗生素的抗性等。具有编码某些酶的基因，如对抗生素的抗性等。现在学习的是第3页，共89页质粒在细胞内的复制一般有二种：质粒在细胞内的复制一般有二种：紧密控制型紧密控制型（stringent control）和和松弛控制型（松弛控制型（relaxed control）。）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，通常每前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子；后者在整个个细胞内只含有一个或几个质粒分子；后者在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在贝，一般在20个以上。在细胞培养过程中，加个以上。在细胞培养过程中，加适当氯霉素可使松弛型质粒的拷贝数由原来的适当氯霉素可使松弛型质粒的拷贝数由原来的20多个扩增至多个扩增至1000-3000个。个。现在学习的是第4页，共89页质粒的不相容性（质粒的不相容性（incompatibility）利用利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时进入同一细胞时，它胞中共同存在，当两种质粒同时进入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞过程中相互竞争，只有们在复制及随后分配到子细胞过程中相互竞争，只有一种质粒占优势。这样，过几代后，占小数的质粒将一种质粒占优势。这样，过几代后，占小数的质粒将丢失，在细胞后代中只有二种质粒中的一种。这种现丢失，在细胞后代中只有二种质粒中的一种。这种现象称为象称为质粒的不相容性（质粒的不相容性（incompatibility）。）。但利用不同但利用不同复制系统的不同质粒可在同一宿主细胞中共同存在复制系统的不同质粒可在同一宿主细胞中共同存在。现在学习的是第5页，共89页二、质粒二、质粒DNADNA的制备基本原理的制备基本原理(碱法）碱法）从细胞中分离质粒从细胞中分离质粒DNA DNA 的方法都包括的方法都包括3 3个基本步骤：培养个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA.DNA.采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁，采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁，SDSSDS和和Triton X-100Triton X-100可使可使细胞膜裂解。细胞膜裂解。处理后细菌染色体处理后细菌染色体DNADNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体于细菌染色体DNADNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线形染色体当用强热或酸、碱处理时，细菌的线形染色体DNADNA变性，而变性，而cccDNAcccDNA的二条链不会相互分开。的二条链不会相互分开。当外界条件恢复正常时，线状染色体当外界条件恢复正常时，线状染色体DNADNA片段难以复性，片段难以复性，而与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒而与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNADNA双链又双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。于液相中。通过离心可获得质粒通过离心可获得质粒DNADNA。现在学习的是第6页，共89页三、试剂三、试剂LB液体培养基液体培养基:蛋白胨（蛋白胨（tryptone）10g,酵母提取物（酵母提取物（yeast extract）5g,NaCl 10g,用用NaOH调至调至pH7.2-7.5。高压下蒸汽灭菌。高压下蒸汽灭菌20分钟。分钟。LB固体培养基固体培养基：每升液体培养基加：每升液体培养基加12g 琼脂粉，高压下蒸汽灭菌琼脂粉，高压下蒸汽灭菌20分钟。分钟。氨苄青霉素（氨苄青霉素（Amp）母液）母液：配成：配成50mg/ml水溶液，水溶液，-20 下保存备用。下保存备用。溶液溶液I：50mmol/L葡萄糖、葡萄糖、25mmol/L TrisCl(pH8.0),10mmol/L EDTA(pH8.0).高高压蒸汽灭菌压蒸汽灭菌15分钟分钟,储存于储存于4 oC冰箱。冰箱。溶液溶液II：0.2mol/L NaOH(临用前用临用前用10 mol/L NaOH母液稀释母液稀释)，1%SDS.溶液溶液III:5 mol/L KAC 60ml,冰醋酸冰醋酸 11.5ml,水水28.5ml.RNase A母液母液：将：将RNase A酶粉溶于酶粉溶于10mmol/L TrisCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl,终浓度为终浓度为10mg/ml。100 加热加热15分钟，冷却后分装。分钟，冷却后分装。饱和酚：饱和酚：市售酚需重蒸。重蒸后加市售酚需重蒸。重蒸后加0.1%8-羟基喹啉，并用等体积的羟基喹啉，并用等体积的0.5mol/L TrisCl(pH8.0)和和0.1mol/L TrisCl(pH8.0)缓冲液反复抽提，使缓冲液反复抽提，使pH达到达到7.6以上。以上。氯仿：氯仿：按氯仿按氯仿/异戊醇异戊醇=24：1混合。混合。酚酚/氯仿：氯仿：将上述饱和酚和氯仿按将上述饱和酚和氯仿按1：1混合。混合。TE缓冲液：缓冲液：10mol/L TrisCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0).高压蒸气灭菌高压蒸气灭菌15分分钟钟,储存于储存于4 冰箱。冰箱。现在学习的是第7页，共89页四、操四、操 作作 步步 骤骤1 1细菌的培养和收集：细菌的培养和收集：将含有质粒将含有质粒pBSpBS的的DH5DH5 菌株接种在菌株接种在LBLB固体培养基（含固体培养基（含5050 g/ml g/ml AmpAmp）中，）中，3737培养培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB5ml LB液体培养液体培养基（含基（含 5050 g/ml Ampg/ml Amp）中，）中，3737培养约培养约1212小时至对数生长后期。小时至对数生长后期。2 2 质粒质粒DNADNA的少量快速提取的少量快速提取-碱裂解法碱裂解法 1).1).取取1.5ml1.5ml培养液倒入培养液倒入1.5ml ependorf 1.5ml ependorf 管中，管中，4 4下下12000g12000g离心离心3030秒。秒。2).2).弃上清，将管倒置于卫生纸上数秒钟，使液体流尽。弃上清，将管倒置于卫生纸上数秒钟，使液体流尽。3).3).菌体沉淀重悬浮于菌体沉淀重悬浮于100100 l l 溶液溶液I I中（中（激烈震荡激烈震荡，充分混匀），室，充分混匀），室 温下放置温下放置5-105-10分钟。分钟。4).4).加入新配制的溶液加入新配制的溶液II 200II 200 l l，盖紧管口，并倒置离心管，温和颠盖紧管口，并倒置离心管，温和颠 倒倒ependorfependorf管数次，以混匀内容物（管数次，以混匀内容物（千万不要震荡千万不要震荡）中，冰浴中）中，冰浴中 放置放置5 5分钟。分钟。5).5).加入加入150150 l l预冷的溶液预冷的溶液IIIIII，盖紧管口，并倒置离心管，盖紧管口，并倒置离心管，温和颠倒温和颠倒 ependorfependorf管数次，以混匀内容物，冰浴中放置管数次，以混匀内容物，冰浴中放置5-105-10分钟。分钟。4 4下下 12000g12000g离心离心5-105-10分钟分钟,取取上清上清。现在学习的是第8页，共89页6).将上清液移入干净将上清液移入干净ependorf管中，加入等体积的酚管中，加入等体积的酚/氯氯仿仿(1:1)，震荡混匀，震荡混匀，4下下12000g离心离心5分钟。分钟。7).将上清液移入干净将上清液移入干净ependorf管中，加入等体积的氯仿，管中，加入等体积的氯仿，震荡混匀，震荡混匀，4下下12000g离心离心5分钟。分钟。8).将水相移入干净将水相移入干净ependorf管中，加入管中，加入2倍体积的无水乙倍体积的无水乙醇醇，震荡混匀后置于，震荡混匀后置于-20冰箱中冰箱中20分钟。然后在分钟。然后在 4下下12000g离心离心10分钟。分钟。9).弃上清液，将管口敞开并倒置于卫生纸上，使液体流尽。弃上清液，将管口敞开并倒置于卫生纸上，使液体流尽。加入加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀。乙醇洗涤沉淀。4下下12000g离心离心5-10分钟。分钟。10).吸去上清液，将管倒置于卫生纸上，使液体流尽，吸去上清液，将管倒置于卫生纸上，使液体流尽，室温干燥或真空干燥室温干燥或真空干燥10分钟分钟.11).将沉淀溶于将沉淀溶于20 l TE缓冲液（缓冲液（pH8.0,含含20 g/ml RNase A）中，储于中，储于-20 C冰箱冰箱.现在学习的是第9页，共89页附附:日常型质粒日常型质粒DNA小量纯化试剂盒小量纯化试剂盒（硅膜吸附）硅膜吸附）原理：原理：带负电荷的带负电荷的DNA和带正电的二氧化硅粒子有很高的和带正电的二氧化硅粒子有很高的亲和力。阳离子亲和力。阳离子Na发挥桥梁作用，吸附核酸磷酸盐骨架发挥桥梁作用，吸附核酸磷酸盐骨架上带负电荷的氧，在高盐的酸性条件下，上带负电荷的氧，在高盐的酸性条件下，Na+打破水中打破水中的氢和二氧化硅上带负电荷的氧离子间的氢键，的氢和二氧化硅上带负电荷的氧离子间的氢键，DNA与与二氧化硅紧密结合，先洗涤除去其他杂质，再用低离子强二氧化硅紧密结合，先洗涤除去其他杂质，再用低离子强度的度的TE缓冲液或蒸馏水洗脱结合的缓冲液或蒸馏水洗脱结合的DNA分子。分子。现在学习的是第10页，共89页该试剂盒沿用传统的该试剂盒沿用传统的SDS碱裂解法，结合碱裂解法，结合DNA制备膜选择性地吸附制备膜选择性地吸附DNA的方法达到快速纯化质粒的方法达到快速纯化质粒DNA的目的。适合于从的目的。适合于从4ml LB细菌培养物中提取细菌培养物中提取520ug纯净的质粒纯净的质粒DNA，用于测序、体外转录，用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。生物学实验。现在学习的是第11页，共89页现在学习的是第12页，共89页操作步骤操作步骤 第一次使用时，将试剂盒携带的第一次使用时，将试剂盒携带的RNaseAlRNaseAl全部加入全部加入到到S1S1溶液中，混合均匀，溶液中，混合均匀，44保存。保存。1 1取取3ml3ml在在LBLB培养基中培养过夜的菌液培养基中培养过夜的菌液(若使用丰富培养基，若使用丰富培养基，菌液体积应减半或更少菌液体积应减半或更少)，12000rpm12000rpm离心离心20s20s，弃尽上清；，弃尽上清；2 2用用0.25ml0.25ml已加入已加入RNaseAlRNaseAl的的S1S1溶液溶液悬浮细菌沉淀，悬浮悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块；需均匀，不应留有小的菌块；3 3加加0.25ml 0.25ml S2S2溶液溶液，温和并充分地上下翻转混合均匀，温和并充分地上下翻转混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过过5 min5 min；4 4加入加入0.5ml 40.5ml 4预冷的预冷的S3S3溶液溶液，温和并充分地上下翻转，温和并充分地上下翻转混合均匀，直至形成紧实的凝集块，室温静置混合均匀，直至形成紧实的凝集块，室温静置2min2min。最。最高速度高速度(12000rpm)(12000rpm)离心离心5 min5 min；现在学习的是第13页，共89页操作步骤操作步骤(续续)5吸取步骤吸取步骤4中的离心上清并转移到中的离心上清并转移到DNA制备管制备管(置于置于2ml离心管离心管中中)，3600rpm离心离心l min。如制备管中有液体残留，适当提高离心。如制备管中有液体残留，适当提高离心速度，再离心速度，再离心1 min，弃滤液；，弃滤液；6将将制备管制备管置回离心管，加置回离心管，加0.5ml Wl溶液溶液，3600rpm离心离心 30s，弃滤液；弃滤液；7将制备管置回离心管，加将制备管置回离心管，加0.7ml W2溶液溶液，3600rpm离心离心30s；以同样的方法再用以同样的方法再用0.7ml W 2溶液洗涤一次。弃滤液；溶液洗涤一次。弃滤液；8 将制备管移入离心管中，将制备管移入离心管中，12000rpm离心离心1 min；9 将制备管移入新的将制备管移入新的1.5 ml离心管中，在离心管中，在DNA制备膜正中央加制备膜正中央加60l水或洗脱液水或洗脱液，室温静置，室温静置lmin。12000rpm离心离心l min洗脱洗脱DNA。现在学习的是第14页，共89页质粒DNA电源图现在学习的是第15页，共89页磁珠法提取磁珠法提取DNA原理原理19941994年年T TL LHawkinsHawkins等发现羧基高分子表面在一定浓度等发现羧基高分子表面在一定浓度PEGPEGNaClNaCl条件下具有吸附核酸的能力，而在水或条件下具有吸附核酸的能力，而在水或TETE溶液中核酸又可以解吸溶液中核酸又可以解吸附。附。因此，在磁珠表面连接可特异地与因此，在磁珠表面连接可特异地与DNADNA发生作用的功能基团，使其具发生作用的功能基团，使其具有可逆吸附有可逆吸附DNADNA的特性。通常采用带有氨基、巯基、环氧基等基团的特性。通常采用带有氨基、巯基、环氧基等基团的活化试剂对磁珠表面包覆的高分子进行化学修饰。高盐离子浓的活化试剂对磁珠表面包覆的高分子进行化学修饰。高盐离子浓度下多聚核苷酸与羧基修饰的磁珠表面可发生非特异性吸附，而度下多聚核苷酸与羧基修饰的磁珠表面可发生非特异性吸附，而蛋白、单糖、多糖和脂类等细胞成分不被吸附的原理，这样就建蛋白、单糖、多糖和脂类等细胞成分不被吸附的原理，这样就建立了一种以磁性微珠为载体的立了一种以磁性微珠为载体的DNADNA纯化方法。纯化方法。相对微米或亚微米级载体，纳米磁性粒子具有尺寸小、偶联容量大、相对微米或亚微米级载体，纳米磁性粒子具有尺寸小、偶联容量大、悬浮稳定性高及超顺磁性等优点，便于各种反应高效快速进行。悬浮稳定性高及超顺磁性等优点，便于各种反应高效快速进行。现在学习的是第16页，共89页 该核酸提取法对该核酸提取法对DNA结构没有损伤，生物结构没有损伤，生物相容性高，相容性高，DNA可直接洗脱应用，纯度及纯化可直接洗脱应用，纯度及纯化效率等方面都较高。效率等方面都较高。现在学习的是第17页，共89页II、基因组、基因组DNA的提取的提取现在学习的是第18页，共89页一、概述一、概述 染色体染色体DNA 通常用于构建基因组文库和通常用于构建基因组文库和Southern杂交等，同时杂交等，同时在目前广受人们关注的生物基因组学研究中是最重要的研究目标。在目前广受人们关注的生物基因组学研究中是最重要的研究目标。1、基因组文库的构建：当用于构建基因组文库时，所得的染色、基因组文库的构建：当用于构建基因组文库时，所得的染色体体DNA的片段长度应尽可能的长（至少应大于需克隆片段的的片段长度应尽可能的长（至少应大于需克隆片段的4倍）。倍）。当用当用Cosmid构建文库时，片段长度应大于构建文库时，片段长度应大于200kb;用噬菌体构建文用噬菌体构建文库时应大于库时应大于80kb。但在制备过程中，有机溶剂的抽提、震荡、反复。但在制备过程中，有机溶剂的抽提、震荡、反复抽提和乙醇沉淀等步骤都会造成抽提和乙醇沉淀等步骤都会造成DNA断裂。我们应尽可能采用温和的方断裂。我们应尽可能采用温和的方法和手段。法和手段。2、Southern杂交：用于杂交：用于Southern杂交的染色体杂交的染色体DNA片段长度要求可适当片段长度要求可适当降低。降低。3、PCR AFLPRFLP等：等：DNA片段长度要求可适当降低。片段长度要求可适当降低。现在学习的是第19页，共89页一、概述一、概述 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提的提取方法有所不同；同种生物的不同种类或同一种类的不取方法有所不同；同种生物的不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的差异。在提取某种特殊组织的DNA时，必须参照文献和时，必须参照文献和经验建立的相应提取方法，以获得可用的经验建立的相应提取方法，以获得可用的DNA大分子。大分子。不同的植物材料提取的方法有差异，主要在提取不同的植物材料提取的方法有差异，主要在提取缓冲液的成分上，如李、苹果的植物的染色体缓冲液的成分上，如李、苹果的植物的染色体DNA提提取所用的提取缓冲液为：取所用的提取缓冲液为：18.6g葡萄糖、葡萄糖、6.9g二乙基二硫二乙基二硫代碳酸钠（代碳酸钠（Sarkosyl）、）、6.0gPVP、240ul巯基乙醇、加巯基乙醇、加水至水至300ml现在学习的是第20页，共89页二、植物基因组二、植物基因组DNA提取提取(水稻和其它禾本科植物)1、试剂、试剂 A.提取缓冲液：100mmol/L TrisCl（pH8.0）、20mmol/L EDTA、500mmol/L NaCl、1.5%SDS。B.氯仿/戊醇/乙醇溶液:80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇 C.异丙醇 D.TE:10mol/L TrisCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0).高压蒸气灭菌15分钟,储存于4 冰箱。E.RNase A：10mg/ml F.3mol/L NaAC现在学习的是第21页，共89页2、实验步骤、实验步骤在在50ml离心管中加入离心管中加入20ml提取缓冲液提取缓冲液，60水浴预热。水浴预热。水稻幼苗或叶子水稻幼苗或叶子5-10g，剪碎，在研钵中加，剪碎，在研钵中加液氮磨液氮磨成粉状后立即倒成粉状后立即倒入预热的含入预热的含提取缓冲液提取缓冲液的离心管中，剧烈摇动混匀，的离心管中，剧烈摇动混匀，60水浴保温水浴保温30-60分钟（时间长，分钟（时间长，DNA产量高），不时摇动。产量高），不时摇动。加入加入20ml 氯仿氯仿/戊醇戊醇/乙醇溶液乙醇溶液，颠倒混匀（需带手套，防止损伤皮，颠倒混匀（需带手套，防止损伤皮肤），室温下静置肤），室温下静置5-10分钟，使水相和有机相分层（必要时可重新混分钟，使水相和有机相分层（必要时可重新混匀）。匀）。室温下室温下5000rpm 离心离心5分钟。分钟。仔细移取上清液至另一仔细移取上清液至另一50ml离心管，加入一倍体积离心管，加入一倍体积异丙醇异丙醇，混匀，混匀，室温下放置片刻即出现絮状室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。沉淀。用玻棒捞出用玻棒捞出DNADNA沉淀，沉淀，70%70%乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。转入含转入含1ml TE 的的1.5ml eppendorf管中，管中，DNA很快溶解于很快溶解于TE。如如DNA不形成絮状沉淀，则可用不形成絮状沉淀，则可用5000rpm离心离心5分钟，再将沉淀移分钟，再将沉淀移入入TE管中。这样收集的沉淀，往往难溶解于管中。这样收集的沉淀，往往难溶解于TE，可在，可在60水浴放置水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。分钟以上，以帮助溶解。现在学习的是第22页，共89页2 2、实验步骤、实验步骤(续）续）H.将将DNADNA溶液溶液3000rpm离心离心5 5分钟，上清液倒入干净的分钟，上清液倒入干净的5ml5ml离心管。离心管。I.I.加入加入5ulRNase A（10ug/ul10ug/ul），），3710分钟，除去分钟，除去RNARNA（RNARNA对对DNADNA的操作分析一般无影响，可省略该步骤）。的操作分析一般无影响，可省略该步骤）。J.J.加入加入1/101/10体积的体积的3mol/L 3mol/L NaACNaAC及及2x2x体积的冰乙醇体积的冰乙醇，混匀，混匀，-20-20放置放置2020分钟左右，使分钟左右，使DNADNA形成絮状沉淀。形成絮状沉淀。K.K.用玻棒捞出用玻棒捞出DNADNA沉淀，沉淀，70%70%乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。L.L.将将DNADNA重新溶解于重新溶解于1mlTE中，中，-20贮存。贮存。M.M.取取2ul DNA样品在样品在0.7%Agarose胶上电泳，检测胶上电泳，检测DNADNA的分子大小。的分子大小。同时可取同时可取15ul 稀释稀释2020倍，测定倍，测定OD260/OD280，检测，检测DNADNA含量及质含量及质量。量。现在学习的是第23页，共89页3、DNA纯度与浓度测定纯度与浓度测定A、DNA纯度纯度：DNA的的OD260/OD280一般为一般为1.8左右。左右。OD260/OD280 1.8：说明较纯；：说明较纯；OD260/OD280 1.8：说明可能有：说明可能有RNA污染；污染；OD260/OD280 1.8：说明可能有蛋白质污染。：说明可能有蛋白质污染。B、DNA浓度浓度：当：当OD260为为1时，时，dsDNA含量为含量为50ug/ml,ssDNA或或RNA含量为含量为40 g/ml；单链寡核苷酸为；单链寡核苷酸为20 ug/ml.dsDNA（g/ml）=50 OD260 稀释倍数稀释倍数现在学习的是第24页，共89页附附:动动/植物基因组植物基因组DNA小量纯化试剂盒小量纯化试剂盒1 1、基本原理：、基本原理：该试剂盒采用公司自身研该试剂盒采用公司自身研制的相分离技术和制的相分离技术和DNADNA制备膜制备膜选择性吸附选择性吸附DNADNA 的原理从的原理从1-1-10mg10mg新鲜动物组织或新鲜动物组织或2-20mg2-20mg新新鲜植物组织中提取至多鲜植物组织中提取至多20ug20ug纯纯净的染色体净的染色体DNA.DNA.现在学习的是第25页，共89页2、实验步骤、实验步骤 样品收集：样品收集：100mg 新鲜植物叶片，剪刀成小块，放入研钵中，新鲜植物叶片，剪刀成小块，放入研钵中，加入液氮，使植物组织冷冻完全后，快速、用力研磨至粉末状。加入液氮，使植物组织冷冻完全后，快速、用力研磨至粉末状。研磨时应间断加入液氮防止组织融化。研磨充分后将研钵放入研磨时应间断加入液氮防止组织融化。研磨充分后将研钵放入65水浴至样品粉末刚开始融化。水浴至样品粉末刚开始融化。加入加入700ul G-A 溶液溶液和和1.2ul RNase A1贮存液贮存液，用力研磨，用力研磨30秒。秒。转移转移650ul研磨好的匀浆至研磨好的匀浆至2ml离心管中，如体积不到离心管中，如体积不到650ul,加加buffer G-A 溶液至溶液至650ul,65下保温下保温15min。加加400ul G-B溶液溶液和和1ml DV溶液溶液(4 预冷），用力混匀，预冷），用力混匀，12000g离心离心2min.去上相液体，保留间相和下相溶液。加入去上相液体，保留间相和下相溶液。加入1ml DV溶液溶液(4 预预冷），用力混匀，冷），用力混匀，12000g离心离心2min.去上相液体，将下相溶液转移至去上相液体，将下相溶液转移至微量滤器微量滤器(置于置于2ml离心管中）。离心管中）。12000g离心离心30秒。秒。现在学习的是第26页，共89页2、实验步骤、实验步骤弃上相，在过滤液中加入弃上相，在过滤液中加入400ul DV溶液溶液,混合均匀。混合均匀。将将制备管制备管置于置于2ml 离心管中，加入步骤离心管中，加入步骤G的样品。的样品。12000g离心离心30秒。秒。弃滤液，将制备管置于原弃滤液，将制备管置于原2ml 离心管中离心管中,加入加入500ul Wl 溶液溶液，12000g 离心离心30秒。秒。弃滤液，将制备管置于原弃滤液，将制备管置于原2ml 离心管中离心管中,加入加入700ul W2 溶液溶液，12000g 离心离心30秒。秒。弃滤液，将制备管置于原弃滤液，将制备管置于原2ml 离心管中离心管中,加入加入500ul W2溶液，溶液，12000g 离心离心1min。将制备管移入新的将制备管移入新的1.5 ml离心管中，在离心管中，在DNA制备膜正中央加制备膜正中央加100-200l水水或或洗脱液洗脱液，室温静置，室温静置l min。最高速度离心。最高速度离心l min洗脱洗脱DNA。现在学习的是第27页，共89页三、细菌基因组三、细菌基因组DNA提取提取1、试剂试剂10%SDS蛋白酶K(20mg/ml)氯仿：异戊醇（24：1）;苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）70%乙醇TE,5mol/L NaCl.RNase A：10mg/mlCTAB/NaCl 溶液：4.1gNaCl溶解于80mlH2O中，缓慢加入10 g CTAB,加水至100ml.A.(NaCl:Mr.58;0.8Mol/L)现在学习的是第28页，共89页十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性。在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里。在在高离子强度高离子强度的溶液里的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数多聚糖(除酸性多聚糖)形成复合物，只是不能沉淀核酸。因此CTAB可以用于从大量产生黏多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌(包括大肠杆菌的某些株)中制备纯化DNA。CTAB在制备基因组在制备基因组DNA的基本沉淀程序的基本沉淀程序：这种去污剂加入调节至高离子强度(0.7 mol/L NaCl)的细菌或细胞裂解液中。经过连续的酚和氯仿抽提去除CTAB黏多糖蛋白质复合物，用异丙醇无水乙醇沉淀上清即可获得基因组DNA。现在学习的是第29页，共89页CTAB结构式现在学习的是第30页，共89页2、实验步骤：、实验步骤：5 ml细菌培养过夜，12000rpm离心3分钟，去上清液。加567ul TE溶液悬浮沉淀，并加30ul 10%SDS,3ul蛋白酶K(20mg/ml),混匀，37水浴保温1小时。加100ul 的5mol/L NaCl,混匀。加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀，65水浴保温10min.用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提，12000rpm离心3分钟。仔细移取上清液至另一离心管中，加入一倍体积异丙醇，混匀，室温下放置10min,即出现絮状DNA沉淀。用勾状玻璃棒捞出DNA絮团，在70%乙醇中漂洗后在干净吸水纸上吸干，室温下干燥后转入100ul的TE溶液中，DNA很快溶解于TE。保存于-20。取2ulDNA样品在0.7%Agarose胶上电泳，检测DNA的分子大小。同时取15ul稀释20倍，测定OD260/OD280，检测DNA含量及质量。现在学习的是第31页，共89页附注如需降解RNA,则在步骤G后加入5ulRNaseA（10ug/ul），37保温30分钟，除去RNA（RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提，5000rpm离心10分钟。上清液至另一离心管中，加入1/10体积的3mol/L NaAC及2x体积的冰乙醇，混匀，-20放置20分钟左右，使DNA形成絮状沉淀。用玻棒捞出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。将DNA重新溶解于1mlTE中，-20贮存。现在学习的是第32页，共89页附附:细菌基因组细菌基因组DNA小量制备试剂盒小量制备试剂盒实验步骤实验步骤：样品收集：1ml 细菌培养液5000rpm离心3分钟，用0.8ml细菌原生质体制备缓冲液悬浮沉淀，加20ul溶菌酶贮存液溶菌酶贮存液，冰上放置10min.加0.3ml的0.25M EDTA,pH8.0,混合均匀，冰上放置5min。加0.3ml洗脱液，37保温5min.5000rpm离心5min.去上清，加0.1mlS-G溶液溶液，彻底悬浮沉淀，冰浴5min.加0.45ml50预热的G-A溶液溶液，用1ml枪头快速吸注10次；若太粘稠，则在45下保温5min,再用1ml枪头快速吸注10次。冰浴5min.加0.15mlG-C溶液溶液，混匀，12000rpm离心1min.A.将样品加于微量滤器微量滤器（置于2ml离心管中），12000rpm离心1min.现在学习的是第33页，共89页实验步骤（续）实验步骤（续）吸取步骤E中的混合液，转移到DNA制备管制备管(置于2ml离心管中)，3600rpm离心1min。如制备管中有液体残留，适当提高离心速度，再离心1 min，弃滤液；将制备管置回离心管，加0.5ml Wl溶液溶液，3600rpm离心3 0s，弃滤液；将制备管置回离心管，加0.7ml W2溶液溶液，3600rpm离心30s；以同样的方法再用0.7ml W 2溶液洗涤一次。弃滤液；将制备管置于离心管中，12000rpm离心1min.将制备管移入新的1.5 ml离心管中，在DNA制备膜制备膜正中央加60l水或洗脱液，室温静置1min。最高速度离心1min洗脱DNA。现在学习的是第34页，共89页细菌基因组DNA电源图现在学习的是第35页，共89页真核细胞基因组真核细胞基因组DNA电源图电源图现在学习的是第36页，共89页III、总、总RNA的制备的制备现在学习的是第37页，共89页一、概述一、概述 中心法则中心法则:DNA mRNA 蛋白质蛋白质 真核生物真核生物mRNA的特点的特点:真核生物的基因中有许多内含子真核生物的基因中有许多内含子,需需要通过要通过RNA的拼接加工的拼接加工,才能成为成熟的才能成为成熟的mRNA.因此真核生因此真核生物中提取的物中提取的mRNA,经反转录合成经反转录合成cDNA,进而克隆基因已成为进而克隆基因已成为分子生物学最重要的方法之一分子生物学最重要的方法之一.通常一个典型哺乳动物细胞约含通常一个典型哺乳动物细胞约含10-5ugRNA,但其中大部分为但其中大部分为 rRNA（28S,18S及及5S）和各种低分子量的）和各种低分子量的RNA(tRNA,小核小核RNA等等),只有只有1-5%为为mRNA。这些。这些mRNA的的大小和序列不一大小和序列不一,但其但其3端有端有一个一个poly(A)的结构，它编码了所有由该细胞合成的多肽。的结构，它编码了所有由该细胞合成的多肽。现在学习的是第38页，共89页实验器皿处理实验器皿处理 mRNA的分子结构容易受到的分子结构容易受到RNA酶的攻击反应而降解，加上酶的攻击反应而降解，加上RNA 酶极为稳定而且广泛存在，因此，在提取过程中应严格防止酶极为稳定而且广泛存在，因此，在提取过程中应严格防止RNA 酶的污染并设法抑制其活性，这是酶的污染并设法抑制其活性，这是实验成败的关键。实验成败的关键。人的皮肤、手指、试剂、容器等均可被污染，因此全部实验过程中人的皮肤、手指、试剂、容器等均可被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200烘烤烘烤2小时以上。凡小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等可用是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等可用0.1%的的焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液处理，再用蒸馏水冲净。水溶液处理，再用蒸馏水冲净。为了避免为了避免mRNA或或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上，所有吸附在玻璃或塑料器皿管壁上，所有器皿一律需经硅烷化处理。器皿一律需经硅烷化处理。现在学习的是第39页，共89页RNA酶抑制剂酶抑制剂A.焦碳酸二乙酯（焦碳酸二乙酯（DEPC）:强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。但DEPC能与胺与巯基反应，因而含Tris溶液溶液和DTT的试剂的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制后、然后高压灭菌高压灭菌。DEPC与氨水溶液混合会产生致与氨水溶液混合会产生致癌物！癌物！B.异硫氰酸胍（异硫氰酸胍（Guanidinium isothiocyanate）:为目前一种最有效的RNA酶抑制剂。它不但具有败坏细胞结构、核酸从核蛋白质中解离，同时也使RNA酶失活。因此在制备RNA时，缓冲液中常含有异硫氰酸胍。C.其它：其它：钒氧核苷酸复合物（Vanadyl-ribonucloside complex）RNA酶蛋白抑制制（RNasin）SDS,尿素等现在学习的是第40页，共89页二、试验方法二、试验方法 细胞内总RNA制备方法很多，如异硫氰酸胍热苯酚法、酚/SDS法等。许多公司有现成的总RNA提取试剂盒，可快速有效地提取到高质量的总RNA。现在学习的是第41页，共89页酚酚/SDS法制备总法制备总RNA1 基本原理基本原理：第一步用酚和SDS破碎细胞和去除蛋白质，第二步用LiCl选择沉淀RNA以去除DNA和其它不纯物。2 2、试剂、试剂匀浆缓冲液：0.18mol/L Tris,0.09mol/L LiCl,4.5mmol/L EDTA,1%SDS,pH8.2）TLE：0.2mol/L Tris,0.1mol/L LiCl,5mmol/L EDTA,pH8.2经平衡的酚LiCl 3mol/L NaACA.无水乙醇现在学习的是第42页，共89页3 3、实验步骤、实验步骤植物组织在液氮中磨成粉末，转入含植物组织在液氮中磨成粉末，转入含150ml匀浆缓冲匀浆缓冲液和液和50ml经经TLE平衡的酚的平衡的酚的500ml烧杯中烧杯中.匀浆匀浆2min，加，加50ml氯仿，温和混匀后，氯仿，温和混匀后，50放置放置20min。4下下10000rpm离心离心20分钟分钟.水相部分加水相部分加50ml经经TLE平平衡的酚衡的酚,混匀后加混匀后加50ml氯仿氯仿,混匀混匀4下下10000rpm离心离心15分钟分钟,水相部分用加经水相部分用加经TLE平衡的平衡的酚抽提直至无界面（一般酚抽提直至无界面（一般3次）。水相部分氯仿抽提一次）。水相部分氯仿抽提一次次现在学习的是第43页，共89页3 3、实验步骤、实验步骤(续续)水相部分加水相部分加LiCl至至2mol/L,4下沉淀过夜。下沉淀过夜。4下下10000rpm离心离心20分钟，用分钟，用2mol/L LiCl冲洗沉冲洗沉淀淀用用5ml水溶解，加水溶解，加LiCl至至2mol/L，4下沉淀下沉淀2小小时以上。时以上。4下下10000rpm离心离心20分钟，用分钟，用2mol/L LiCl冲洗沉淀冲洗沉淀用用2ml水溶解，加水溶解，加200ul 3mol/L NaAC和和5.5ml无无水乙醇，水乙醇，-20下沉淀过夜下沉淀过夜4下下10000rpm离心离心15分钟，用分钟，用1ml水溶解。水溶解。现在学习的是第44页，共89页异硫氰酸胍异硫氰酸胍/酚法制备总酚法制备总RNA1.基本基本原理原理 异硫氰酸胍异硫氰酸胍(GIT)与与巯基乙醇共同作用抑制巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性；的活性；GIT与与 十二烷基肌氨酸钠十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl）作用使蛋白质变性，从而释放）作用使蛋白质变性，从而释放RNA；酸性条件下；酸性条件下DNA极少发生解离，同蛋白质一起变性被离心下极少发生解离，同