核酸的分离纯化 (2).ppt

关于核酸的分离纯化关于核酸的分离纯化 (2)(2)现在学习的是第1页，共88页 DNADNA和和RNARNA是生物体中最重要的核酸分是生物体中最重要的核酸分子，是分子生物学和分子诊断的研究子，是分子生物学和分子诊断的研究对象对象 DNADNA和和RNARNA的分离纯化是分子生物学研的分离纯化是分子生物学研究及分子诊断最基础的工作究及分子诊断最基础的工作现在学习的是第2页，共88页核酸分离纯化的核酸分离纯化的原则原则:保持核酸一级结构的完整性保持核酸一级结构的完整性 尽可能提高核酸制品的纯度尽可能提高核酸制品的纯度现在学习的是第3页，共88页核酸分子提取的技术路线核酸分子提取的技术路线I.I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中现在学习的是第4页，共88页第一节第一节 核酸分离纯化的设计及原则核酸分离纯化的设计及原则第二节第二节 基因组基因组DNADNA的分离纯化的分离纯化第三节第三节 质粒质粒DNADNA的提取与纯化的提取与纯化第四节第四节 RNARNA的分离纯化的分离纯化第五节第五节 核酸的保存与鉴定核酸的保存与鉴定现在学习的是第5页，共88页第一节第一节 核酸分离纯化的核酸分离纯化的设计及原则设计及原则现在学习的是第6页，共88页一、材料与方法的选择一、材料与方法的选择二、技术路线的设计二、技术路线的设计三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存现在学习的是第7页，共88页（一）材料与方法的选择不同的研究目的对核酸的完整性、不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、纯度、产量及浓度有不同的要求。产量及浓度有不同的要求。需考虑制备核酸所需的时间与成本需考虑制备核酸所需的时间与成本 应选择安全的试剂与制备方案应选择安全的试剂与制备方案一、材料与方法的选择一、材料与方法的选择现在学习的是第8页，共88页 1.1.保持核酸碱基序列的完整性保持核酸碱基序列的完整性 2.2.尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度 3.3.保持核酸的完整性保持核酸的完整性 尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间 尽量避免各种有害因素对核酸的破坏尽量避免各种有害因素对核酸的破坏 （二）（二）选择原则选择原则一、材料与方法的选择一、材料与方法的选择现在学习的是第9页，共88页二、技术路线的设计二、技术路线的设计（一）核酸的释放（一）核酸的释放（二）核酸的分离与纯化（二）核酸的分离与纯化（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤现在学习的是第10页，共88页（一）核酸的释放DNADNA和和RNARNA均位于细胞内（病毒除均位于细胞内（病毒除外），因此核酸分离与纯化的外），因此核酸分离与纯化的第一步第一步即即是裂解细胞、释放核酸。是裂解细胞、释放核酸。现在学习的是第11页，共88页现在学习的是第12页，共88页应该清除的杂质主要包括应该清除的杂质主要包括:1.1.非核酸的大分子污染物非核酸的大分子污染物 蛋白质、多糖及脂类物质等蛋白质、多糖及脂类物质等 2.2.非需要的核酸分子非需要的核酸分子 分离某一核酸分子时，其它核酸皆为分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质杂质 3.3.加入的有机溶剂和某些金属离子加入的有机溶剂和某些金属离子（二）核酸的分离与纯化（二）核酸的分离与纯化现在学习的是第13页，共88页（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤 沉淀沉淀是浓缩是浓缩核酸最常用的方法核酸最常用的方法 常用的常用的盐类盐类:醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁氯化钠、氯化钾及氯化镁 常用的常用的有机溶剂有机溶剂:乙醇、异丙醇和聚乙乙醇、异丙醇和聚乙二醇二醇 核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用需用70%70%75%75%的乙醇洗涤的乙醇洗涤去除去除现在学习的是第14页，共88页三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存（一）核酸的鉴定（一）核酸的鉴定（二）核酸的保存（二）核酸的保存现在学习的是第15页，共88页（一）核酸的鉴定（一）核酸的鉴定1.1.浓度鉴定浓度鉴定2.2.纯度鉴定纯度鉴定3.3.完整性鉴定完整性鉴定现在学习的是第16页，共88页 紫外分光光度法：紫外分光光度法：核酸分子中的碱基具有共轭双核酸分子中的碱基具有共轭双键结构，可以吸收紫外线，其最大键结构，可以吸收紫外线，其最大吸收波长为吸收波长为260nm260nm。1.1.浓度鉴定浓度鉴定现在学习的是第17页，共88页 各种碱基的紫外吸收光谱各种碱基的紫外吸收光谱现在学习的是第18页，共88页 荧光光度法：荧光光度法：核酸的荧光染料溴化乙锭嵌入碱核酸的荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在基平面后，本身无荧光的核酸在 UV UV 激发下发出红色荧光。荧光强度的积激发下发出红色荧光。荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。分与溶液中核酸的含量呈正比。现在学习的是第19页，共88页EBEB与与DNADNA的结合的结合现在学习的是第20页，共88页现在学习的是第21页，共88页 紫外分光光度法：紫外分光光度法：主要通过主要通过A A260260与与A A280280的比值来判定有的比值来判定有无蛋白质的污染。比值升高或降低均提示无蛋白质的污染。比值升高或降低均提示制备的核酸纯度不佳。制备的核酸纯度不佳。2.2.纯度鉴定纯度鉴定现在学习的是第22页，共88页1.DNA1.DNA或或RNARNA的定量的定量ODOD260260=1.0=1.0相当于相当于 50 50g/mlg/ml双链双链DNADNA 40g/ml 40g/ml单链单链DNADNA（或（或RNARNA）20g/ml 20g/ml寡核苷酸寡核苷酸2.2.判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度 DNA DNA纯品纯品:ODOD260260/OD/OD280 280=1.8=1.8 RNA RNA纯品纯品:ODOD260260/OD/OD280 280=2.0=2.0现在学习的是第23页，共88页荧光光度法：荧光光度法：EBEB等荧光染料示踪的核酸电泳可判定等荧光染料示踪的核酸电泳可判定核核酸制品的纯度。酸制品的纯度。现在学习的是第24页，共88页琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：以以EBEB为示踪剂的核酸凝胶电泳可判为示踪剂的核酸凝胶电泳可判定核酸制品的完整性定核酸制品的完整性基因组基因组DNADNA如果发生降解，电泳图呈如果发生降解，电泳图呈拖尾状拖尾状 3.3.完整性鉴定完整性鉴定现在学习的是第25页，共88页DNADNA的降解的降解现在学习的是第26页，共88页 完整的或降解很少的完整的或降解很少的总总RNARNA电泳图谱电泳图谱中，三条中，三条带荧光强度应呈特定的比值。带荧光强度应呈特定的比值。沉降系数大，电泳迁移率低，荧光强度沉降系数大，电泳迁移率低，荧光强度高高 沉降系数小，电泳迁移率高，荧光强度低沉降系数小，电泳迁移率高，荧光强度低 现在学习的是第27页，共88页 28S28S（或（或23S23S）RNARNA的荧光强度一般约为的荧光强度一般约为18S18S（或（或16S16S）RNARNA的的2 2倍，否则提示有倍，否则提示有RNARNA的降解的降解 若在点样孔附近有着色条带，提示可能存若在点样孔附近有着色条带，提示可能存在在DNADNA的污染的污染现在学习的是第28页，共88页现在学习的是第29页，共88页（二）核酸的保存（二）核酸的保存1.DNA1.DNA的储存的储存2.RNA2.RNA的储存的储存现在学习的是第30页，共88页 溶于溶于TETE缓冲液中的缓冲液中的DNADNA在在-70-70冰箱可保冰箱可保存数年。存数年。TETE的的pHpH为为8.08.0时，时，DNADNA的脱氨反应减少，的脱氨反应减少，pHpH低低7.07.0时时DNADNA易变性。易变性。1.1.DNADNA的保存的保存现在学习的是第31页，共88页 2.RNA的保存 RNARNA溶于溶于H H2 2O O或或0.3mol/L0.3mol/L的的NaAcNaAc溶液中，溶液中，-70-70 保存保存 RNARNA溶液中加入溶液中加入RNasinRNasin或或VRCVRC，可延长保存时间，可延长保存时间 用于配置试剂及溶解用于配置试剂及溶解RNARNA的的H H2 2O O均应经均应经DEPCDEPC处理处理现在学习的是第32页，共88页第二节第二节 真核基因组真核基因组DNADNA的分离纯化的分离纯化现在学习的是第33页，共88页生物体组织细胞生物体组织细胞玻棒缠绕法玻棒缠绕法酚抽提法酚抽提法基因组基因组 DNA粗品粗品PFGE分离分离特定的特定的DNA片段片段AGE分离分离PAGE分离分离乙醇沉淀洗涤乙醇沉淀洗涤基因组基因组DNA纯品纯品精分离精分离粗分离粗分离前处理前处理离子交换层析纯化离子交换层析纯化有机溶剂抽提有机溶剂抽提细胞裂解蛋白质变性沉细胞裂解蛋白质变性沉淀降解淀降解DNA释放释放甲酰胺解聚法甲酰胺解聚法 哺乳动物基因组哺乳动物基因组DNADNA分离纯化的一般技术路线分离纯化的一般技术路线现在学习的是第34页，共88页基因组基因组DNA的提取的提取-酚抽提法酚抽提法样品的准备细胞的裂解蛋白质变性DNA的抽提DNA的沉淀现在学习的是第35页，共88页血基因组血基因组DNA试剂盒试剂盒酵母基因组酵母基因组DNA试剂盒试剂盒细菌基因组细菌基因组DNA试剂盒试剂盒细胞基因组细胞基因组DNA试剂盒试剂盒现在学习的是第36页，共88页一、酚抽提法一、酚抽提法二、甲酰胺解聚法二、甲酰胺解聚法三、玻棒缠绕法三、玻棒缠绕法四、其它方法四、其它方法五、五、DNADNA片段的纯化片段的纯化六、六、DNADNA片段的回收片段的回收现在学习的是第37页，共88页 一、酚抽提法 19761976年由年由StaffordStafford及其同事创立，现在及其同事创立，现在使用的是改进的方法使用的是改进的方法 以含以含EDTAEDTA、SDSSDS及及RNaseRNase的的裂解缓冲液裂解裂解缓冲液裂解细胞细胞 经经蛋白酶蛋白酶K K处理后，用处理后，用pH8.0pH8.0的的TrisTris饱和饱和酚酚抽提，获得抽提，获得DNADNA粗制品粗制品现在学习的是第38页，共88页现在学习的是第39页，共88页二、甲酰胺解聚法 19871987年年KupiecKupiec等报道了甲酰胺解聚法，等报道了甲酰胺解聚法，其中细胞裂解和蛋白质水解步骤同酚抽其中细胞裂解和蛋白质水解步骤同酚抽提法，但不进行酚的抽提。提法，但不进行酚的抽提。现在学习的是第40页，共88页三、玻棒缠绕法玻棒玻棒缠绕法是在缠绕法是在Bowtell(1987)Bowtell(1987)方法的基础上经改方法的基础上经改进而来进而来现在学习的是第41页，共88页四、其它方法 有些分子诊断技术并不需要高分子有些分子诊断技术并不需要高分子量的量的DNADNA样品，因此步骤简化、操作简样品，因此步骤简化、操作简便的便的DNADNA快速提取法广泛使用。快速提取法广泛使用。1.1.异丙醇沉淀法异丙醇沉淀法 2.2.玻璃珠吸附法玻璃珠吸附法现在学习的是第42页，共88页五、DNA片段的纯化 常用的纯化方法：常用的纯化方法：有机溶剂抽提法有机溶剂抽提法 柱 层 析 法（柱 层 析 法（c o l u m n c o l u m n chromatographychromatography）现在学习的是第43页，共88页现在学习的是第44页，共88页六、DNA片段的回收原则与要求原则与要求:1.1.提高片段的回收率提高片段的回收率 2.2.清除回收的清除回收的DNADNA样品中的杂质样品中的杂质现在学习的是第45页，共88页（二）（二）从聚丙烯酰胺凝胶中回收从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNADNA片段片段（一）（一）从琼脂糖凝胶中回收从琼脂糖凝胶中回收DNADNA片段片段现在学习的是第46页，共88页1.1.二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基-纤维素膜插片纤维素膜插片电泳法电泳法2.2.电泳洗脱法电泳洗脱法3.3.冷冻挤压法冷冻挤压法4.4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法（一）从琼脂糖凝胶中回收DNA片段现在学习的是第47页，共88页（二）从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段 标准方法是压碎与浸泡法。费时标准方法是压碎与浸泡法。费时但操作简单，是小片段但操作简单，是小片段DNADNA回收的较好回收的较好方法。方法。现在学习的是第48页，共88页第三节第三节 质粒质粒DNADNA的提的提取与纯化取与纯化 现在学习的是第49页，共88页 质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子其大小范围从lkb至200kb以上不等已经在形形色色的细菌类群中发现质粒这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术。现在学习的是第50页，共88页现在学习的是第51页，共88页质粒特性质粒特性1.分子相对小 2.含有高效的自主复制成分 3.不相容性4.转移性5.选择的标记6.限制性内切酶单一切。现在学习的是第52页，共88页现在学习的是第53页，共88页质粒质粒DNADNA的提取和纯化的提取和纯化 1 1细菌的培养细菌的培养 先分离单个菌落，先分离单个菌落，接种到含少量适当接种到含少量适当抗生素的培养基中抗生素的培养基中扩增，随着细菌的扩增，随着细菌的生长，质粒生长，质粒DNADNA也也在自主复制。在自主复制。质粒质粒DNA的小量制备的小量制备2-5ml质粒质粒DNA的大量制备的大量制备500ml现在学习的是第54页，共88页2细菌的收集 细胞生长过程中，排出大量代谢产物，为了提高质粒DNA的纯度，离心弃上清，细菌沉淀最好用STE或生理盐水悬浮，漂洗l-2次，离心管壁上的液体也应该仔细去除干净 现在学习的是第55页，共88页 碱裂解法碱裂解法 煮沸法煮沸法 SDSSDS裂解法裂解法 Triton-Triton-溶菌酶法溶菌酶法 3细菌的裂解方法方法4质粒DNA的提取-适用于大质粒适用于大质粒DNA-不适宜含糖高的菌株如不适宜含糖高的菌株如HB101现在学习的是第56页，共88页二、煮沸裂解法二、煮沸裂解法三、三、SDS裂解法裂解法四、其他方法四、其他方法一、碱裂解法一、碱裂解法五、质粒五、质粒DNADNA的纯化的纯化现在学习的是第57页，共88页一、碱裂解法 在强碱（在强碱（pH12.0pH12.012.612.6）条件下，）条件下，用用SDSSDS破坏细胞壁和裂解细胞，并使细破坏细胞壁和裂解细胞，并使细胞的蛋白质与胞的蛋白质与DNADNA发生变性，释放出质发生变性，释放出质粒粒DNADNA。现在学习的是第58页，共88页 细胞裂解后，细胞壁、细胞膜的碎片、细胞裂解后，细胞壁、细胞膜的碎片、变性的蛋白质和变性的蛋白质和染色体染色体DNADNA形成大的复形成大的复合物合物 当当pHpH调至中性，质粒调至中性，质粒DNADNA重新恢复天然重新恢复天然的超螺旋结构的超螺旋结构 在高盐条件下沉淀，经离心分离，在高盐条件下沉淀，经离心分离，质粒质粒DNADNA保留在上清液中保留在上清液中现在学习的是第59页，共88页现在学习的是第60页，共88页二、煮沸裂解法 将细菌悬浮于含将细菌悬浮于含TritonX-100TritonX-100和溶菌和溶菌酶酶的缓冲液中，的缓冲液中，TritonX-100TritonX-100和溶菌酶能和溶菌酶能破坏细胞壁，再用沸水浴裂解细胞，并使破坏细胞壁，再用沸水浴裂解细胞，并使宿主细胞的蛋白质与宿主细胞的蛋白质与DNADNA变性。变性。现在学习的是第61页，共88页 质粒质粒DNADNA因结构紧密不会解链，当温度因结构紧密不会解链，当温度下降后，可重新恢复其天然超螺旋结下降后，可重新恢复其天然超螺旋结构构 通过离心去除变性的蛋白质和染色体通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA,DNA,然后回收上清液中的质粒然后回收上清液中的质粒DNADNA现在学习的是第62页，共88页三、三、SDSSDS裂解法裂解法 将细菌悬浮于等渗的将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液蔗糖溶液中，用中，用溶菌溶菌酶和酶和EDTAEDTA处理以破坏细胞壁处理以破坏细胞壁 用用SDSSDS裂解去壁细胞，温和释放质粒到等渗裂解去壁细胞，温和释放质粒到等渗液中液中 用酚用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒DNADNA现在学习的是第63页，共88页 由于条件温和，由于条件温和，SDSSDS裂解法裂解法特别适特别适用于用于大质粒大质粒DNADNA（15kb15kb）的提取。但）的提取。但由于部分质粒由于部分质粒DNADNA会与细胞碎片缠绕在会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。一起而丢失，故产率不高。现在学习的是第64页，共88页四、其他方法（二）牙签少量制备法（二）牙签少量制备法(一一)小量一步提取法小量一步提取法现在学习的是第65页，共88页 直接将酚直接将酚/氯仿与细菌培养物混合，然后氯仿与细菌培养物混合，然后离心去除大部分蛋白质和染色体离心去除大部分蛋白质和染色体DNADNA，最后从上清液中回收质粒最后从上清液中回收质粒DNADNA 简单快捷、成本低，提取的质粒可用于限简单快捷、成本低，提取的质粒可用于限制性内切酶图谱分析制性内切酶图谱分析(一)小量一步提取法现在学习的是第66页，共88页（二）牙签少量制备法（二）牙签少量制备法 用牙签直接挑取生长在琼脂用牙签直接挑取生长在琼脂平板上的细平板上的细菌菌落制备质粒菌菌落制备质粒DNADNA 由于制备的质粒由于制备的质粒DNADNA有较多污染，不能用有较多污染，不能用于分子克隆中的酶学反应，但可用于质粒于分子克隆中的酶学反应，但可用于质粒的鉴定的鉴定现在学习的是第67页，共88页五、质粒DNA的纯化.CsCl-EB.CsCl-EB法法.聚乙二醇沉淀法聚乙二醇沉淀法.柱层析法柱层析法现在学习的是第68页，共88页 在过量在过量EBEB存在的条件下，各种不同密度的物存在的条件下，各种不同密度的物质经离心平衡后得以分开。质经离心平衡后得以分开。蛋白质由于密度小而浮于液面蛋白质由于密度小而浮于液面 RNARNA密度大而沉于管底密度大而沉于管底 各种各种DNADNA密度介于蛋白质与密度介于蛋白质与RNARNA之间，处于之间，处于中部中部 EB-CsCl密度梯度离心法现在学习的是第69页，共88页现在学习的是第70页，共88页 不同分子构型的不同分子构型的DNADNA与与EBEB的结合能力不同，的结合能力不同，密度下降也不同，因而可将它们有效分密度下降也不同，因而可将它们有效分离开。离开。染色体染色体DNADNA、开环质粒、开环质粒DNADNA等可嵌入更多的等可嵌入更多的EBEB，因而密度下降较多，因而密度下降较多 闭环质粒闭环质粒DNADNA为超螺旋三级结构，为超螺旋三级结构，EBEB不易不易插入而结合量少，密度下降较少插入而结合量少，密度下降较少 现在学习的是第71页，共88页现在学习的是第72页，共88页第四节第四节 真核细胞真核细胞RNARNA的的分离纯化分离纯化现在学习的是第73页，共88页细胞细胞RNA的含量的含量每个细胞的每个细胞的RNA量约为量约为10-5g80%-85%rRNA10%-15%tRNA1%-5%mRNA其他其他RNA：hnRNA、snRNA、snoRNA现在学习的是第74页，共88页二、酸性异硫氰酸胍二、酸性异硫氰酸胍-酚酚-氯仿一步法氯仿一步法三、商品化试剂单相裂解法三、商品化试剂单相裂解法四、四、mRNAmRNA的分离纯化的分离纯化一、一、RNARNA制备的条件与环境制备的条件与环境现在学习的是第75页，共88页一、RNA制备的条件与环境 RNARNA易被易被RNaseRNase水解，水解，RNaseRNase除细胞内还广泛除细胞内还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中境中 RNaseRNase分子结构中的二硫键使其生物学活性分子结构中的二硫键使其生物学活性非常稳定，去除变性剂后，非常稳定，去除变性剂后，RNaseRNase的活性又的活性又可恢复可恢复现在学习的是第76页，共88页 去除去除RNaseRNase的污染和抑制其活性是的污染和抑制其活性是RNARNA制备成功与否的关键制备成功与否的关键 在总在总RNARNA提取分离的最初阶段，尽可提取分离的最初阶段，尽可能地灭活细胞内能地灭活细胞内RNaseRNase的活性的活性现在学习的是第77页，共88页 选择性地使用选择性地使用RNaseRNase的变性剂的变性剂（如酚、（如酚、氯仿及强烈的胍类变性剂）氯仿及强烈的胍类变性剂）使用使用蛋白酶蛋白酶K K 使用阴离子去污剂如使用阴离子去污剂如SDSSDS、十二烷基十二烷基肌氨酸钠肌氨酸钠或脱氧胆酸钠或脱氧胆酸钠现在学习的是第78页，共88页 联合使用联合使用RNaseRNase的特异抑制剂（如的特异抑制剂（如RNasinRNasin与与DEPCDEPC等）能极大地防止内源性等）能极大地防止内源性RNaseRNase对对RNARNA的降解的降解 加入加入-巯基乙醇、二硫苏糖醇（巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTTDTT）等）等还原剂可以还原还原剂可以还原RNaseRNase中的二硫键，有中的二硫键，有利于利于RNaseRNase的变性、水解与灭活的变性、水解与灭活现在学习的是第79页，共88页二、酸性异硫氰酸胍二、酸性异硫氰酸胍-酚酚-氯仿一步法氯仿一步法 以含异硫氰酸胍、以含异硫氰酸胍、-疏基乙醇和十二烷疏基乙醇和十二烷基肌氨酸钠的基肌氨酸钠的变性溶液变性溶液裂解细胞裂解细胞 在在pH4.0pH4.0的条件下，酚的条件下，酚/氯仿抽提细胞氯仿抽提细胞裂裂解溶液解溶液 通过异丙醇沉淀与通过异丙醇沉淀与75%75%的乙醇洗涤而获得的乙醇洗涤而获得总总RNARNA现在学习的是第80页，共88页 总总RNARNA产量取决于标本的起始量，产量取决于标本的起始量，每每mgmg组织大约能制备组织大约能制备4 47 7g g总总RNARNA，每，每10106 6个细胞大约能制备个细胞大约能制备4 41010g g总总RNARNA。现在学习的是第81页，共88页三、商品化试剂单相裂解法 是异硫氰酸胍是异硫氰酸胍-酚酚-氯仿一步法的改进氯仿一步法的改进方案方案 以以异硫氰酸胍异硫氰酸胍-酚酚的单相裂解液裂解的单相裂解液裂解细胞，再加入细胞，再加入氯仿氯仿后形成两相后形成两相现在学习的是第82页，共88页 变性的变性的DNADNA与蛋白质介于两相的交界面，与蛋白质介于两相的交界面，可使用乙醇和异丙醇分级沉淀出来可使用乙醇和异丙醇分级沉淀出来 保留于上层水相的保留于上层水相的RNARNA，通过异丙醇沉通过异丙醇沉淀与淀与75%75%乙醇洗涤而制备乙醇洗涤而制备现在学习的是第83页，共88页 目前，该法已成为实验室最常用的总目前，该法已成为实验室最常用的总RNARNA提取法，其产量及质量与提取法，其产量及质量与酸性异硫酸性异硫氰酸胍氰酸胍-酚酚-氯仿一步法氯仿一步法相当。相当。现在学习的是第84页，共88页四、mRNA的分离纯化除血红蛋白及组蛋白的除血红蛋白及组蛋白的mRNAmRNA外，绝大多数外，绝大多数mRNAmRNA在其在其3 3 末端带有长短不同的末端带有长短不同的polypoly（A A）尾巴）尾巴 利用碱基配对原则，通过利用碱基配对原则，通过oligooligo（dTdT）-纤维素或纤维素或polypoly（U U）-琼脂糖凝胶的亲和层析，可以很容易地琼脂糖凝胶的亲和层析，可以很容易地从总从总RNARNA制品中分离纯化制品中分离纯化mRNAmRNA现在学习的是第85页，共88页1.oligo1.oligo（dTdT）-纤维素柱层析法纤维素柱层析法2.oligo2.oligo（dTdT）-纤维素柱离心法纤维素柱离心法3.oligo3.oligo（dTdT）-纤维素液相结合离心法纤维素液相结合离心法4.4.磁珠分离法磁珠分离法现在学习的是第86页，共88页5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5+总RNA中的poly(A)+RNA分子退火形成杂交体 5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5链亲和素标记的磁珠+Streptavidin-磁5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin-磁生物素与链亲和素的特异性结合 磁性分离5m7G AAAAAAAAAAAA3 磁铁3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin-磁洗涤与洗脱水相(含纯化的mRNA)固相生物素标记的oligo(dT)磁铁5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin-磁现在学习的是第87页，共88页感谢大家观看感谢大家观看现在学习的是第88页，共88页