植物细胞培养与次生产物制备.ppt

关于植物细胞培养与次生关于植物细胞培养与次生产物制备产物制备现在学习的是第1页，共76页第一节第一节 植物细胞的培养植物细胞的培养植物细胞培养从植物组织培养而来，植物组织培养主植物细胞培养从植物组织培养而来，植物组织培养主要用于形成组织和再生成植株要用于形成组织和再生成植株细胞培养主要生成次生代谢产物细胞培养主要生成次生代谢产物基本技术：基本技术：植物材料的准备植物材料的准备培养基制备培养基制备培养方法的选择培养方法的选择现在学习的是第2页，共76页一、植物细胞的培养特点一、植物细胞的培养特点植物培养细胞四个生长时期特性植物培养细胞四个生长时期特性延迟期：延迟期：细胞数恒定，高细胞数恒定，高RNARNA含量，高蛋白质合成能力；含量，高蛋白质合成能力；加速期：加速期：细胞快速生长期。干重恒定，细胞数、细胞快速生长期。干重恒定，细胞数、DNADNA和蛋和蛋白质浓度增加，有丝分裂活性、白质浓度增加，有丝分裂活性、RNARNA含量和蛋白质合成含量和蛋白质合成能力减少；能力减少；对数期：对数期：介于最大生长率和蛋白质合成完全停止期之介于最大生长率和蛋白质合成完全停止期之间。增加细胞鲜重、干重及间。增加细胞鲜重、干重及RNARNA酶活性，蛋白质合成能酶活性，蛋白质合成能力完全减退；力完全减退；稳定期：稳定期：细胞数稳定。细胞高液泡化，极度脆弱，高度分化细胞数稳定。细胞高液泡化，极度脆弱，高度分化及有机化合物的高浓度。及有机化合物的高浓度。现在学习的是第3页，共76页（1 1）植物细胞有独特的培养时间及特征：重量的增加在）植物细胞有独特的培养时间及特征：重量的增加在对数期，对数期，次生代谢产物在稳定期积累次生代谢产物在稳定期积累（2 2）植物细胞很少单一细胞生长，对数生长后期分泌量蛋）植物细胞很少单一细胞生长，对数生长后期分泌量蛋白和粘多糖，白和粘多糖，以非均相集合的细胞团悬浮生长以非均相集合的细胞团悬浮生长。（3 3）植物细胞好气，培养过程中）植物细胞好气，培养过程中需供气及搅拌需供气及搅拌，但细胞，但细胞壁脆弱，抗剪切能力小，传统的搅拌式反应器极易损壁脆弱，抗剪切能力小，传统的搅拌式反应器极易损伤细胞壁伤细胞壁现在学习的是第4页，共76页二、植物细胞培养基二、植物细胞培养基植物细胞生长代谢特点：植物细胞生长代谢特点：（1 1）需大量无机盐）需大量无机盐（2 2）需多种维生素和植物生长激素）需多种维生素和植物生长激素（3 3）无机氮源，硝酸盐，铵盐为主。）无机氮源，硝酸盐，铵盐为主。（4 4）以蔗糖为碳源）以蔗糖为碳源现在学习的是第5页，共76页常用培养基常用培养基MSMS、N6N6、B6B6、LSLS、RM-1964RM-1964、H H、T T、B5B5、DBMIIDBMII、米勒、米勒、改良怀特、尼许等。改良怀特、尼许等。MSMS培养基培养基是目前应用最多最普遍的培养基。是目前应用最多最普遍的培养基。无机盐的浓度无机盐的浓度较高较高，能保证组织培养生长所需的矿物营养。并且因，能保证组织培养生长所需的矿物营养。并且因为离子浓度高，在配制、贮存、消毒过程中，即使有为离子浓度高，在配制、贮存、消毒过程中，即使有些成分略有出入，也不致影响培养基中的离子平衡些成分略有出入，也不致影响培养基中的离子平衡。现在学习的是第6页，共76页B5B5含有较低的盐离子，这个成分可能对很多培养物的生长含有较低的盐离子，这个成分可能对很多培养物的生长有抑制作用。有抑制作用。WhiteWhite的无机盐含量较低，适于的无机盐含量较低，适于生根培养生根培养。KM-8pKM-8p主要用于原生质体培养，其特点是有机成分较复主要用于原生质体培养，其特点是有机成分较复杂，它包括了几乎所有的单糖和维生素、呼吸代谢中杂，它包括了几乎所有的单糖和维生素、呼吸代谢中的主要有机酸。的主要有机酸。凡是花药培养中常用的培养基，其成分较简单，凡是花药培养中常用的培养基，其成分较简单，且且KN0KN03 3和和(NH)(NH)2 2N0N04 4含高。含高。现在学习的是第7页，共76页（一）无机盐（一）无机盐大量元素：大量元素：氮、磷、钾、钙、镁、硫等氮、磷、钾、钙、镁、硫等微量元素：微量元素：硼、锰、锌、钼、铜、钴、氯等硼、锰、锌、钼、铜、钴、氯等（二）生长因素（二）生长因素 植物生长调节剂植物生长调节剂 植物生长激素：植物生长激素：生长素生长素，细胞分裂素细胞分裂素，赤霉素，赤霉素，脱落酸脱落酸，乙烯。乙烯。借生长激素调控生长分化，以及细胞培养时，获借生长激素调控生长分化，以及细胞培养时，获得最大量的次生代谢产物得最大量的次生代谢产物现在学习的是第8页，共76页u生长素生长素（用来诱导细胞的分裂、愈伤组织形成和根的分（用来诱导细胞的分裂、愈伤组织形成和根的分化）：组织培养中常用的有：化）：组织培养中常用的有：吲哚乙酸吲哚乙酸 (IAA)(IAA)：第一个被发现和人工合成的的激素：第一个被发现和人工合成的的激素二氯本氧乙酸二氯本氧乙酸 (2,4-D)(2,4-D)；萘乙酸；萘乙酸 (NAA)(NAA)；吲哚；吲哚-3-3-丁酸丁酸 (IBA)(IBA)；萘氧乙酸；萘氧乙酸 (NOA)(NOA)；对氯苯氧乙酸；对氯苯氧乙酸 (P-CPA)(P-CPA)NAANAA、IAAIAA、IBAIBA易引起生根，易引起生根，2,4-D2,4-D有利于愈伤组织的有利于愈伤组织的诱导和生长诱导和生长现在学习的是第9页，共76页u细胞分裂素细胞分裂素主要促进细胞分裂和由愈伤组织上或器官上分主要促进细胞分裂和由愈伤组织上或器官上分化不定芽。常用的有：化不定芽。常用的有：6-6-苄基嘌呤苄基嘌呤 (BAP)(BAP)6-6-苄基腺嘌呤苄基腺嘌呤 (6-BA)(6-BA)激动素（呋喃氨基嘌呤、激动素（呋喃氨基嘌呤、KinetinKinetin、KTKT）玉米素玉米素 (zeatin(zeatin、zt)zt)异戊烯氨基嘌呤异戊烯氨基嘌呤 (2-ip)(2-ip)现在学习的是第10页，共76页u植物培养物的生长取决于植物培养物的生长取决于生长素生长素和和分裂素分裂素的比例：的比例：u高浓度生长素和低浓度分裂素高浓度生长素和低浓度分裂素刺激细胞刺激细胞分裂分裂 u低浓度生长素和高浓度分裂素低浓度生长素和高浓度分裂素刺激细胞刺激细胞生长生长（三）诱导子（三）诱导子(elicitor)(elicitor)：刺激植物细胞合成刺激植物细胞合成防御性次生代谢产物防御性次生代谢产物的物质的物质,可以可以通过改变次生代谢途径中催化酶的通过改变次生代谢途径中催化酶的酶活力酶活力,引起代谢通引起代谢通量和反应速率的改变量和反应速率的改变,提高次生代谢产物的产量。提高次生代谢产物的产量。现在学习的是第11页，共76页非生物诱导子非生物诱导子：水杨酸，茉莉酸等：水杨酸，茉莉酸等,稀土及重金稀土及重金 属盐类属盐类生物诱导子生物诱导子：微生物类，如真菌孢子，菌丝体：微生物类，如真菌孢子，菌丝体 真菌培养物滤液等真菌培养物滤液等（四）碳源（四）碳源 细胞培养过程中不进行光合作用，需提供糖做碳细胞培养过程中不进行光合作用，需提供糖做碳源。源。（五）（五）维生素：烟酸，维生素：烟酸，B1B1，B6B6（六）有机物：甘氨酸或水解络蛋白，酵母提取（六）有机物：甘氨酸或水解络蛋白，酵母提取 液等。液等。现在学习的是第12页，共76页三、植物细胞的获得和扩大培养三、植物细胞的获得和扩大培养（一）植物细胞的获得（一）植物细胞的获得l1.1.外植体直接分离外植体直接分离法法:机械切割、组织破碎直接从植物外机械切割、组织破碎直接从植物外植体中分离植体中分离l2.2.愈伤组织分离愈伤组织分离法：从愈伤组织制备小细胞团或单细法：从愈伤组织制备小细胞团或单细胞悬液胞悬液l3.3.原生质体再生原生质体再生法：法：纤维素和果胶酶纤维素和果胶酶混合处理外植体或混合处理外植体或愈伤组织，分离原生质体，再生培养基中培养，原生质愈伤组织，分离原生质体，再生培养基中培养，原生质体细胞壁再生获得植物细胞体细胞壁再生获得植物细胞现在学习的是第13页，共76页（二）植物细胞的培养（二）植物细胞的培养 一、悬浮培养一、悬浮培养二、单细胞培养二、单细胞培养三、植物细胞的规模化培养及有三、植物细胞的规模化培养及有用物质生产用物质生产现在学习的是第14页，共76页一、悬浮培养一、悬浮培养（cell suspension culture）悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游离细悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基进行培养增殖的技术。胞或小细胞团在液体培养基进行培养增殖的技术。现在学习的是第15页，共76页 1、愈伤组织诱导、愈伤组织诱导 要求：松散性好，增殖快，再生能力强。其外观要求：松散性好，增殖快，再生能力强。其外观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松散易一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松散易碎。碎。适于悬浮培养适于悬浮培养 适于再生植株适于再生植株现在学习的是第16页，共76页如何获得符合要求的愈伤组织？如何获得符合要求的愈伤组织？1 1、选择适宜的外植体：胚、胚轴、子叶、选择适宜的外植体：胚、胚轴、子叶 是最常用的外植体，特别是幼胚。是最常用的外植体，特别是幼胚。2 2、选择适宜的培养基：生长素浓度很重要、选择适宜的培养基：生长素浓度很重要 配合一定浓度的细胞分裂素；添加附加物。配合一定浓度的细胞分裂素；添加附加物。3 3、愈伤组织要进行继代选择：选择疏松性、愈伤组织要进行继代选择：选择疏松性 好、细胞状态好的细胞不断继代培养好、细胞状态好的细胞不断继代培养。现在学习的是第17页，共76页悬浮系建立过程：悬浮系建立过程：影响悬浮细胞生长的因素：影响悬浮细胞生长的因素：1、起始愈伤组织的质量起始愈伤组织的质量2、接种细胞密度接种细胞密度3 3、培养条件：方式、温度、培养条件：方式、温度、4、继代周期继代周期2 2、悬浮系的建立与继代培养、悬浮系的建立与继代培养愈伤组织愈伤组织1g愈伤愈伤/10ml培养基培养基150、250ml三角瓶三角瓶（30、70ml培养基）培养基）120rpm,25黑暗培养黑暗培养,换液换液1次次/3d以防粘稠以防粘稠蔗糖梯度离心或过滤法蔗糖梯度离心或过滤法(淘汰过大或生理状态不好的细胞团淘汰过大或生理状态不好的细胞团)继代培养继代培养80rpm（悬浮细胞系稳定以后）（悬浮细胞系稳定以后）继代时间为继代时间为1周时（周时（原悬浮液：新培养基原悬浮液：新培养基=1：4）每次继代都要进行选择，筛选生活力好的细胞继代每次继代都要进行选择，筛选生活力好的细胞继代现在学习的是第18页，共76页成功的悬浮细胞培养体系必须满足成功的悬浮细胞培养体系必须满足3 3个条件：个条件：1、浮悬培养物分散性良好，细胞团较小，一、浮悬培养物分散性良好，细胞团较小，一 般在般在 3050个细胞以下，在实际培养中个细胞以下，在实际培养中 很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。2、均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相、均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相 同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养 基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡 黄色。黄色。3、细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般、细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般 23天甚至更短时间便可增加天甚至更短时间便可增加1倍。倍。现在学习的是第19页，共76页3 3、悬浮细胞生长动态：、悬浮细胞生长动态：基本的悬浮培养体系基本的悬浮培养体系均是将细胞分散在一均是将细胞分散在一定容积的培养液中进定容积的培养液中进行，在一个培养周期行，在一个培养周期不添加培养基。这种不添加培养基。这种培养体系基本是处于培养体系基本是处于封闭状态。当一种营封闭状态。当一种营养物质耗尽时，细胞养物质耗尽时，细胞及停止生长。在这种及停止生长。在这种悬浮培养体系中，细悬浮培养体系中，细胞扩增生长成胞扩增生长成S形曲线形曲线。现在学习的是第20页，共76页 培养周期的概念培养周期的概念 具有一定起始培养密度的单细胞，从开始培养到具有一定起始培养密度的单细胞，从开始培养到细胞数目和总重量增长停止这一过程，称为一个培养细胞数目和总重量增长停止这一过程，称为一个培养周期。周期。现在学习的是第21页，共76页 接种初期的细胞密度过低会使延迟期加长接种初期的细胞密度过低会使延迟期加长，悬浮细胞的起始密度一般在（，悬浮细胞的起始密度一般在（0.52.5）*105个范围内调整。个范围内调整。一般继代培养可降低密度；若在短时间内获得一般继代培养可降低密度；若在短时间内获得大量细胞可提高接种密度。大量细胞可提高接种密度。在实际应用中，还需要确定一些参数：最在实际应用中，还需要确定一些参数：最低起始密度、最大生长速率、每个培养周期所低起始密度、最大生长速率、每个培养周期所经历的天数等。经历的天数等。现在学习的是第22页，共76页4、悬浮细胞培养的同步化、悬浮细胞培养的同步化细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。同时通过细胞周期的某一特定时期。植物细胞在悬浮培养中植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相当困难。的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相当困难。分选法：分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。的细胞继代培养于同一培养体系中。饥饿法：饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。，从而停留在某一分裂时期。现在学习的是第23页，共76页抑制剂法：抑制剂法：通过一些通过一些DNA合成抑制剂处理细合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期后，即可获得处于同一细胞周期G1期的同步期的同步化细胞。化细胞。低温法：低温法：冷处理也可提高培养体系中细胞冷处理也可提高培养体系中细胞 同步化程度。同步化程度。现在学习的是第24页，共76页二二.单细胞的培养单细胞的培养l（1 1）看护培养法看护培养法（nurse culture）：在单细胞的生长环：在单细胞的生长环境里加入愈伤组织同时培养。境里加入愈伤组织同时培养。愈伤组织提供促细胞分裂的物愈伤组织提供促细胞分裂的物质等，传递生物信息，使持续质等，传递生物信息，使持续分裂增值等。分裂增值等。即愈伤组织看护单细胞即愈伤组织看护单细胞现在学习的是第25页，共76页（2 2）微室培养法微室培养法：单细胞接种到小室里，密封培养，：单细胞接种到小室里，密封培养，观测单细胞的生长发育情况观测单细胞的生长发育情况（3 3）平板培养法平板培养法：单细胞接种于固体培养基上，获得单细：单细胞接种于固体培养基上，获得单细胞形成的细胞系胞形成的细胞系（4 4）条件培养法条件培养法：接种于条件培养基上形成的细胞系。：接种于条件培养基上形成的细胞系。条件培养基指培养过细胞的培养基上清，有植物生长条件培养基指培养过细胞的培养基上清，有植物生长激素等残留，用于制备成固体培养基。激素等残留，用于制备成固体培养基。现在学习的是第26页，共76页二二.单倍体细胞的培养单倍体细胞的培养（花药培养）：指将植物单倍体细胞培（花药培养）：指将植物单倍体细胞培养成单倍体植株或纯和二倍体植株养成单倍体植株或纯和二倍体植株l一般采取花药作为单倍体细胞的培养对象一般采取花药作为单倍体细胞的培养对象l用花粉在固体培养基上培养用花粉在固体培养基上培养现在学习的是第27页，共76页三三.愈伤组织培养愈伤组织培养l愈伤组织既是组织又是细胞，为脱分化细胞，具再分愈伤组织既是组织又是细胞，为脱分化细胞，具再分化的能力，可用于次生代谢物的生产，也可再生为植化的能力，可用于次生代谢物的生产，也可再生为植株。株。现在学习的是第28页，共76页四四.毛状根诱导和培养毛状根诱导和培养l一些次生代谢产物只有在根里生长一些次生代谢产物只有在根里生长l发根农杆菌感染双子夜植物，发根农杆菌感染双子夜植物，RIRI质粒诱导产生毛状根。质粒诱导产生毛状根。l形态方面：形态方面：RiRi质粒诱导快速生长的、非定向性、高分质粒诱导快速生长的、非定向性、高分支的毛状根的形成支的毛状根的形成l代谢方面：代谢方面：RiRi质粒转化根能合成与原植物相同或相似的次质粒转化根能合成与原植物相同或相似的次生代谢物，并且发根合成次生代谢物具有遗传稳定性。生代谢物，并且发根合成次生代谢物具有遗传稳定性。现在学习的是第29页，共76页毛状根生长快速和次级代谢产物含量高，特别适用于毛状根生长快速和次级代谢产物含量高，特别适用于从木本植物和难于培养的植物中得到较高含量的次级从木本植物和难于培养的植物中得到较高含量的次级代谢产物。代谢产物。毛状根具有如下特点：毛状根具有如下特点：激素自养激素自养，不必加外源激素；，不必加外源激素；次级代谢产物含量次级代谢产物含量高高且且稳定稳定；增殖速度增殖速度快快。现在学习的是第30页，共76页用用发根农杆菌经发根农杆菌经直接注射法，外植体接种感染，原生质体直接注射法，外植体接种感染，原生质体共培养法诱导毛状根共培养法诱导毛状根发根农杆菌转化后，经筛选鉴定发根农杆菌转化后，经筛选鉴定低盐浓度下生长，培养低盐浓度下生长，培养现在学习的是第31页，共76页植物细胞培养工业化存在的问题植物细胞培养工业化存在的问题l生长缓慢生长缓慢,通常完成一次生产周期需通常完成一次生产周期需4-54-5周周l次级代谢物含量低次级代谢物含量低l培养细胞不稳定等培养细胞不稳定等l多数产物积累于胞内多数产物积累于胞内l不耐受剪切力不耐受剪切力l一般的说，只有当次级代谢产物的价格高于一般的说，只有当次级代谢产物的价格高于10001000美元美元/kg/kg时，才考虑采用植物细胞培养方法。时，才考虑采用植物细胞培养方法。现在学习的是第32页，共76页植物细胞易聚集化，比较脆弱，代谢途径和代谢产物植物细胞易聚集化，比较脆弱，代谢途径和代谢产物累积与细胞生长关系的复杂性，选择合适的培养方法累积与细胞生长关系的复杂性，选择合适的培养方法和反应器影像产物产量和反应器影像产物产量细胞培养周期长，次生代谢产物含量相对较低，提取困难，细胞培养周期长，次生代谢产物含量相对较低，提取困难，生物反应器技术还有待深入生物反应器技术还有待深入三、植物细胞培养的大规模培养-生物反应器现在学习的是第33页，共76页根据通气和搅拌系统的类型可将生物反应器分类：根据通气和搅拌系统的类型可将生物反应器分类：l摇瓶：气体和营养成分的均匀分布可将通过机械的简单振摇摇瓶：气体和营养成分的均匀分布可将通过机械的简单振摇而实现搅拌目的。而实现搅拌目的。l搅拌型生物反应器搅拌型生物反应器l 优点：主要体现在不同搅拌器的灵活应用，有利于培养优点：主要体现在不同搅拌器的灵活应用，有利于培养物的高度混合。物的高度混合。l 缺点：高耗能以及由于细胞对剪切力的高度敏感所致的种缺点：高耗能以及由于细胞对剪切力的高度敏感所致的种种缺陷种缺陷l环流生物反应器鼓泡生物反应器环流生物反应器鼓泡生物反应器 外部循环水或压缩空气作为能量输入外部循环水或压缩空气作为能量输入现在学习的是第34页，共76页大规模培养要综合考虑以下因素：l供氧能力及气泡分散程度供氧能力及气泡分散程度l剪切力大小及对细胞的影响剪切力大小及对细胞的影响l高密度培养对培养液的混和程度高密度培养对培养液的混和程度l温度，温度，pHpH及营养物浓度的控制能力及营养物浓度的控制能力l细胞团大小的控制能力细胞团大小的控制能力易于放大易于放大现在学习的是第35页，共76页植物细胞培养反应器 植物细胞培养用的反应器主要有植物细胞培养用的反应器主要有机械式搅拌生物反应器、鼓泡塔与气升式生物反应器、填充机械式搅拌生物反应器、鼓泡塔与气升式生物反应器、填充床式生物反应器、流化床生物反应器和膜式生物反应器床式生物反应器、流化床生物反应器和膜式生物反应器等。等。1、机械式搅拌生物反应器机械式搅拌生物反应器2、鼓泡塔与气升式生物反应器鼓泡塔与气升式生物反应器3、填充床生物反应器、填充床生物反应器 考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免，同时搅拌器转动的中轴往难以避免，同时搅拌器转动的中轴往往是容易使培养物污染的部位，因此往是容易使培养物污染的部位，因此，发展出空气提升式生物反应器，但，发展出空气提升式生物反应器，但其缺点是搅拌不均匀。其缺点是搅拌不均匀。现在学习的是第36页，共76页在填充床生物反应器中，细胞可以位于支撑物在填充床生物反应器中，细胞可以位于支撑物表面，也可以包埋于支撑物之中，培养液可以表面，也可以包埋于支撑物之中，培养液可以流经支撑物颗粒，不断被细胞所利用。填充床流经支撑物颗粒，不断被细胞所利用。填充床生物反应器已被用于植物细胞的培养生物反应器已被用于植物细胞的培养。（a）（b）出口出口出口出口进口进口进口进口填充床生物反应器填充床生物反应器流化床生物反应器流化床生物反应器 填充床生物反应器的优点在于单位体积固定细胞量大，但是填充床反应器还存在许多缺点，它的混合效果低，对必要的氧传递、PH、温度控制和气体产物的排除造成了困难，影响了细胞的培养，同时大颗粒的低效率传质、填充体成分供应和排除的困难，限制了填充床反应器应用于不要求细胞活性的生物转化。现在学习的是第37页，共76页2、流化床生物反应器、流化床生物反应器 典型的流化床生物反应器是利用流体的典型的流化床生物反应器是利用流体的能量来悬浮颗粒的。由于使颗粒呈流化状态能量来悬浮颗粒的。由于使颗粒呈流化状态所需的能量与颗粒大小成正比，因此，通常所需的能量与颗粒大小成正比，因此，通常采用小固定化颗粒，这些小颗粒良好的传质采用小固定化颗粒，这些小颗粒良好的传质特性是流化床反应器的主要优点。流化床生特性是流化床反应器的主要优点。流化床生物反应器的最大缺点是剪切和颗粒碰撞会损物反应器的最大缺点是剪切和颗粒碰撞会损坏固定化细胞坏固定化细胞。（a）（b）出口出口出口出口进口进口进口进口填充床生物反应器填充床生物反应器流化床生物反应器流化床生物反应器现在学习的是第38页，共76页3、膜生物反应器、膜生物反应器 在植物细胞培养过程中，在植物细胞培养过程中，主要采用的是中空纤维和螺线式卷绕反应器。如下图所示。膜主要采用的是中空纤维和螺线式卷绕反应器。如下图所示。膜反应器的优点是可以重复使用，因此，尽管投资较大，仍较经济。另外，由于植物细胞代反应器的优点是可以重复使用，因此，尽管投资较大，仍较经济。另外，由于植物细胞代谢不像微生物那样旺盛，因而可以采用更厚的细胞层。谢不像微生物那样旺盛，因而可以采用更厚的细胞层。细胞细胞细胞细胞营养物入口营养物入口营养物入口营养物入口营养物出口营养物出口营养物出口营养物出口营养物质营养物质图图12-5 固定化细胞膜反应器固定化细胞膜反应器a-中空纤维反应器中空纤维反应器b-螺线式卷绕反应器螺线式卷绕反应器现在学习的是第39页，共76页现在学习的是第40页，共76页各种生物反应器性能比较各种生物反应器性能比较l不同类型的生物反应器各有其优缺点，而改进的搅拌不同类型的生物反应器各有其优缺点，而改进的搅拌式生物反应器和气升式反应器可能更适合植物细胞的式生物反应器和气升式反应器可能更适合植物细胞的培养。培养。l一般来说，悬浮培养的细胞在干重不大于一般来说，悬浮培养的细胞在干重不大于20g/L20g/L时，时，以气升式反应器为宜，而当干重超过以气升式反应器为宜，而当干重超过20g/L20g/L时，则改时，则改进的搅拌式生物反应器优于其它类型的反应器进的搅拌式生物反应器优于其它类型的反应器现在学习的是第41页，共76页我国发明的我国发明的“气升内错流气升内错流”式植物细胞培养反应器，能够式植物细胞培养反应器，能够适应植物细胞培养周期长，培养液随培养进程而蒸发减少的适应植物细胞培养周期长，培养液随培养进程而蒸发减少的生物反应过程；可抑制气泡的聚合，减弱气泡在液面破裂时生物反应过程；可抑制气泡的聚合，减弱气泡在液面破裂时产生的冲击力对细胞的损伤；可提高降液区气含率，消除降产生的冲击力对细胞的损伤；可提高降液区气含率，消除降液区缺氧现象，并强化混合与氧传递，大大降低反应器高度。液区缺氧现象，并强化混合与氧传递，大大降低反应器高度。使用这种反应器培养新疆紫草细胞，培养结束时细胞使用这种反应器培养新疆紫草细胞，培养结束时细胞量达到量达到12gdw12gdwL L，紫草宁含量达到了细胞干重的，紫草宁含量达到了细胞干重的1010，是天然植株含量的是天然植株含量的2 28 8倍倍 现在学习的是第42页，共76页第二节 影响植物次级代谢产物累积的因素 l因素主要有：因素主要有：l1 1、生物条件：外植体、季节、休眠、分化等；、生物条件：外植体、季节、休眠、分化等；l2 2、物理条件：温度、光（光照时间、光强、光质）、通、物理条件：温度、光（光照时间、光强、光质）、通气（氧气）、酸度和渗透压；气（氧气）、酸度和渗透压；l3 3、化学条件：无机盐、碳源、物质生长调节剂、维生素、化学条件：无机盐、碳源、物质生长调节剂、维生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物质和前体等；氨基酸、核酸、抗生素、天然物质和前体等；l4 4、工业培养条件：培养罐类型、通气、搅拌和培养方、工业培养条件：培养罐类型、通气、搅拌和培养方式。式。现在学习的是第43页，共76页一、外植体的选择一、外植体的选择 在生长曲线的不同时期，累积不同的产物。在生长曲线的不同时期，累积不同的产物。现在学习的是第44页，共76页l二、培养条件的影响二、培养条件的影响 营养成分、生物及非生物元素、酸度、营养成分、生物及非生物元素、酸度、通气以混合程度、与接种有关的因素以通气以混合程度、与接种有关的因素以及剪切力、搅拌频率、温度和光。及剪切力、搅拌频率、温度和光。现在学习的是第45页，共76页l1、内在因素、内在因素（1）、接种和诱导）、接种和诱导外植体的大小直接影响所诱导的组织和细外植体的大小直接影响所诱导的组织和细胞的生长，而且也关系到其次级代谢产物胞的生长，而且也关系到其次级代谢产物的生产能力。外植体的前处理也可严重影的生产能力。外植体的前处理也可严重影响次级代谢产物的累积方式。响次级代谢产物的累积方式。（2）、培养基的组成，基本培养基的各种成）、培养基的组成，基本培养基的各种成分是愈伤组织和悬浮细胞培养的物质基础。分是愈伤组织和悬浮细胞培养的物质基础。现在学习的是第46页，共76页磷，低磷会导致次级代谢产物的累积，缺乏磷会导致生物磷，低磷会导致次级代谢产物的累积，缺乏磷会导致生物量的大幅度降低。量的大幅度降低。氮，硝酸盐和铵盐；还有某些需要特殊的有机氮源。如天氮，硝酸盐和铵盐；还有某些需要特殊的有机氮源。如天冬氨酸、尿素、酪蛋白水解物或蛋白胨。冬氨酸、尿素、酪蛋白水解物或蛋白胨。铜，作为邻及对铜，作为邻及对-二酚可抗坏血酸氧化酶活性基团的作用，是次二酚可抗坏血酸氧化酶活性基团的作用，是次级代谢产物累计的必要元素，还可作为非生物诱导子。级代谢产物累计的必要元素，还可作为非生物诱导子。碳源，自养培养的二氧化碳和异养培养的糖类，性质和数量往碳源，自养培养的二氧化碳和异养培养的糖类，性质和数量往往对培养细胞的生物量有很大的影响。往对培养细胞的生物量有很大的影响。现在学习的是第47页，共76页糖类对次级代谢产物的影响主要取决于所使用的糖类的种糖类对次级代谢产物的影响主要取决于所使用的糖类的种类和浓度及细胞次级代谢产物的生物合成过程，还可增类和浓度及细胞次级代谢产物的生物合成过程，还可增强生物碱起始合成酶的活性和增加相关强生物碱起始合成酶的活性和增加相关mRNA的浓度。的浓度。糖的作用有：延长稳定期；通过蔗糖分解后的产物（葡糖的作用有：延长稳定期；通过蔗糖分解后的产物（葡萄糖）所产生的对内源性生长素合成的抑制作用；增萄糖）所产生的对内源性生长素合成的抑制作用；增强戊糖磷酸化途径有关酶的活性。强戊糖磷酸化途径有关酶的活性。现在学习的是第48页，共76页l（3）、植物生长调节剂）、植物生长调节剂非常重要的作用，这种作用有时可能是关键性非常重要的作用，这种作用有时可能是关键性的。的。不同的植物激素及其不同的组成形式均可显著不同的植物激素及其不同的组成形式均可显著影响代谢产物的产生。影响代谢产物的产生。由于材料生理状态的差异，其作用也有很大的由于材料生理状态的差异，其作用也有很大的不同。不同。现在学习的是第49页，共76页l（4）、氧气和酸度）、氧气和酸度氧气，悬浮细胞和固定化细胞供氧方式有所不氧气，悬浮细胞和固定化细胞供氧方式有所不同，前者可采用通气和搅拌，转速过快会导致同，前者可采用通气和搅拌，转速过快会导致细胞破裂，后者只能采用通气方式。细胞破裂，后者只能采用通气方式。酸度，有利于细胞培养的酸度在酸度，有利于细胞培养的酸度在5-6之间，培之间，培养基在细胞生长过程中会变酸或变碱。养基在细胞生长过程中会变酸或变碱。现在学习的是第50页，共76页l（5 5）、渗出物）、渗出物在细胞悬浮培养的后期，培养液中含有多种在细胞悬浮培养的后期，培养液中含有多种细胞代谢的初级和次级产物。细胞代谢的初级和次级产物。现在学习的是第51页，共76页l2、两步培养法、两步培养法第一步使用适合细胞生长的培养基，营养丰第一步使用适合细胞生长的培养基，营养丰富；第二步使用适于次级代谢产物合成的培富；第二步使用适于次级代谢产物合成的培养基，较低含量的硝酸盐和磷酸盐，并含有养基，较低含量的硝酸盐和磷酸盐，并含有较低的糖分或少量的碳源。较低的糖分或少量的碳源。现在学习的是第52页，共76页l3、诱导子、诱导子植物抗毒素是在植物防御系统内能对抗微生物进攻的某些次植物抗毒素是在植物防御系统内能对抗微生物进攻的某些次级代谢产物，有些时候连续合成，有些时候在被次级下才会级代谢产物，有些时候连续合成，有些时候在被次级下才会产生抗毒素，或仅在被诱导下其产量才能增加。触发形成植产生抗毒素，或仅在被诱导下其产量才能增加。触发形成植物抗毒素信号的物质称为诱导子，能够诱导植物细胞中的一物抗毒素信号的物质称为诱导子，能够诱导植物细胞中的一个反应，并能形成特征性自身防御反应的分子。两种分类，个反应，并能形成特征性自身防御反应的分子。两种分类，一种是根据在细胞内或细胞外形成而将其分为内源性诱导子一种是根据在细胞内或细胞外形成而将其分为内源性诱导子和外源性诱导子；另一种是根据其来源分为生物诱导子和非和外源性诱导子；另一种是根据其来源分为生物诱导子和非生物诱导子。生物诱导子是指植物体在防御过程中为对抗微生物诱导子。生物诱导子是指植物体在防御过程中为对抗微生物感染而产生的物质，包括分生孢子、降解细胞壁的酶类、生物感染而产生的物质，包括分生孢子、降解细胞壁的酶类、细胞壁碎片、有机体产生的代谢物。非生物诱导子所有不是细胞壁碎片、有机体产生的代谢物。非生物诱导子所有不是植物细胞中天然成分但又能触发植物细胞形成抗毒素信号的植物细胞中天然成分但又能触发植物细胞形成抗毒素信号的物质。物质。现在学习的是第53页，共76页l4、培养环境的外部因素、培养环境的外部因素（1）、温度，次级代谢产物的最佳产生温度是）、温度，次级代谢产物的最佳产生温度是20-28度，低温时细胞不再生长，产物不合成。度，低温时细胞不再生长，产物不合成。温度的变化可引起产物类型在质和量上的改变。温度的变化可引起产物类型在质和量上的改变。（2）、搅拌频率，具体表现在发酵液中的溶氧浓）、搅拌频率，具体表现在发酵液中的溶氧浓度和机械搅拌对细胞所产生的剪切力上。度和机械搅拌对细胞所产生的剪切力上。（3）、培养容器的影响，因为容器的大小和搅拌）、培养容器的影响，因为容器的大小和搅拌装置的不同会产生不同的次级代谢产物。装置的不同会产生不同的次级代谢产物。现在学习的是第54页，共76页（4）、光的影响，光照时间的长短、光质、光）、光的影响，光照时间的长短、光质、光强对次级代谢产物的累积有一定的作用。光对强对次级代谢产物的累积有一定的作用。光对植物培养细胞的影响主要表现在：特殊波长的植物培养细胞的影响主要表现在：特殊波长的短波脉冲仅仅启动细胞的形态分化和生化过程，短波脉冲仅仅启动细胞的形态分化和生化过程，而连续光照则可以保持光的反应潜能或反应状而连续光照则可以保持光的反应潜能或反应状态。植物光照和激素具有协同作用或对抗作用。态。植物光照和激素具有协同作用或对抗作用。现在学习的是第55页，共76页第三节 培养方法的进展与展望l20世纪世纪90年代以来，对于植物年代以来，对于植物细胞及其代谢产物的研究进入细胞及其代谢产物的研究进入了新的发展时期，并出现了很了新的发展时期，并出现了很多新技术和新方法，比如诱导多新技术和新方法，比如诱导子、前体饲养、两相培养法、子、前体饲养、两相培养法、质体转化、毛状根和冠瘿瘤组质体转化、毛状根和冠瘿瘤组织培养等，显示了植物细胞培织培养等，显示了植物细胞培养工程制药的广阔发展前景。养工程制药的广阔发展前景。现在学习的是第56页，共76页l一、诱导子一、诱导子在植物细胞培养中加入诱导子可以提高次在植物细胞培养中加入诱导子可以提高次级代谢产物的产量，并可促进产物分泌到级代谢产物的产量，并可促进产物分泌到培养基中。培养基中。诱导子的作用随诱导子的种类的不同而异，诱导子的作用随诱导子的种类的不同而异，研究显示，诱导子的最佳加入时间为细胞研究显示，诱导子的最佳加入时间为细胞对数的生长期。对数的生长期。现在学习的是第57页，共76页l二、前体饲喂二、前体饲喂 是增加次级代谢产物产率的重要方法，次级是增加次级代谢产物产率的重要方法，次级代谢产物的合成依赖于代谢产物的合成依赖于3中主要原材料的供应，中主要原材料的供应，莽草酸是芳香氨基酸、肉桂酸和某些多酚化合莽草酸是芳香氨基酸、肉桂酸和某些多酚化合物的前体；氨基酸，形成生物碱及肽类抗生素；物的前体；氨基酸，形成生物碱及肽类抗生素；乙酸，是聚乙炔类、前列腺素类、大环抗生素，乙酸，是聚乙炔类、前列腺素类、大环抗生素，多酚类，类异戊二烯等的前体。多酚类，类异戊二烯等的前体。现在学习的是第58页，共76页l三、两相培养法三、两相培养法出发点是在细胞外创造一个次级代谢产物的储出发点是在细胞外创造一个次级代谢产物的储存单元。可加入固相或疏水液相，形成两相培存单元。可加入固相或疏水液相，形成两相培养体系，从而达到收集分泌产物的目的。可减养体系，从而达到收集分泌产物的目的。可减轻产物本身对细胞代谢的抑制作用，并可保护轻产物本身对细胞代谢的抑制作用，并可保护产物免受培养基中催化酶或酸对产物的影响。产物免受培养基中催化酶或酸对产物的影响。可简化下游处理过程，降低生产成本。可简化下游处理过程，降低生产成本。现在学习的是第59页，共76页l两相培养系统需满足下列条件：两相培养系统需满足下列条件：l添加的固相或液相对细胞无毒害作用，不影添加的固相或液相对细胞无毒害作用，不影响细胞生长和产物合成；响细胞生长和产物合成；l产物易被固相吸附或被有机相溶解；产物易被固相吸附或被有机相溶解；l两相易分离；两相易分离；如为固相不吸附培养基中的添加成分，植物如为固相不吸附培养基中的添加成分，植物生长调节剂或有机成分。生长调节剂或有机成分。现在学习的是第60页，共76页l四、毛状根和冠瘿瘤培养四、毛状根和冠瘿瘤培养 现在学习的是第61页，共76页l双子叶植物病原菌根瘤农杆菌和发根农杆菌的双子叶植物病原菌根瘤农杆菌和发根农杆菌的原生质体中分别含有原生质体中分别含有Ti和和Ri质粒，大小约质粒，大小约200kb.植物遭感染后，农杆