微生物细胞的破碎技术.ppt

微生物细胞的破碎技术现在学习的是第1页，共32页 胞外产品：各种胞外酶、胞外多糖、细胞代谢物胞外产品：各种胞外酶、胞外多糖、细胞代谢物细胞本身：细胞本身：单细胞蛋白（单细胞蛋白（SCP）胞内产品胞内产品:碱性磷酸酯酶，基因工程产物，植物细胞产物等碱性磷酸酯酶，基因工程产物，植物细胞产物等1.微生物细胞的破碎技术概述微生物细胞的破碎技术概述现在学习的是第2页，共32页2.细胞壁的组成和破碎阻力细胞壁的组成和破碎阻力细菌细菌：肽聚糖，多糖，磷壁酸，主要阻力来自于肽聚糖的网状结构。酵母菌：酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质，主要阻力来自于壁结构交联的紧密程度和厚度。丝状真菌：丝状真菌：多糖，蛋白质，脂类，葡聚糖，几丁质，主要阻力来自于壁强度和聚合物网状结构。现在学习的是第3页，共32页现在学习的是第4页，共32页现在学习的是第5页，共32页现在学习的是第6页，共32页现在学习的是第7页，共32页各种微生物细胞壁的结构与组成各种微生物细胞壁的结构与组成 现在学习的是第8页，共32页3.微生物细胞的破碎技术微生物细胞的破碎技术 现在学习的是第9页，共32页高压匀浆法高压匀浆法高压匀浆器 采用高压匀浆器是大规模破碎细胞的常用方法，利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环造成细胞破裂现在学习的是第10页，共32页高压匀浆法特点 破碎率较高 适合大规模细胞破碎 碎片细小，胞内物质释放完全 适合格兰氏阳性菌和酵母的破碎;不适合霉菌,因为容易造成堵塞;对革兰氏阳性菌破碎效果较差现在学习的是第11页，共32页影响因素 操作压力（5070MPa）细胞浓度（20）温度 循环次数(25)现在学习的是第12页，共32页高压匀浆器高压匀浆器现在学习的是第13页，共32页现在学习的是第14页，共32页珠磨法珠磨法 珠磨法是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使达到细胞的某种程度破碎。这些装置的主要缺点是在破碎期间样品温度迅速升高，通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分解决。现在学习的是第15页，共32页高速珠磨机高速珠磨机现在学习的是第16页，共32页珠磨法特点 破碎率较高 适合大规模细胞破碎 碎片较小，胞内物质释放完全 温度容易急剧上升，需要良好的降温配套设备 相对与酵母和细菌，珠磨法更适合真菌菌丝和藻类现在学习的是第17页，共32页影响细胞破碎的因素影响细胞破碎的因素 搅拌速度（7001450r/min）料液的循环速度（50500L/h）细胞浓度（0.30.5g/mL）珠粒大小和填充量（0.451mm；7090)现在学习的是第18页，共32页超声波法超声波法细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产生细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。影响因素影响因素:功率、发射时间、次数、细胞悬浮液体功率、发射时间、次数、细胞悬浮液体积积对于不同菌种的发酵液、超声波处理的效果不同对于不同菌种的发酵液、超声波处理的效果不同，杆菌比球菌易破碎杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌细胞比革兰氏革兰氏阴性菌细胞比革兰氏阳性菌细胞容易破碎阳性菌细胞容易破碎，对酵母菌的效果极差。，对酵母菌的效果极差。该法不适于大规模操作，因为放大后，要输入该法不适于大规模操作，因为放大后，要输入很高的能量来提供必要的冷却，这是困难的。很高的能量来提供必要的冷却，这是困难的。现在学习的是第19页，共32页电声超声波发生器电声超声波发生器现在学习的是第20页，共32页 化学法 现在学习的是第21页，共32页 化学法 采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学。常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试剂试剂酸酸使蛋白质水解成氨基酸，通常采用使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。碱和表面活。碱和表面活性剂能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来性剂能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。常用表面活性剂有。常用表面活性剂有胆酸盐胆酸盐、磷脂、磷脂、SDS、CTAB、有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 现在学习的是第22页，共32页化学法化学法优点：对产物的释出选择性好，细胞外形较完整，碎片少，核优点：对产物的释出选择性好，细胞外形较完整，碎片少，核酸等胞内杂质释放少，便于后步分离、不需要专门设备等优点酸等胞内杂质释放少，便于后步分离、不需要专门设备等优点，故使用较多。，故使用较多。缺点：易导致活性物质破坏、化学试剂的加入，常会给随后产物缺点：易导致活性物质破坏、化学试剂的加入，常会给随后产物的纯化带来困难的纯化带来困难总结：总结：酸碱容易造成产物水解或变性，慎用；酸碱容易造成产物水解或变性，慎用；表面活性剂以及表面活性剂以及丁酯、丁醇、丙酮等有机溶剂丁酯、丁醇、丙酮等有机溶剂适合于绝大适合于绝大部分非蛋白类的物质；部分非蛋白类的物质；现在学习的是第23页，共32页 酶解法酶解法利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁的目的。，从而达到破壁的目的。优点：专一性强，发生酶解的条件温和。优点：专一性强，发生酶解的条件温和。缺点：酶水解费用较贵，一般只适用于小规缺点：酶水解费用较贵，一般只适用于小规模的实验室研究。模的实验室研究。溶菌酶是应用最多的酶，它能专一地分解溶菌酶是应用最多的酶，它能专一地分解细胞壁上糖蛋白分子的细胞壁上糖蛋白分子的-1，4糖苷键，使脂糖苷键，使脂多糖解离，经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶多糖解离，经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中使细胞破裂。液中使细胞破裂。现在学习的是第24页，共32页渗透压冲击渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的介质中压的介质中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液如一定浓度的甘油或蔗糖溶液)，达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细，达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌，或渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成受抑制而强度者细胞壁预先用酶处理，或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。减弱时才是合适的。现在学习的是第25页，共32页冻结冻结-融化法融化法将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，反复多次而达到破壁作用。反复多次而达到破壁作用。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。但通常破碎率很低即使反复循环多次也不能但通常破碎率很低即使反复循环多次也不能提高收率。另外，还可能引起对冻融敏感的提高收率。另外，还可能引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。某些蛋白质的变性。现在学习的是第26页，共32页干燥法干燥法可采用空气干燥，真空干燥，喷雾干燥和可采用空气干燥，真空干燥，喷雾干燥和冷冻干燥等。冷冻干燥等。空气干燥主要适用于酵母菌。真空干燥适空气干燥主要适用于酵母菌。真空干燥适用于细菌的干燥。冷冻干燥适用于较不稳用于细菌的干燥。冷冻干燥适用于较不稳定的生化物质。定的生化物质。干燥法条件变化较剧烈，容易引起蛋白质干燥法条件变化较剧烈，容易引起蛋白质或其它组织变性。或其它组织变性。现在学习的是第27页，共32页机械破碎法与非机械法比较机械破碎法与非机械法比较 现在学习的是第28页，共32页4 破碎方法的选择破碎方法的选择 细胞的量 破碎条件目标产物对破碎条件的敏感性 破碎目标待破碎细胞的机械强度现在学习的是第29页，共32页破碎率的测定破碎率的测定 1.直接测定法直接测定法2.测定释放的蛋白质量或酶的活力或相对电导率测定释放的蛋白质量或酶的活力或相对电导率现在学习的是第30页，共32页破碎技术的新进展破碎技术的新进展多种破碎方法相结合：冻融法与匀浆法结合破碎酵多种破碎方法相结合：冻融法与匀浆法结合破碎酵母，有效提高破碎率母，有效提高破碎率与上游过程相结合：利用病毒进行裂解溶胞与上游过程相结合：利用病毒进行裂解溶胞将细胞破碎与后续分离结合：珠磨法与双水相萃将细胞破碎与后续分离结合：珠磨法与双水相萃取取现在学习的是第31页，共32页5.5.基因工程表达产物的后处理基因工程表达产物的后处理 包含体的分离与复性包含体的分离与复性 什么是包含体 外源蛋白质基因在受体菌中表达时形成的没外源蛋白质基因在受体菌中表达时形成的没有活性的蛋白质聚集体称为包含体有活性的蛋白质聚集体称为包含体。包含体内包含体内除目标蛋白外还有微量的质粒，除目标蛋白外还有微量的质粒，rRNA和和RNA聚合聚合酶。酶。包含体蛋白的一级结构是正确的，但空间折叠错误，故没有生物活性。现在学习的是第32页，共32页