基因工程的主要操作技术及原理讲稿.ppt

基因工程的主要操作技术及原理第一页，讲稿共七十九页哦DNADNA提取提取n 4 4、质粒、质粒DNADNA提取提取第二页，讲稿共七十九页哦总总DNADNA提取提取第三页，讲稿共七十九页哦在在DNADNA提取过程中应做到提取过程中应做到第四页，讲稿共七十九页哦1 1、植物细胞总、植物细胞总DNADNA提取提取第五页，讲稿共七十九页哦（1 1）CTABCTAB法：法：CTAB(cetyltriethyl ammonium CTAB(cetyltriethyl ammonium bromide)(bromide)(十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵)第六页，讲稿共七十九页哦高盐提取高盐提取-低盐沉淀低盐沉淀-高盐溶解高盐溶解-乙醇沉淀乙醇沉淀第七页，讲稿共七十九页哦操作步骤操作步骤o1、取幼嫩的植物叶片（3-5g）剪碎液氮研磨成粉，转入1.5ml离心管内。加入等体积的65预热的DNA提取缓冲液置于65的恒温水浴摇床上1-2h(1.5h)。o2、加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻上下颠倒5分钟，静置5分钟，之后于12000rpm离心10分钟。3、吸取上层水相，重复步骤2一次。o4、吸取上层水相，加入预冷2/3体积的异丙醇，轻缓颠倒2分钟并置-20冰箱内10min，待DNA沉淀后于12000rpm离心收集，收集的DNA于70%乙醇中洗2-3次。将弃去乙醇风干后的DNA加适量水使其溶解。第八页，讲稿共七十九页哦o5、待DNA完全溶解后加入1-2l不含RNAaseA（10mg/ml），37保温1h以除去DNA中的RNA。6、于Eppendorf管中加入1mL氯仿：异戊醇（24：1）轻轻上下颠倒10分钟后10000rpm离心10分钟。o 7、吸取上层水相并先后加入1/10体积的3M醋酸钠及2倍总体积的预冷的无水乙醇，接着置于-20冰箱，10分钟后10000rpm离心10分钟，弃去无水乙醇，加入70乙醇洗涤2-3次，风干，最后将DNA溶于适量（200-500l）TE中。o8、待DNA完全溶解后进行1%琼脂糖凝胶电泳，检查DNA的质量并据已知的DNA 分子量标准估计其浓度。调整浓度后的DNA置于-20备用。第九页，讲稿共七十九页哦CTABCTAB法的优点法的优点第十页，讲稿共七十九页哦(2)SDS(2)SDS法法 第十一页，讲稿共七十九页哦操作步骤操作步骤o1.将1g植物材料于液氮速冻，然后在研钵中将其磨碎，将粉末转至2 ml离心管中。o2.加入1.2ml预热至65的提取缓冲液(3V)，轻缓振荡混匀，加入120l 20%SDS(达到终浓度2%)，混匀，置65水浴中放置30分钟，不时颠倒混匀。o3.加入0.45ml 5M的醋酸钾（1/10V），混匀，冰浴20分钟，在10000 rpm离心20 min。需要的话，Miracloth纱布过滤除去沉淀，取上清液转入另一离心管中。o4.加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀，12000 rpm离心15 min。第十二页，讲稿共七十九页哦o 5.转移上清液到另一新离心管中，加入0.7V冰预冷异丙醇，轻轻颠倒混匀，（见丝状沉淀）-20放置30分钟沉淀核酸。o 6.25，12000 rpm，离心10 min，收集沉淀。o 7.弃上清，70乙醇洗两次。o 8.凉干DNA，溶于50 l ddH2O（或TE buffer），4保存备用。第十三页，讲稿共七十九页哦SDS SDS 法的优缺点法的优缺点第十四页，讲稿共七十九页哦2 2、动物细胞总、动物细胞总DNADNA提取提取第十五页，讲稿共七十九页哦操作步骤操作步骤第十六页，讲稿共七十九页哦第十七页，讲稿共七十九页哦3 3、大肠杆菌总、大肠杆菌总DNADNA提取提取第十八页，讲稿共七十九页哦第十九页，讲稿共七十九页哦第二十页，讲稿共七十九页哦第二十一页，讲稿共七十九页哦操作步骤操作步骤第二十二页，讲稿共七十九页哦操作步骤操作步骤第二十三页，讲稿共七十九页哦4 4、质粒、质粒DNADNA提取提取第二十四页，讲稿共七十九页哦碱法提取质粒的原理碱法提取质粒的原理第二十五页，讲稿共七十九页哦提取的主要步骤提取的主要步骤细菌的培养细菌的培养质粒质粒DNA的分离和纯化的分离和纯化细菌的收集和裂解细菌的收集和裂解第二十六页，讲稿共七十九页哦试剂试剂 第二十七页，讲稿共七十九页哦挑取挑取LBLB固体培养基上生长的单菌落，接种于固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0mL LB2.0mL LB（含（含相应抗生素）液体培养基中，相应抗生素）液体培养基中，3737、250g250g振荡培养过夜振荡培养过夜（约（约12-14hr12-14hr）。）。用用2ml2ml离心管收集培养菌液；离心管收集培养菌液；44，12000 g12000 g离心离心1 1分钟，分钟，弃上清。弃上清。加入加入100l100l冰浴的质粒提取液冰浴的质粒提取液I I，涡旋混匀。，涡旋混匀。加加200l 200l 新配制的质粒提取液新配制的质粒提取液II II，盖紧管口，轻轻颠倒，盖紧管口，轻轻颠倒数次，冰浴数次，冰浴5 5分钟。分钟。加加150l150l冰浴的质粒提取液冰浴的质粒提取液IIIIII，轻轻颠倒数次，冰浴，轻轻颠倒数次，冰浴5 5分钟。分钟。操作步骤操作步骤第二十八页，讲稿共七十九页哦操作步骤操作步骤o44，12000 g12000 g离心离心510510分钟，将上清移至新离心管中，加入分钟，将上清移至新离心管中，加入10l RNA10l RNA酶酶(1g/l)(1g/l)，3737处理处理2 2小时。小时。o加入等体积的氯仿：异戊醇加入等体积的氯仿：异戊醇(24(24：1)1)，充分混匀；，充分混匀；44，12000 g12000 g离心离心5 5分钟，将上清移入新的离心管中。分钟，将上清移入新的离心管中。o加加2 2倍体积的预冷的无水乙醇，轻轻混匀，倍体积的预冷的无水乙醇，轻轻混匀，-20-20放置放置3030分钟分钟11小时。小时。o44，12000 g12000 g离心离心1010分钟，弃上清。分钟，弃上清。o70%70%乙醇洗涤；乙醇洗涤；44，12000 g12000 g离心离心5 5分钟，弃上清，重复本步分钟，弃上清，重复本步骤骤1 1次。次。o自然干燥后加入自然干燥后加入1 1TETE或超纯水或超纯水30-50l30-50l，4 or-204 or-20保存。保存。第二十九页，讲稿共七十九页哦氯化铯密度梯度离心法纯化质粒氯化铯密度梯度离心法纯化质粒DNADNA 第三十页，讲稿共七十九页哦RNARNA的提取的提取第三十一页，讲稿共七十九页哦防止防止RNARNA降解，抑制降解，抑制RNAseRNAse活性活性第三十二页，讲稿共七十九页哦DEPCDEPC使用方法使用方法第三十三页，讲稿共七十九页哦提取方法提取方法第三十四页，讲稿共七十九页哦动植物组织动植物组织mRNAmRNA提取提取第三十五页，讲稿共七十九页哦（一）动植物总（一）动植物总RNARNA提取提取-Trizol-Trizol法法 第三十六页，讲稿共七十九页哦o 第三十七页，讲稿共七十九页哦（二）（二）mRNAmRNA纯化纯化 第三十八页，讲稿共七十九页哦植物病毒植物病毒RNARNA提取提取 第三十九页，讲稿共七十九页哦o 核酸电泳核酸电泳主要检测技术第四十页，讲稿共七十九页哦o 基本原理基本原理o DNADNA或者或者RNARNA中磷酸基团是呈离子态的，可中磷酸基团是呈离子态的，可以说以说DNADNA和和RNARNA的多核苷酸链可以叫做多聚的多核苷酸链可以叫做多聚阴离子，在电场下会向正极移动。阴离子，在电场下会向正极移动。核酸电泳第四十一页，讲稿共七十九页哦DNA/RNA的琼脂糖凝胶检测 第四十二页，讲稿共七十九页哦一、实验原理一、实验原理 电泳是现在用于分离和纯化DNA/RNA片段的最常用技术。当制备好的一块“胶”即一块包含电解质的多孔支持介质并把它置于静电场中，DNA/RNA分子将向阳极移动，这是因为DNA/RNA分子沿其双螺旋骨架两侧带有富含负电荷的磷酸根残基。第四十三页，讲稿共七十九页哦o当DNA/RNA长度增加时，来自凝胶的阻力就会增加，不同长度的DNA/RNA片段就会出现不同的迁移率。因而就可依据DNA/RNA分子的大小使其分离。第四十四页，讲稿共七十九页哦分离长度分离长度凝胶电泳凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳200bp近近50kb 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳 5500bp 分辨率高分辨率高o 采用不同浓度的凝胶可以分辨范围广泛的采用不同浓度的凝胶可以分辨范围广泛的DNA分子分子。第四十五页，讲稿共七十九页哦不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围 凝胶中的琼脂糖含量%（W/V）DNA/RNA分子的分离范围（kb）0.35600.61200.70.8100.90.571.20.461.50.2320.12第四十六页，讲稿共七十九页哦EB染料染料 o 溴化乙锭（溴化乙锭（EB）是一种吖啶类染料，它在）是一种吖啶类染料，它在紫外灯照射下能发射荧光，当紫外灯照射下能发射荧光，当DNA样品在样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入就插入DNA分子中形成荧光络合物，使分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍，电泳后就可发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的DNA。第四十七页，讲稿共七十九页哦电泳缓冲液的组成电泳缓冲液的组成 o Tris乙酸（乙酸（TAE）o Tris硼酸（硼酸（TBE）o Tris磷酸（磷酸（TPE）其浓度约为其浓度约为50mmoL/L，PH为为7.57.8，这些缓冲液均含有，这些缓冲液均含有EDTA。这些缓冲液通。这些缓冲液通常配制成浓缩液（母液），贮存于室温。常配制成浓缩液（母液），贮存于室温。第四十八页，讲稿共七十九页哦常用的电泳缓冲液的配制常用的电泳缓冲液的配制缓冲液缓冲液使用液使用液浓贮存液（每升）浓贮存液（每升）Tris乙酸乙酸（TAE）1：0.04moL/L Tris乙酸乙酸 0.001moL/L EDTA 50：242g Tris碱碱57.7mL 冰乙酸冰乙酸100mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0)Tris磷酸磷酸（TPE）1：0.09moL/L Tris磷酸磷酸 0.002moL/L EDTA10：108g Tris碱碱15.5mL 85%磷酸磷酸40mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0)Tris硼酸硼酸（TBE）0.50.045moL/L Tris硼酸硼酸 0.001moL/L EDTA5：54g Tris碱碱27.5g硼酸硼酸20mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0)第四十九页，讲稿共七十九页哦电泳缓冲液比较电泳缓冲液比较缓冲液缓冲容量迁移速度分辨率用途TAE最低最快(高10)高分子量高高度复杂DNA混合物；超螺旋DNATBE很高较慢低分子量高价格昂贵，不常用TPE第五十页，讲稿共七十九页哦加样缓冲液加样缓冲液 缓冲液类型缓冲液类型 6缓冲液缓冲液贮存温度贮存温度I 0.25%溴酚蓝溴酚蓝 0.25%二甲苯青二甲苯青FF 40%（W/V）蔗糖水溶液）蔗糖水溶液4II 0.25%溴酚蓝溴酚蓝 0.25%二甲苯青二甲苯青FF 15%聚蔗糖水溶液聚蔗糖水溶液室温室温III 0.25%溴酚蓝溴酚蓝 0.25%二甲苯青二甲苯青FF 30%甘油水溶液甘油水溶液4IV 0.25%溴酚蓝溴酚蓝 40%（W/V蔗糖水溶液）蔗糖水溶液）4V（碱性加样缓冲液）（碱性加样缓冲液）300m moL/L NaoH 6 mmoL/L EDTA 18%聚蔗糖水溶液聚蔗糖水溶液 015%溴甲酚绿溴甲酚绿 025%二甲苯青二甲苯青FF4第五十一页，讲稿共七十九页哦o 加样缓冲液可以增大样品密度，以确保加样缓冲液可以增大样品密度，以确保DNA均匀进入样品均匀进入样品孔内，还可以使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利。孔内，还可以使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利。o 溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为二甲苯青溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为二甲苯青FF的的2.2倍，倍，溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约与长溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约与长300bp的的双链线性双链线性DNA相同，而二甲苯青相同，而二甲苯青FF在琼脂糖凝胶中移动在琼脂糖凝胶中移动的速率则与的速率则与4kb双链线性双链线性DNA相同。相同。第五十二页，讲稿共七十九页哦DNA片段长度标记片段长度标记 o DNA片段长度标记通常叫作 DNA Marker,实验使用的DNA片段长度标记，一般包括250bp ladder，DL2000，DL5000，DL10000等，DNA Marker不仅可以作为凝胶中DNA片段长度的一个标记，还可以作为电泳的对照。第五十三页，讲稿共七十九页哦第五十四页，讲稿共七十九页哦第五十五页，讲稿共七十九页哦第五十六页，讲稿共七十九页哦将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在35mm之间，凝固之间，凝固2060min。第五十七页，讲稿共七十九页哦凝胶制备的注意事项凝胶制备的注意事项o 1、配胶和电泳需要使用同一批次的缓冲液（一些限制酶缓冲、配胶和电泳需要使用同一批次的缓冲液（一些限制酶缓冲液含有高浓度盐，能减慢液含有高浓度盐，能减慢DNA的迁移，并可使临近孔泳带变斜的迁移，并可使临近孔泳带变斜）o2、琼脂糖要彻底熔化，时间不宜过长、琼脂糖要彻底熔化，时间不宜过长o 3、EB含量要适当含量要适当o 4、凝胶应存放在阴凉处，再次用时加入少量电泳液，再、凝胶应存放在阴凉处，再次用时加入少量电泳液，再熔化熔化o5、检查梳子、检查梳子o6、拔取梳子时应均匀用力，检查凝胶孔的整齐度、拔取梳子时应均匀用力，检查凝胶孔的整齐度o 7、凝胶稍厚些，避免样品溢出、凝胶稍厚些，避免样品溢出第五十八页，讲稿共七十九页哦注意事项与实验技巧注意事项与实验技巧o制胶和加样过程中要防治气泡的产生。制胶和加样过程中要防治气泡的产生。oEB具有强诱变性，可致癌。必须戴手套操作，严格注意防护。具有强诱变性，可致癌。必须戴手套操作，严格注意防护。o凝胶一定要加热熔解完全，均匀，可以对着光亮的地方看看清澈不清澈凝胶一定要加热熔解完全，均匀，可以对着光亮的地方看看清澈不清澈；o一般情况下，梳子越薄而长，条带越好看一般情况下，梳子越薄而长，条带越好看；o上样量不宜过多，会造成条带的相互挤压；上样量不宜过多，会造成条带的相互挤压；o如果点样孔多余，将样点到中间，尽量避免边缘效应如果点样孔多余，将样点到中间，尽量避免边缘效应，中间电场比较，中间电场比较均匀均匀；o做胶的缓冲液和跑胶的缓冲液浓度应该一致；做胶的缓冲液和跑胶的缓冲液浓度应该一致；o加样时不要太快，让其自然沉底，均匀分布在电泳孔内，加样时不要太快，让其自然沉底，均匀分布在电泳孔内，Tip头不宜插入样头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔品孔太深，也不要穿破胶孔壁，否则样品渗漏或壁，否则样品渗漏或DNA带型不整齐带型不整齐；o电泳开始时可以采用低电压使其跑出孔后，再调高电压。电泳开始时可以采用低电压使其跑出孔后，再调高电压。第五十九页，讲稿共七十九页哦迁移速率的决定因素 第六十页，讲稿共七十九页哦第六十一页，讲稿共七十九页哦o 第六十二页，讲稿共七十九页哦聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳第六十三页，讲稿共七十九页哦 原理原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，Nmethylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N，N四甲基乙二胺(N，N，N，Ntetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate(NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。第六十四页，讲稿共七十九页哦o聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：o在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；o化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；o对pH和温度变化较稳定；o几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；o样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g；o凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；1.分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。第六十五页，讲稿共七十九页哦o 凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关 分子量范围与凝胶浓度的关系 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%)蛋 白 质 104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 10-15 1105 5-10 5105 2-5 核酸(RNA)104 1520 104105 5-10 105-2106 2-2.6第六十六页，讲稿共七十九页哦聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳-DNA-DNA第六十七页，讲稿共七十九页哦o 缓冲系统的选择缓冲系统的选择 一般情况下，在被分析的蛋白质稳定的一般情况下，在被分析的蛋白质稳定的pH范围，凡不与范围，凡不与SDS发生相互作用的缓冲液都可发生相互作用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白质的分离和电以使用，但缓冲液的选择对蛋白质的分离和电泳的速度是非常关键的。泳的速度是非常关键的。SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳-蛋白质蛋白质第六十八页，讲稿共七十九页哦电泳缓冲液的种类：电泳缓冲液的种类：1、磷酸缓冲液、磷酸缓冲液2、Tris-醋酸钠缓冲系统醋酸钠缓冲系统3、咪唑缓冲液系统：、咪唑缓冲液系统：比磷酸缓冲系统的导电性低，电泳速度要比后者快一倍。比磷酸缓冲系统的导电性低，电泳速度要比后者快一倍。4、尿素系统：、尿素系统：适用分子量低于适用分子量低于15kD的蛋白样品。的蛋白样品。5、Tris-甘氨酸系统：甘氨酸系统：使用最多的缓冲液使用最多的缓冲液6、Tris-硼酸盐缓冲液：硼酸盐缓冲液：测定糖蛋白的分子量测定糖蛋白的分子量第六十九页，讲稿共七十九页哦o SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。第七十页，讲稿共七十九页哦SDS及其作用及其作用o 十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS)，是一种阴离子去污剂。它，是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体（在水溶液中以单体（monomer）和分子）和分子团（团（micellae）的混合形式存在。）的混合形式存在。o 作用：破坏蛋白质分子之间以及其他物质分作用：破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的构象，保证蛋白质分子与有的构象，保证蛋白质分子与SDS充分结充分结合而形成带负电荷的蛋白质合而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。复合物。第七十一页，讲稿共七十九页哦分离胶聚合之后分离胶聚合之后第七十二页，讲稿共七十九页哦第七十三页，讲稿共七十九页哦第七十四页，讲稿共七十九页哦第七十五页，讲稿共七十九页哦第七十六页，讲稿共七十九页哦第七十七页，讲稿共七十九页哦第七十八页，讲稿共七十九页哦o纹理和脱尾现象：样品溶解不佳，加样前离心。纹理和脱尾现象：样品溶解不佳，加样前离心。o蛋白带过宽：邻近泳道的蛋白加样量过多。蛋白带过宽：邻近泳道的蛋白加样量过多。o指示剂成微笑符号：凝胶不均匀冷却。指示剂成微笑符号：凝胶不均匀冷却。o指示剂成哭泣符号：凝胶和玻璃板组成指示剂成哭泣符号：凝胶和玻璃板组成“三明治三明治”底底部有气泡。部有气泡。o凝胶时间不对：凝胶太慢可能是凝胶时间不对：凝胶太慢可能是TEMED、APS剂剂量不足或失效；凝胶太快：量不足或失效；凝胶太快：TEMED、APS用量过多用量过多，胶太硬易裂。，胶太硬易裂。SDS-PAGE 常见问题常见问题第七十九页，讲稿共七十九页哦