植物细胞工程基本原理.ppt

现在学习的是第1页，共39页2.12.1植物细胞全能性植物细胞全能性(totipotent)(totipotent)在离体培养下，植物的体细胞或性细胞被在离体培养下，植物的体细胞或性细胞被诱导产生器官诱导产生器官分化分化和和再生再生，成为具有与母，成为具有与母体植株体植株相同遗传信息相同遗传信息的植株的能力。的植株的能力。植物细胞全能性的相对性植物细胞全能性的相对性 不是所有基因型的所有细胞在任何条件下不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的培养反应；都具有良好的培养反应；动、植物细胞全能性的表现程度存在明显动、植物细胞全能性的表现程度存在明显差异。差异。细胞全能性并不意味着任何细胞均可以直细胞全能性并不意味着任何细胞均可以直接产生植物个体。接产生植物个体。现在学习的是第2页，共39页2.2植物细胞分化植物细胞分化 基因的差异性表达，即为细胞分化；具基因的差异性表达，即为细胞分化；具体表现为内部生理变化和外部形态变化。体表现为内部生理变化和外部形态变化。细胞分化使细胞功能趋于专门化，更有细胞分化使细胞功能趋于专门化，更有利于提高生理功能的效率。因此利于提高生理功能的效率。因此,分化是分化是进化的表现进化的表现,越高级的植物类群越高级的植物类群,分化水分化水平越高平越高,细胞分工越细细胞分工越细,机体代谢水平也机体代谢水平也越高。越高。现在学习的是第3页，共39页2.3离体条件下植物细胞的脱分化和再离体条件下植物细胞的脱分化和再分化分化 细胞脱分化和再分化的概念细胞脱分化和再分化的概念 细胞全能性与脱分化和再分化的关系细胞全能性与脱分化和再分化的关系现在学习的是第4页，共39页 细胞脱分化细胞脱分化（dedifferentiation)是指失去已分化细胞的典型特征，或消除了细胞分是指失去已分化细胞的典型特征，或消除了细胞分工，使之回复到分生组织状态，或胚性细胞状态。工，使之回复到分生组织状态，或胚性细胞状态。FlashFlash 细胞脱分化阶段细胞脱分化阶段启动阶段，表现为细胞质增生，并开始向细胞中央启动阶段，表现为细胞质增生，并开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白体出现；伸出细胞质丝，液泡蛋白体出现；演变阶段，此时细胞核开始向中央移动，质体演变演变阶段，此时细胞核开始向中央移动，质体演变成原质体；成原质体；脱分化终结期，细胞回复到分生细胞状态，细胞脱分化终结期，细胞回复到分生细胞状态，细胞分裂即将开始。分裂即将开始。一个植物细胞向分生状态回复过程所能进行的程度，取一个植物细胞向分生状态回复过程所能进行的程度，取决于它在自然部位上所处的位置和生理状态。决于它在自然部位上所处的位置和生理状态。现在学习的是第5页，共39页现在学习的是第6页，共39页现在学习的是第7页，共39页 愈伤组织愈伤组织(callus)(callus)：脱分化后的细胞，往：脱分化后的细胞，往往经过细胞分裂形成一团无特定结构和功往经过细胞分裂形成一团无特定结构和功能的松散的薄壁细胞团。能的松散的薄壁细胞团。草莓烟草现在学习的是第8页，共39页 细胞再分化（细胞再分化（redifferentiation)redifferentiation)：脱分化后的分生细胞（愈伤组织）在特定脱分化后的分生细胞（愈伤组织）在特定的条件下，重新恢复细胞分化能力，并经的条件下，重新恢复细胞分化能力，并经历器官发生形成单极性的芽或根，历器官发生形成单极性的芽或根，或或经历经历胚胎发生形成双极性的胚状体，进一步发育胚胎发生形成双极性的胚状体，进一步发育成完整植物体的过程。成完整植物体的过程。极性：是指植物的器官、组织、甚至单个细胞极性：是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。生化上的梯度差异。在很多情况下，细胞的不均等分裂是细胞极在很多情况下，细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志。性建立的标志。现在学习的是第9页，共39页细胞全能性脱分化再分化个体再生细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的，在大多数情况下，脱分化是细胞全能性表达的前提，再分化是细胞全能性表达的最终体现。细胞分裂细胞全能性与脱分化和再分化的关系现在学习的是第10页，共39页器官发生器官发生植物的离体器官发生是指培养条件下的组植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根（adventitious rootsadventitious roots）、不定芽）、不定芽（adventitious shootsadventitious shoots）等器官的过程。）等器官的过程。通过器官发生形成再生植株有三种方式：通过器官发生形成再生植株有三种方式：现在学习的是第11页，共39页 先芽后根现在学习的是第12页，共39页 先根后芽现在学习的是第13页，共39页 在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株。现在学习的是第14页，共39页植株再生植株再生两种途径：两种途径：器官发生途径器官发生途径:根芽器官直接分化形成植株根芽器官直接分化形成植株 体细胞胚胎发生途径体细胞胚胎发生途径:产生具有胚芽、胚根的胚状体结构再产生具有胚芽、胚根的胚状体结构再形成植株形成植株现在学习的是第15页，共39页植物体细胞胚胎发生植物体细胞胚胎发生 胚状体：（胚状体：（embryoid）亦称体细胞胚或体胚。在体）亦称体细胞胚或体胚。在体外，由体细胞（非合子细胞）经胚胎发育产生的类外，由体细胞（非合子细胞）经胚胎发育产生的类似胚胎的结构。似胚胎的结构。其发育过程与合子胚类似，经过原胚、球形胚、心形胚、其发育过程与合子胚类似，经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷形胚及子叶胚等几个阶段。鱼雷形胚及子叶胚等几个阶段。在其发生的最早阶段就具有两极性，即根端（胚根）和茎端（胚芽），并且与母体细胞或外植体的维管束无直接联系 胚状体一开始就是一个完整植物的雏形，可通过根端或类似胚柄结构从外植体或愈伤组织中取得营养。很容易从愈伤组织的表面脱离下来，在适宜条件下长成一株植物。现在学习的是第16页，共39页魔芋体细胞胚魔芋现在学习的是第17页，共39页如何鉴别胚状体？如何鉴别胚状体？（I I）与器官发生形成个体的途径相比：与器官发生形成个体的途径相比：胚状体具双极性（胚状体具双极性（double polaritydouble polarity）生理隔离（生理隔离（physiological isolationphysiological isolation）遗传性相对稳定遗传性相对稳定由于大多数体细胞胚起源于单细胞，因此对由于大多数体细胞胚起源于单细胞，因此对于单个植株来讲，通过体细胞胚形成的再生于单个植株来讲，通过体细胞胚形成的再生植株，其遗传特性相对稳定。植株，其遗传特性相对稳定。重演受精卵形态发生的特性。重演受精卵形态发生的特性。现在学习的是第18页，共39页如何鉴别胚状体？如何鉴别胚状体？（IIII）与合子胚相比：与合子胚相比：合子胚在发育初期具有明显合子胚在发育初期具有明显胚柄胚柄，体细胞，体细胞胚没有真正的胚没有真正的胚柄胚柄 合子胚的合子胚的子叶子叶是相当规范的，要以作为分是相当规范的，要以作为分类的依据，而体细胞胚的子叶常不规范，类的依据，而体细胞胚的子叶常不规范，有时具有两片以上的子叶有时具有两片以上的子叶 与相同植物相比，体细胞胚与相同植物相比，体细胞胚体积体积明显明显小小于于合子胚合子胚 体细胞胚没有休眠，而合子胚胚胎发育完体细胞胚没有休眠，而合子胚胚胎发育完全进入子叶期以后，经过一系列的物质积全进入子叶期以后，经过一系列的物质积累和脱水就进入累和脱水就进入休眠休眠。现在学习的是第19页，共39页类似于动物胚胎早期的发育类似于动物胚胎早期的发育胚胎细胞发生发育早期2次均等分裂胚结构形成现在学习的是第20页，共39页体细胞胚胎发生途径体细胞胚胎发生途径胚状体可从离体培养的各种外植体上直接胚状体可从离体培养的各种外植体上直接或间接地发生，大致分为五种：或间接地发生，大致分为五种：直接从器官外植体上发生直接从器官外植体上发生(以叶片为例）以叶片为例）愈伤组织发生愈伤组织发生 悬浮培养细胞发生悬浮培养细胞发生 单倍体细胞发生单倍体细胞发生 原生质体发生原生质体发生现在学习的是第21页，共39页体细胞胚胎发生途径体细胞胚胎发生途径1 1：叶片叶片诱导阶段胚胎发育阶段(兰草,Chen等,1999)兰草现在学习的是第22页，共39页体细胞胚胎发生途径体细胞胚胎发生途径2 2：愈伤组织愈伤组织诱导愈伤组织形成愈伤组织胚性化球形胚形成子叶胚期蝴蝶兰,Lin等,2000现在学习的是第23页，共39页蝴蝶兰现在学习的是第24页，共39页体细胞胚胎发生途径体细胞胚胎发生途径3 3：（：（悬浮细胞悬浮细胞）发生过程：胚性细胞团转移到适宜的胚胎发生培养基上发生过程：胚性细胞团转移到适宜的胚胎发生培养基上以后，其外围的许多细胞开始以后，其外围的许多细胞开始不均等分裂不均等分裂，靠近细胞，靠近细胞团方向的一个细胞较大，以后发育成类似胚柄的结构。团方向的一个细胞较大，以后发育成类似胚柄的结构。另一个细胞则继续分裂形成类似原胚的结构，以后经另一个细胞则继续分裂形成类似原胚的结构，以后经过类似于体内的发育过程，经球形期、心形期等发育过类似于体内的发育过程，经球形期、心形期等发育阶段形成完整的体细胞胚。阶段形成完整的体细胞胚。悬浮液中有两类细胞：不具备胚胎发生潜力（自由分散、大、高度液泡化）具备成胚能力的胚性细胞团（成簇成团、小、胞质致密）现在学习的是第25页，共39页悬浮细胞体细胞胚发生过程悬浮细胞体细胞胚发生过程愈伤组织胚性愈伤组织悬浮培养的胚性细胞团球形胚形成成熟子叶胚现在学习的是第26页，共39页影响体细胞胚发生的因素1.生长调节物质(1)生长素类:(例）在离体条件下胡萝卜体细胞胚的发育是一个包括两个步骤的过程,每个步骤需要一种不同的培养基。愈伤组织的建立和增殖所需要的是一种含有生长素的培养基，通常所用的生长素是2,4-D,浓度范围0.51mg/L。在这样一种培养上,愈伤组织的若干部位分化形成分生细胞团,称作“胚性细胞团”。在增殖培养基上反复继代,胚性细胞团的数量不断增加,但并不出现成熟的胚。然而,如果把胚性细胞团转移到一种生长素含量很低或完全没有生长素的培养上,它们就能发育为成熟的胚。现在学习的是第27页，共39页(2)(2)细胞分裂素类细胞分裂素类:既或促进也可抑制体细胞胚的发生既或促进也可抑制体细胞胚的发生,这主要这主要取决于植物的种类及其基因型。取决于植物的种类及其基因型。一般而言一般而言,细胞分裂素对于促进体细胞胚的细胞分裂素对于促进体细胞胚的成熟成熟有显著作有显著作用用,特别有利于子叶的发育。特别有利于子叶的发育。另外有研究表明另外有研究表明,不同的外植体对于细胞分裂素的需要可不同的外植体对于细胞分裂素的需要可能具有不同的能具有不同的专一性专一性,如在胡萝卜的研究中发现如在胡萝卜的研究中发现,虽然虽然激动素对胚胎发生过程表现抑制作用激动素对胚胎发生过程表现抑制作用,但浓度为但浓度为0.1M0.1M的玉米素却能促进这个过程的玉米素却能促进这个过程,而而6-BA6-BA对胡萝卜则对胡萝卜则是促进其愈伤组织的增殖是促进其愈伤组织的增殖,但不形成胚性愈伤组织。但不形成胚性愈伤组织。现在学习的是第28页，共39页(3)(3)赤霉素类赤霉素类:赤霉素类能抑制体细胞胚胎发生赤霉素类能抑制体细胞胚胎发生,但对于许多植物但对于许多植物而言而言,赤霉素对于体细胞胚的赤霉素对于体细胞胚的成熟与萌发成熟与萌发有促进有促进作用。作用。(4)(4)脱落酸脱落酸:抑制剂特别是抑制剂特别是ABA,ABA,在体细胞胚发生过程中的作用在体细胞胚发生过程中的作用正逐渐被提示出来正逐渐被提示出来,ABA,ABA是一种天然产生的生长调是一种天然产生的生长调节剂节剂,当把无抑制作用剂量当把无抑制作用剂量(通常是通常是0.10.11M)1M)的的ABAABA用于荷兰芹属培养物时用于荷兰芹属培养物时,可以允许胚成熟过程进可以允许胚成熟过程进行。但是其抑制不定胚的行。但是其抑制不定胚的启动启动。小麦、石刁柏、颠茄则要在适当浓度的生长素和较高浓度的激动素时才能分化出胚状体现在学习的是第29页，共39页石刁柏颠茄现在学习的是第30页，共39页2.2.氮源氮源氮源有还原态氮氮源有还原态氮(NH(NH4 4+)和氧化态氮和氧化态氮(NO(NO3 3-)两种两种在以在以KNOKNO3 3为唯一氮源为唯一氮源(如如WhiteWhite培养基培养基)的培养上建立起的培养上建立起来的愈伤组织来的愈伤组织,去掉生长素以后不能形成胚。去掉生长素以后不能形成胚。德国德国ReinertReinert等在栽培胡萝卜愈伤组织培养中等在栽培胡萝卜愈伤组织培养中(培养培养基均为基均为WhiteWhite培养基培养基)得到以下结果得到以下结果:NH4+(mM)NO3-(mM)体胚发生数(个/2ml)10401131219055190.309511.34.1现在学习的是第31页，共39页3.3.低温预处理低温预处理低温低温(3(3）对四季橘花粉胚形成的影响）对四季橘花粉胚形成的影响处理时间（天）培养花粉花胚状体（枚）(个)()084880.945723121.6610902151.661584650.592047020.432543430.69现在学习的是第32页，共39页4.4.植物的遗传性植物的遗传性 一个离体培养的烟草花药，可以产生一个离体培养的烟草花药，可以产生200个体细胞胚。个体细胞胚。花药培养中胚状体诱导率比较花药培养中胚状体诱导率比较诱导率（）烟草30柑桔0.43%1.66%白菜1.1%1.68%现在学习的是第33页，共39页苹果品种间花药培养胚状体发生频率比较苹果品种间花药培养胚状体发生频率比较品种发生频率（）元帅1.9%2.5%国光0.0%1.2%金冠0.2%3.4%赤阳0.3%1.5%现在学习的是第34页，共39页生理状态对体细胞胚形成的影响现在学习的是第35页，共39页生理状态对体细胞胚形成的影响生理状态对体细胞胚形成的影响 如毛果杨花药诱导在不同年份效果截然不同如毛果杨花药诱导在不同年份效果截然不同 以叶片为诱导材料的以叶片为诱导材料的:黑杨黑杨x辽杨以组培苗的辽杨以组培苗的针刺叶片为材料，才能诱导出胚性愈伤组织针刺叶片为材料，才能诱导出胚性愈伤组织 N C-5339取组培苗未展开的叶片。取组培苗未展开的叶片。缘毛杨需先进行缘毛杨需先进行BA长时期暗培养。长时期暗培养。因此，对外植体材料进行适当的选择或前处因此，对外植体材料进行适当的选择或前处理，有利于体细胞胚的诱导。理，有利于体细胞胚的诱导。:于志水，男，于志水，男，1977年年10月生，北京林业大学林木花卉遗传育种月生，北京林业大学林木花卉遗传育种教育部重点开放实验室，硕士研究生。教育部重点开放实验室，硕士研究生。杨树体细胞胚胎发生研究概杨树体细胞胚胎发生研究概况况,东北林业大学学报东北林业大学学报 2005.1现在学习的是第36页，共39页影响因子外因内因遗传性状生理状态营养条件环境条件无机盐有机物激素天然复合物渗透压酸碱度湿度温度光照现在学习的是第37页，共39页小结小结 细胞全能性是细胞工程的基本理论基础细胞全能性是细胞工程的基本理论基础 细胞全能性的表达能力与细胞分化有关细胞全能性的表达能力与细胞分化有关 离体培养下细胞全能性表达是通过细胞离体培养下细胞全能性表达是通过细胞脱分化和再分化实现的脱分化和再分化实现的 器官发生和体细胞胚发生是植物细胞再器官发生和体细胞胚发生是植物细胞再生个体的基本途径生个体的基本途径现在学习的是第38页，共39页感谢大家观看现在学习的是第39页，共39页