细胞工程与基因工程.ppt

关于细胞工程与基因工关于细胞工程与基因工程程现在学习的是第1页，共38页BCA生物工程的技术体系生物工程的技术体系细胞工程的基本原理基因工程的基本原理细胞工程与基因工程现在学习的是第2页，共38页酶生物活性分子天然细胞天然细胞干细胞工程干细胞工程细胞组织器官个体组织工程组织器官个体生物活性分子发酵工程细胞工程代谢工程分离工程分离工程酶工程采集破碎蛋白质工程途径工程基因工程生物工程的技术体系细胞工程分离工程分离工程现在学习的是第3页，共38页细胞工程的基本原理 细胞工程是指通过组织、细胞、细胞器水平上的筛选和改造，获得具有商业价值的人造组织（器官）、工程细胞株或细胞系，再通过规模化培养，制备特殊产品的技术和过程。细胞工程包括：动植物细胞及组织大规模培养技术动植物细胞融合技术动植物细胞重组技术干细胞技术（组织或器官再生技术，即组织工程）现在学习的是第4页，共38页植物细胞和组织的大规模培养技术基本原理：植物细胞的分化全能性现在学习的是第5页，共38页动物细胞的大规模培养技术基本原理：动物细胞的接触抑制性现在学习的是第6页，共38页动植物细胞融合技术将两种不同性状的细胞在促融剂的帮助下融合在一起，并从中筛选出具有优异性能的杂合细胞。例如，B淋巴细胞具有合成特异性抗体的性状，骨髓瘤细胞具有生长迅速的性状。将两者融合，就能筛选到集两者优点的杂合细胞，即单克隆抗体技术。现在学习的是第7页，共38页细胞重组是把不同种类的细胞的部件重新组合装配，包括细胞核移植、叶绿体移植、核糖体重建及线粒体装配等，由此获得具有优良性能的重组细胞株或细胞系动植物细胞重组技术现在学习的是第8页，共38页经历277次乳腺细胞核的移植实验；获得29个发育为八细胞胚；使用13头代孕母亲；生 出 多 莉动植物细胞重组技术现在学习的是第9页，共38页骨髓多能干细胞骨髓细胞淋巴细胞网状细胞红细胞巨核细胞血小板单核细胞巨噬细胞嗜中酸碱性粒细胞B、T 淋巴细胞干细胞技术（组织或器官再生技术）现在学习的是第10页，共38页基因工程的基本原理切接转增检现在学习的是第11页，共38页DNA的体外重组：切与接的体外重组：切与接用限制性核酸内切酶切割DNA分子识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构5 G C T G A A T T C G A G 33 C G A C T T A A G C T C 5EcoRI 的识别序列EcoRI 的切割位点现在学习的是第12页，共38页EcoRI 等产生的 5 粘性末端5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5EcoRI 37 5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 退火 4-7 5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5OH POHP现在学习的是第13页，共38页PstI 等产生的 3 粘性末端5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5PstI 37 5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5 退火 4-7 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OHPOHP现在学习的是第14页，共38页PvuII 等产生的平头末端5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5PvuII 37 5 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 现在学习的是第15页，共38页DNA的体外重组：切与接的体外重组：切与接用T4-DNA连接酶连接DNA分子修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键T4-DNA连接酶5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OHPOHP5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5nicknick现在学习的是第16页，共38页DNA的体外重组：切与接的体外重组：切与接用T4-DNA连接酶连接DNA分子连接多个平头双链DNA分子5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 55 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 T4-DNA连接酶现在学习的是第17页，共38页同种内切酶生产的粘性末端的连接5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5GCTTAAAATTCG5 5 GCTTAA 55 AATTCG5 退火GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG现在学习的是第18页，共38页同尾酶生产的粘性末端的连接BamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 TACTAG 55 GATCAT5 退火GCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATT4-DNA ligaseTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT5 TGATCAACTAGT5 BclIGCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT现在学习的是第19页，共38页同尾酶生产的粘性末端的连接载体质粒BamHISau3AIGGATCCCCTAGGGATCCTAGBamHISau3AISau3AIGATCCGCTAG现在学习的是第20页，共38页不同酶生产的粘性末端的连接BamHI5 5GGATCCCCTAGGCTGCAGGACGTCGATCCG5 5 G5 GACGTCT4-DNA ligase5 CTGCAGGACGTC5 PstI3 PstICTGCA3 GGGATCCCCTAGGBamHICCTAG5 5 G5 GACGTCCCTAGGATCCGCTGCAG5 G5ACGTCCCTAGGGATCCCTGCAGG混合退火现在学习的是第21页，共38页重组重组DNA分子分子的转化和扩增：转与增的转化和扩增：转与增物理转化法：钙离子诱导的细菌转化原生质体转化电击转化生物转化法：病毒转染转化细菌接合转化现在学习的是第22页，共38页转化子的筛选和鉴定：检转化子的筛选和鉴定：检 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子。转化子重组子目的重组子现在学习的是第23页，共38页基于载体遗传标记筛选抗药性筛选法ROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAprpBR3224363 bpori此类筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。将外源DNA片段插在EcoRI位点：非重组子呈 Apr、Tcr 重组子呈 Apr、Tcr 将外源DNA片段插在BamHI位点：非重组子呈 Apr、Tcr 重组子呈 Apr、Tcs 现在学习的是第24页，共38页基于载体遗传标记筛选抗药性筛选法抗药性筛选法的基本操作：先将转化液涂布含有Ap的平板上；再将Ap平板上的转化子影印至含有Ap和Tc的平板上。在Ap平板上生长、但在Ap和Tc平板上不长的转化子即为重组子。ApAp+Tc影印挑选现在学习的是第25页，共38页基于载体遗传标记筛选重组子（Apr+lacZ-）pUC18AprlacZoriAp+X-gal显色筛选法现在学习的是第26页，共38页pUC18 2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIAprlacZoriBBEP4.0 kb1.0 kb0.8 kb区分重组子与非重组子用BamHI酶切转化子质粒DNA电泳观察酶解产物片段重组子：2.7 kb+4.0 kb非重组子：2.7 kb如果外源DNA片段也是2.7 kb，最好选用单一切口的酶将质粒线型化，然后通过其长度来鉴定其是否为重组子基于克隆基于克隆DNA序列检测序列检测限制性酶切图谱法：现在学习的是第27页，共38页pUC18 2.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIAprlacZoriBBEP4.0 kb1.0 kb0.8 kb区分目的重组子与非目的重组子用EcoRI酶切转化子质粒DNA：目的重组子：3.0 kb+3.7 kb 或者：1.0 kb+5.7 kb用PstI酶切转化子质粒DNA：目的重组子：3.2 kb+3.5 kb 或者：0.8 kb+5.9 kb基于克隆基于克隆DNA序列检测序列检测限制性酶切图谱法：现在学习的是第28页，共38页基于目标DNA序列鉴定DNA 杂交法影印碱解杂交感光漂洗取膜ATGCCGTATGTGTCATAGCGGCATACACAGGCGTGTAAATGCGCGTAAATTGTCGTAATGCGTAAGCCCCGTGTAAATGTCGACTAT此类筛选法可区分目的重组子与非目的重组子。探针现在学习的是第29页，共38页基于目标DNA序列鉴定PCR 扩增法引物 A引物 B凝胶电泳检测PCR扩增产物A/BAB非重组子重组子目的重组子现在学习的是第30页，共38页目的基因的克隆（分离获得）实现基因工程三大用途的前提条件是从生物体基因组中克隆目的基因。目的基因获得之后，或确定其表达调控机制及生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。现在学习的是第31页，共38页目的基因的克隆鸟枪法克隆目的基因cDNA法克隆目的基因PCR法获得目的基因化学合成法获得目的基因现在学习的是第32页，共38页目的基因的克隆鸟枪法克隆目的基因基因文库现在学习的是第33页，共38页目的基因的克隆cDNA法克隆目的基因煮沸NaOHAAAAAAAAAAAAAA5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTOH 3KlenowdNTPsS1基因文库5ppp5G G AAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTp 5逆转录酶mRNAcDNA现在学习的是第34页，共38页目的基因的克隆PCR法克隆目的基因 DNA复制（生物合成）的基本原理5p-ACCTCGTGTCAAAGCCGTCGATGTACGTTAGCCGC-OH 33HO-TGGAGCACAGTTTCGGCAGCTACATGCAATCGGCG-p 53HO-UCGGCG-p 55p-ACCUCG-OH 3引物引物5 pppNR5 pppNRDNA聚合酶模板现在学习的是第35页，共38页55目的基因5变性加热55引物退火55底物聚合5555加热变性5555555555555555555555555退火 引物底物聚合加热变性引物退火底物聚合123现在学习的是第36页，共38页目的基因的克隆化学合成法克隆目的基因OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeOHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeHDMT：二甲氧基三苯甲基激活缩合氧化脱取代基玻璃珠连接臂现在学习的是第37页，共38页感谢大家观看现在学习的是第38页，共38页