核酸的理化性质研究方法课件.ppt
关于核酸的理化性质研究方法第1页，此课件共28页哦第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v第十四章核酸的物理化学性质第十四章核酸的物理化学性质v一、核酸的水解一、核酸的水解v二、核酸的酸碱性质二、核酸的酸碱性质v三、核酸的紫外吸收三、核酸的紫外吸收v四、核酸的变性、复性及杂交四、核酸的变性、复性及杂交v第十五章核酸的研究方法第十五章核酸的研究方法v一、核酸的分离、纯化和定量测定一、核酸的分离、纯化和定量测定v二、核酸的超速离心二、核酸的超速离心v三、核酸的凝胶电泳三、核酸的凝胶电泳v四、核酸的核苷酸序列测定四、核酸的核苷酸序列测定v五、五、DNA聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）第2页，此课件共28页哦第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论核酸的化学结构和作为高聚物决定其理化性质：v核酸的糖苷键和磷酸二酯键：可被水解；v磷酸基和碱基：酸碱性质；v碱基：紫外吸收特性；v双螺旋结构：变性和复性。第3页，此课件共28页哦第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论一、核酸的水解v（一）酸水解v糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解，产生嘌呤和嘧啶碱v（二）碱水解vRNA的磷酸酯键更易被碱水解（RNA的核糖上有2-OH，在碱作用下形成磷酸三酯，极不稳定易水解，产生核苷2，3-环磷酸酯，继续水解产生2-核苷酸和3-核苷酸）第4页，此课件共28页哦第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论（三）酶水解v专一水解核酸的磷酸二酯键的酶称为专一水解核酸的磷酸二酯键的酶称为核酸酶核酸酶(nuclease)(nuclease)。v能识别特定的核苷酸顺序，并从特定位点水解核酸的内切酶称为能识别特定的核苷酸顺序，并从特定位点水解核酸的内切酶称为限制性核酸内切酶（限制酶）限制性核酸内切酶（限制酶）。第5页，此课件共28页哦第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论1、核酸酶的分类v（1）按底物专一性分类：v核糖核酸酶（核糖核酸酶（ribonuclease,RNaseribonuclease,RNase）：作用于核糖核酸；）：作用于核糖核酸；v脱氧核糖核酸酶（脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease,DNasedeoxyribonuclease,DNase）：作用于脱氧核糖核）：作用于脱氧核糖核酸；酸；v（2）按底物作用的方式分类：v核酸外切酶（核酸外切酶（endonucleaseendonuclease）：）：从多核苷酸链的末端开始从多核苷酸链的末端开始,逐个将核逐个将核苷酸切下的酶苷酸切下的酶；v核酸内切酶核酸内切酶(exonuclease)(exonuclease)：从多核苷酸链的内部开始水解核酸的从多核苷酸链的内部开始水解核酸的酶。酶。第6页，此课件共28页哦第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v（3）按磷酸二酯键断裂的方式分类：v一种是在3-OH与磷酸基之间断裂，其产物是5-磷酸核苷酸或寡核苷酸,如（1）；v另一种是在5-OH与磷酸基之间断裂，其产物是3-磷酸核苷酸或寡核苷酸,如（2）。P P PN N N(1)(2)(1)(2)53第7页，此课件共28页哦第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v2、核糖核酸酶类v牛胰核糖核酸酶、核糖核酸酶T1、核糖核酸酶T2等；v3、脱氧核糖核酸酶类v牛胰脱氧核糖核酸酶、牛脾脱氧核糖核酸酶、限制性内切酶等。v4、N糖苷酶第8页，此课件共28页哦第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论核酸酶核酸酶底物底物切点切点产物产物胰核糖核酸酶胰核糖核酸酶RNA内切核酸酶嘧啶内切核酸酶嘧啶3端，端，留下留下3P3嘧啶单核苷酸或嘧啶单核苷酸或3-嘧嘧啶核苷酸结尾的寡聚核啶核苷酸结尾的寡聚核苷酸苷酸蛇毒磷酸二酯蛇毒磷酸二酯酶酶RNA，DNA外切核酸酶外切核酸酶3端，留端，留下下3OH5单核苷酸单核苷酸牛脾磷酸二酯牛脾磷酸二酯酶酶RNA，DNA外切核酸酶外切核酸酶5端，留端，留下下5OH3单核苷酸单核苷酸大肠杆菌核酸大肠杆菌核酸外切酶外切酶单链单链DNA外切核酸酶外切核酸酶5端，留端，留下下5OH3单核苷酸及一个末单核苷酸及一个末尾二核苷酸尾二核苷酸大肠杆菌核酸大肠杆菌核酸外切酶外切酶双链双链DNA外切核酸酶外切核酸酶3端，留端，留下下3OH5单核苷酸单核苷酸第9页，此课件共28页哦第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论第10页，此课件共28页哦第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论二、核酸的酸碱性质v1、碱基的解离C的的N3有一对未共用电子，可与质子结合；有一对未共用电子，可与质子结合；C的烯醇式羟基具有释放质子的能力；的烯醇式羟基具有释放质子的能力；U的的N3酸性解离的酸性解离的pK1=9.5;T的的N3酸性解离的酸性解离的pK1=9.9;A的的N1pK1=4.15G的的N7 pK1=3.2 N1pK2=9.6；N9 pK3=12.4第11页，此课件共28页哦第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v2、核苷的解离戊糖的存在增强了碱基的酸性解离：戊糖的存在增强了碱基的酸性解离：A的的N1pK1由由4.15降为降为3.63；C的的pK1由由4.6降为降为4.15；第12页，此课件共28页哦第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论3、核苷酸的解离HpK11.5第13页，此课件共28页哦第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v核苷酸有磷酸与碱基，为两性电介质；vU的碱基碱性极弱，不能形成兼性离子；的碱基碱性极弱，不能形成兼性离子；vA,G,C中，pK1：第一磷酸基：第一磷酸基-PO3H2的解离；的解离；pK2：含氮环：含氮环N+H-的解离；的解离；pK3：第二磷酸基：第二磷酸基-PO3H-的解离；的解离；故其故其pI（pK1+pK2）2vDNA变性双链打开后，碱基即参与酸碱滴定。变性双链打开后，碱基即参与酸碱滴定。第14页，此课件共28页哦第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论三、核酸的紫外吸收vPy和Pu有共轭双键，使 碱基、核苷、核苷酸和核酸能吸收紫外光，最大吸收峰为能吸收紫外光，最大吸收峰为260nm260nm。不同核苷酸不同核苷酸第15页，此课件共28页哦第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论A260CL公式中，公式中，A A260为光密度为光密度，为，为260260nmnm处的碱苦摩尔消光系数处的碱苦摩尔消光系数C C，为每升溶液中碱基的摩尔数，为每升溶液中碱基的摩尔数L L，为比色杯内径的厚度，为比色杯内径的厚度如：已知鸟嘌呤溶液的如：已知鸟嘌呤溶液的A A2602600.3250.325，7.2X107.2X103 3，L L1 1cmcm，则：则：C C0.325/(7.2X100.325/(7.2X103 3X1)X1)4.5X104.5X10-5-5（mol/lmol/l）紫外光区最大吸收：紫外光区最大吸收：260nm，定性定量分析，定性定量分析第16页，此课件共28页哦第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论一、核酸的一般理化性质一、核酸的一般理化性质 v核酸具有酸性；核酸具有酸性；v粘度大；粘度大；第17页，此课件共28页哦第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v 在理化因素作用下，在理化因素作用下，DNADNA双螺旋的两条互补链松散而分双螺旋的两条互补链松散而分开成为单链，从而导致开成为单链，从而导致DNADNA的理化性质及生物学性质发生的理化性质及生物学性质发生改变，这种现象称为改变，这种现象称为DNADNA的变性的变性(denaturation)。v变性时维持双螺旋稳定性的变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂氢键断裂，碱基间的堆积力，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。第18页，此课件共28页哦第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v增色效应：指增色效应：指DNA变性后对变性后对260nm紫外光的紫外光的光吸收度增加的现象；光吸收度增加的现象；v旋光性下降；旋光性下降；v粘度降低；粘度降低；v生物学功能丧失或改变。生物学功能丧失或改变。v引起引起DNADNA变性的因素主要有：变性的因素主要有：高温，高温，强强酸、强碱，酸、强碱，有机溶剂等。有机溶剂等。vDNADNA变性后的性质改变：变性后的性质改变：第19页，此课件共28页哦第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v DNADNA的变性温度的变性温度：加热：加热DNADNA溶液，使其对溶液，使其对260nm260nm紫紫外光的吸收度突然增加外光的吸收度突然增加，达到其最大值一半时，达到其最大值一半时的温度，就是的温度，就是DNADNA的的变变性温度（融解温度，性温度（融解温度，TmTm）。第20页，此课件共28页哦第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v TmTm的高低与的高低与DNADNA分子中分子中G+CG+C的含量的含量有关，有关，G+CG+C的含量的含量越高，则越高，则TmTm越高越高。Tm69.3+0.41(GC)12nd第21页，此课件共28页哦第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v将热变性后的将热变性后的DNADNA溶液溶液缓慢冷缓慢冷却，却，在低于变性温度约在低于变性温度约25253030的条件下保温一段时间（的条件下保温一段时间（退火退火），则变性的两条单链），则变性的两条单链DNADNA可以重新互补而形成原来的双可以重新互补而形成原来的双螺旋结构并恢复原有的性质。螺旋结构并恢复原有的性质。第22页，此课件共28页哦第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v将变性将变性DNADNA经退火处理，使其重新形成双螺旋经退火处理，使其重新形成双螺旋结构的过程，称为结构的过程，称为DNADNA的复性的复性。第23页，此课件共28页哦第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v 两条来源不同的单链核两条来源不同的单链核酸（酸（DNA或或RNA），只），只要它们有大致相同的互补要它们有大致相同的互补碱基顺序，经退火处理即碱基顺序，经退火处理即可复性，形成新的杂合双可复性，形成新的杂合双螺旋，这一现象称为螺旋，这一现象称为核酸核酸的分子杂交的分子杂交。第24页，此课件共28页哦第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v 核酸杂交可以是核酸杂交可以是DNA-DNA，也可以是，也可以是DNA-RNA杂交杂交。v 不同来源的，具有大致相同互不同来源的，具有大致相同互补碱基顺序的核酸片段称为补碱基顺序的核酸片段称为同同源顺序源顺序。第25页，此课件共28页哦第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论v 利用核酸的分子杂交，可以确定或寻找不同物种中利用核酸的分子杂交，可以确定或寻找不同物种中具有同源顺序的具有同源顺序的DNA或或RNA片段。片段。v 常用的核酸分子杂交技术有：常用的核酸分子杂交技术有：Southern杂交杂交（鉴别（鉴别DNA）及）及Northern杂交杂交（鉴别（鉴别RNA）、原位杂交、斑点杂交、原位杂交、斑点杂交等。等。v在核酸杂交分析过程中，常将已知顺序的核酸片段在核酸杂交分析过程中，常将已知顺序的核酸片段用放射性同位素或生物素进行标记。这种带有一定用放射性同位素或生物素进行标记。这种带有一定标记的已知顺序的核酸片段称为标记的已知顺序的核酸片段称为探针探针。第26页，此课件共28页哦第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论问问 题：题：1 1、DNADNA热变性有何特点？热变性有何特点？T Tm m值表示什么？值表示什么？2 2、在、在pH7.0pH7.0，0.165mol/L NaCl0.165mol/L NaCl条件下，测得某一条件下，测得某一DNADNA样品的样品的TmTm为为89.3 89.3。求出四种碱基百分组成。求出四种碱基百分组成。3 3、DNADNA和和RNARNA的一级结构有何异同？的一级结构有何异同？4 4、简述、简述tRNAtRNA二级结构的组成特点及每一部分的功能。二级结构的组成特点及每一部分的功能。第27页，此课件共28页哦第十二章、核酸第十二章、核酸通论通论感谢大家观看感谢大家观看第28页，此课件共28页哦
