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SAR11 甘氨酸与丝氨酸营养缺陷型相关的独特的甘氨酸激活的核糖开关原文来源：H.James Tripp，Michael S.Schwalbach，Michelle M.Meyer et al.Unique glycine-activated riboswitch linked to glycine-serine auxotrophy in SAR11.Environ Microbiol.2009 January;11(1):230 238.摘要：远洋杆菌属的海洋细菌的基因组序列及以后的分析表明，虽然它有一个同寄生菌一样小的基因组，但它拥有代谢全部模式，这使它成为海洋中最成功的独立生存模式生物。早期基于 SAR11细胞代谢重建的报告表明，SAR11是能产所有氨基酸的原养型微生物。但是，这里我们报告的实验证据显示,Cand.P.ubique?是有效的甘氨酸和丝氨酸营养缺陷型。以加入葡萄糖和醋酸盐以提供有机碳，再加入的 125nM到1.5M甘氨酸，含过量其他营养成分的海水为培养基，结果细胞密度的变化呈线性增加，从1.14106/ml增加到 8.16 106/ml(R2=0.992)。丝氨酸能被 1.5M甘氨酸取代了，,Cand.P.ubique?中包含了之前描述的苹果酸合成酶的甘氨酸激活的核糖开关，SAR11基因组中存在一段异常的基因组序列。苹果酸合成酶在中心代谢中起着至关重要的作用，其作为TCA的中间产物能通过乙醛酸循环再生。体外分析表明，该核糖开关对非封闭的结构类似物如甘氨酸甜菜碱、苹果酸，乙醛酸盐，乙醇酸盐、丙氨酸、丝氨酸、或苏氨酸的甘氨酸做出了唯一的解释。我们认为,Cand.P.ubique?是一种以细胞内甘氨酸水平调节它用于合成及能量的碳素的用量的甘氨酸-丝氨酸营养缺陷型。比较基因组学和宏基因组学表明，这些结论可能贯穿大部份SAR11分化枝。简介因为 SAR11 细菌是地球上海洋中最丰富和世界性的异养细菌(Morris et al.,2002)，他们的碳代谢对全球生态中具有重要作用。初步研究表明，SAR11 含有合成所有氨基酸的基因，包括甘氨酸和丝氨酸，基于所谓的苏氨酸醛缩酶的存在弥补了 serBC基因的丢失(Giovannoni et al.,2005)。然而，我们注意到在我们的硫限制研究中增加 nm的甜菜碱到包含一个混合的其他mm碳源的培养基中能最大程度的增加细胞密度(Tripp et al.,2008)。这个观察结合最近的报告表明SAR11分化枝的成员可能有多个甘氨酸结合的核糖开关(Kazanov et al.,2007)，这促使我们进一步研究 SAR11 中甘氨酸-丝氨酸的新陈代谢。含碳化合物的甘氨酸和丝氨酸可以对高达15%的碳被生长在葡萄糖上的大肠杆菌吸收做出解释(Pizer 和 Potochny,1964年)。除了直接用于蛋白质合成外，甘氨酸和丝氨酸还充半胱氨酸前体、嘌呤、血红素组、磷脂、色氨酸(Ravnikar and Somerville,1987)，以及作为蛋氨酸和胸腺嘧啶的生物合成的甲基来源。因此，他们是糖酵解/糖质新生等主要新陈代谢分支出的生物合成中间体的前体的一种。在大肠杆菌中、甘氨酸和色氨酸的生物合成是经过serABC 基因的产物的催化后从糖酵解中间体3-磷酸甘油酸酯到丝氨酸,再经过 glyA/shmt 基因产物催化后从丝氨酸到甘氨酸，当葡萄糖或醋酸盐作为唯一碳源时大肠杆菌也可以利用这种途径(Zhao and Shimizu,2003)。两个交替的途径存在于异样生物的甘氨酸和色氨酸的生物合成是众所周知的。酵母和大肠杆菌突变体这些丢失glyA 或 SHMT基因的菌拥有能够降低油苏氨酸到甘氨酸的苏氨酸醛缩酶(ltaE or GLY1)。名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 1 页，共 3 页 -将,Cand.P.ubique?中乙醛酸盐代谢的假定途径与大肠杆菌中已知的途径相比可以发现，甘氨酸在,Cand.P.ubique.?乙醛酸盐支路中扮演一种异常的调节角色，大肠杆菌乙醛酸代谢有两个操纵子：glcCDEFGB 和 aceBAK，它们通过醋酸盐和乙醇酸盐诱导(Pellicer et al.,1999)。通常，乙醛酸循环活动是在生长在醋酸上调节的，增加从乙酰辅酶A 到 TCA 循环 中间体这两种碳源的流量。glcCDEFGB 控制着乙醇酸盐到乙醛酸盐的氧化途径，苹果酸来源于乙醛酸和乙酰辅酶 A 的信息由 glcC 控制,而在,Cand.P.ubique.?中 glcC丢失了。aceBAK 操纵子控制由异柠檬酸裂解酶导致的异柠檬酸形成乙醛酸，而苹果酸,在某种程度上是被 aceK 产物控制的，而,Cand.P.ubique.?中 aceK 亦丢失，事实上，,Cand.P.ubique?只保留来自第一个操纵子的aceA(异柠檬酸裂解酶）和来自第二个操纵子的 glcDEF（乙醇酸氧化酶）和glcB（苹果酸合成酶）的基因，这赋予,Cand.P.ubique?用乙醛酸途径把乙醇酸或异柠檬酸转化为苹果酸的能力，但没能弄清大肠杆菌中控制这种途径活化的关键调节酶。取而代之的是一种新型的位于glcB（苹果酸合成酶）上游的甘氨酸激活的核糖开关，表明甘氨酸在控制乙醛酸支路和,Cand.P.ubique.?的主要碳素代谢中扮演一种新型的角色。为了进一步研究 SAR11 中 glycine-serine代谢，在添加甘氨酸、丝氨酸、及过量的其潜在的前体与所有其他营养情况下，我们检测了最大细胞密度。正如先前的研究(Tripp et al.,2008)，当所有其他的养分都过量，如果最大细胞密度随这种营养的增加而相应增加，我们可推断这种营养是必须的。与甘氨酸裂解复合体上游的甘氨酸核糖开关一样，为了确定配合基德特异性和灵敏性，我们也对这个位于苹果酸合成酶上游不寻常的甘氨酸核糖开关进行体外结构探测实验。试图确定苹果酸合成酶核糖开关分布的广泛性，我们在 NCBI 非冗余蛋白数据库和发源于 SAR11 组的环境 DNA 片段中寻找类似序列。结果与讨论甘氨酸和丝氨酸生物合成的基因组分析对 SAR11 基因组和宏基因组学数据进行分析后显示，细菌合成甘氨酸和色氨酸常见途径的基因失踪可能不包括苏氨酸的脱氢酶和磷酸甘油酸酯脱氢酶的基因(表 1)。在 SAR11_1366基因位点是一名 COG0111 的成员(磷酸甘油酸酯脱氢酶和相关脱氢酶)。同时，它可能是一个 D-3-磷酸甘油酸酯脱氢酶(serA)的同族体,基因 serBC 的缺失表明它很可能是一种功能不清的脱氢酶。在大肠杆菌中位于 SAR11_0689 基因位点的是一个苏氨酸醛缩酶的同族体(ltaE)，当甘氨酸合成因为击出丝氨酸羟甲基转移被抑制时，它维持大肠杆菌的贫生长(Liu et al.,1998)。然而，酵母中类似苏氨酸醛缩酶能维持所有甘氨酸和苏氨酸的生物合成(Monschau et al.,1997)。能让甘氨酸和丝氨酸甲基化和脱甲基化作用的甘氨酸羟甲基转移酶(glyA)就存在于,Cand.P.ubique?的基因组中（表 1）。因此，问题是SAR11 是否是依靠苏氨酸脱氢酶去供应足够甘氨酸以满足细胞需求的甘氨酸原养型微生物，这个问题需要靠实验来解决。添加甘氨酸的反应添加甘氨酸的分批培养实验显示，,Cand.P.ubique?实际上是在测试条件下的一种甘氨酸/丝氨酸的营养缺陷型。图一展示了一个线性的，八字形的线，在增加 nm 甘氨酸浓度且所有其他营养物质都过量后细胞浓度从1.14106增大到名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 2 页，共 3 页 -8.16106细胞(R2=0.992)。直接测量溶解游离氨基酸含量(DFAA)表明丝氨酸的浓度为 18.5 2.4 nM，甘氨酸的浓度为 42.4 1.2 nM 和在经过过滤和高压灭菌后其他氨基酸也存在于海水中。这些浓度和其他报告者报告的原位浓度相当(Mopper and Lindroth,1982;Fuhrman and Ferguson,1986;Pomeroy et al.,1990)。我们推论,这些 DFAA 展示培养基观测到没有甘氨酸被加了上去。词组“条件营养缺陷型”已被当做一种描述特定条件下的酵母突变体(Monschau et al.,1997)，这个概念可能有效的应用于,Cand.P.ubique.?甘氨酸激活的核糖开关甘氨酸核糖开关是典型的位于甘氨酸裂解系统(gcvTHP 操纵子）上游的，在甘氨酸存在下激活基因表达，以确保甘氨酸不被分解,除非其细胞内浓度超过一定限度的(Barrick et al.,2004)。然而，我们在之前的乙醛酸循环酶和苹果酸合成酶的基因区 域发现 了第 二种假 定的甘 氨酸核 糖开关，这 个在不 久就被 报道了(Kazanov et al.,2007)，并决定确定其配体。我们均衡一组马尾藻海最好的,Cand.P.ubique?取样点的环境序列的glcB 基因上游区域发现对核甘酸有显著的保护(图2)。这个保护让我们证实这个基因区域的mRNA 的折叠模式符合相串联、合作、甘氨酸绑定核糖开关的排列顺序(Mandal and Breaker,2004)，尽管这个甘氨酸绑定核糖开关的长度比另一些曾报道过的短20%，但可能是由于基因的流线型化。搜索 NCBI nr 数据库中备案透露，只有一个顺序生物在苹果酸合成酶上游有潜在的甘氨酸合成开关。为了确定推断的与苹果酸合成酶相关的甘氨酸结合核糖转换的配体特点，我们在没有配体和有一系列不同的潜在的配体包括甘氨酸的情况下，进行了体外探针实验。实验通过改变随机RNA 切割速率来检测由于配体结合到RNA 上而导致的结构变化。RNA 的结构化的区域比未结构化的区域更有利于被保护免受切割。一旦配体结合，RNA 结构发生改变，导致不同的随机切割产物。从这个体外实验看来，很显然在,Cand.P.ubique?中核糖转换相关的苹果酸合成酶有选着性的与甘氨酸结合。没有其他检测的配体在浓度达到1mM 是诱导 RNA 结构变化，表明它们不能与 RNA 结合以改变基因表达。名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 3 页，共 3 页 -