植物生理学实验七.ppt
植物生理学实验七现在学习的是第1页，共11页实验七实验七 植物体内游离脯氨酸含量的测定植物体内游离脯氨酸含量的测定 现在学习的是第2页，共11页实验类型：基础验证型实验类型：基础验证型实验学时：实验学时：3学时学时一一 实验目的实验目的1.了解植物体内游离脯氨酸含量的变化，在一定程度上可以判断了解植物体内游离脯氨酸含量的变化，在一定程度上可以判断逆境对植物的危害程度和植物对逆境的抵抗力，也可作为植物逆境对植物的危害程度和植物对逆境的抵抗力，也可作为植物抗旱育种、抗寒育种的一项生化指标。抗旱育种、抗寒育种的一项生化指标。2.学习测定脯氨酸含量的基本原理和方法。学习测定脯氨酸含量的基本原理和方法。现在学习的是第3页，共11页二二 实验原理实验原理 在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境（干在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境（干旱、低温、高温、盐渍等）及植物衰老时，植物体内游离脯氨酸含量旱、低温、高温、盐渍等）及植物衰老时，植物体内游离脯氨酸含量可增加可增加10100倍，并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植物的倍，并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植物的抗逆性有关。因此，测定植物体内游离脯氨酸的含量，在一抗逆性有关。因此，测定植物体内游离脯氨酸的含量，在一定程度上可以判断逆境对植物的危害程度和植物对逆境的抵定程度上可以判断逆境对植物的危害程度和植物对逆境的抵抗力。抗力。采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减小了采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减小了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态（干或鲜样）其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。限制。现在学习的是第4页，共11页 在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，此缩合物在此缩合物在520nm处有最大吸收峰，可以用分光光度法测定。处有最大吸收峰，可以用分光光度法测定。现在学习的是第5页，共11页三三 主要仪器、试剂、实验材料主要仪器、试剂、实验材料仪器设备：分光光度计，水浴锅，试管，仪器设备：分光光度计，水浴锅，试管，试剂试剂:1 2.5%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和酸性茚三酮显色液：冰乙酸和 6M磷酸以磷酸以3:2混合，混合，作为溶剂进行配置，搅拌加热（低于作为溶剂进行配置，搅拌加热（低于70）溶解，冷却后置）溶解，冷却后置 棕色瓶中，棕色瓶中，4保存可使用保存可使用23d。2 甲苯，甲苯，3%磺基水杨酸溶液。磺基水杨酸溶液。3 脯氨酸标准溶液：称取脯氨酸标准溶液：称取25mg脯氨酸，用少量脯氨酸，用少量80%乙醇溶乙醇溶 解，蒸馏水定容至解，蒸馏水定容至250mL（100g/mL）。再取）。再取10ml用用 蒸馏水释定容至蒸馏水释定容至100ml（10g/mL）。材料：植物叶片。材料：植物叶片。现在学习的是第6页，共11页四四 实验步骤实验步骤1脯氨酸标准曲线制作：按下表操作脯氨酸标准曲线制作：按下表操作管号管号0 01 12 23 34 45 56 6标准脯氨酸标准脯氨酸/ml/ml0 00.20.20.40.40.80.81.21.21.61.62.02.0HH2 2O/mlO/ml2.02.01.81.81.61.61.21.20.80.80.40.40 0冰乙酸冰乙酸/ml/ml2 22 22 22 22 22 22 23%3%磺基水杨酸磺基水杨酸/ml/ml2 22 22 22 22 22 22 2显色液显色液/ml/ml4 44 44 44 44 44 44 4脯氨酸含量脯氨酸含量/g/g0 02 24 48 8121216162020 混匀后在沸水浴加热混匀后在沸水浴加热60min，冷却，向各管加入，冷却，向各管加入4ml甲苯，充分震甲苯，充分震荡荡30S，静止片刻，以萃取红色物质，待分层后吸收甲苯层以，静止片刻，以萃取红色物质，待分层后吸收甲苯层以0号管号管为对照在为对照在520nm下比色，作标准曲线。下比色，作标准曲线。现在学习的是第7页，共11页2 样品的测定样品的测定（1）脯氨酸的提取：称取待测叶片）脯氨酸的提取：称取待测叶片0.5g，加，加5ml3%磺基水杨磺基水杨酸研磨，匀浆移至离心管中，在沸水浴中提取酸研磨，匀浆移至离心管中，在沸水浴中提取10min，（提取过，（提取过程中要经常摇动），冷却后程中要经常摇动），冷却后3000r/min离心离心10min。（2）吸取）吸取0.2ml提取液于另一干净的试管中加提取液于另一干净的试管中加1.8ml，加，加2ml冰醋冰醋酸及酸及4ml酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热60min，溶液即呈，溶液即呈红色。冷却，向各管加入红色。冷却，向各管加入4ml甲苯，充分震荡，以萃取红色物甲苯，充分震荡，以萃取红色物质，静止待分层后吸收甲苯层以质，静止待分层后吸收甲苯层以0号管为对照在号管为对照在520nm下比色，下比色，得吸光度值。得吸光度值。现在学习的是第8页，共11页五五 结果计算结果计算WaVCgg）脯氨酸（/WaVCgg）脯氨酸（/WaVCgg）脯氨酸（/WaVCgg）脯氨酸（/WaVCgg）脯氨酸（/WaVCgg）脯氨酸（/式中：式中：C：由标准曲线上查得的脯氨酸的质量，：由标准曲线上查得的脯氨酸的质量，g V：提取液总体积，提取液总体积，mL a：测定液体积，测定液体积，mL W：样品质量，：样品质量，g现在学习的是第9页，共11页注意事项注意事项 配置的酸性茚三酮溶液仅在配置的酸性茚三酮溶液仅在24h内稳定内稳定,最好现用现配最好现用现配.茚三酮的茚三酮的用量与脯氨酸的含量相关用量与脯氨酸的含量相关.一般当脯氨酸含量在一般当脯氨酸含量在10ug/ml以下时以下时,显显色液中茚三酮的浓度要达到色液中茚三酮的浓度要达到10mg/ml,才能保证脯氨酸充分显色才能保证脯氨酸充分显色.测定样品若进行过渗透胁迫处理测定样品若进行过渗透胁迫处理,结果会更显著结果会更显著.此法也可用于干样品中脯氨酸含量的测定此法也可用于干样品中脯氨酸含量的测定.现在学习的是第10页，共11页六、思考题六、思考题 1 1植物组织内游离脯氨酸测定有何意义？植物组织内游离脯氨酸测定有何意义？2 2脯氨酸提取除本实验方法外，还有何方脯氨酸提取除本实验方法外，还有何方 法？测定时应作哪些改变？法？测定时应作哪些改变？现在学习的是第11页，共11页
