色谱法lcsfcce.ppt

关于色谱法LCSFCCE现在学习的是第1页，共82页4.1 4.1 高效液相色谱特点高效液相色谱特点HPLCHPLC与与GCGC比较比较对象对象 GCGC：气体和低沸点化合物，有机物总数：气体和低沸点化合物，有机物总数2020 HPLCHPLC：高沸点、热不稳定、大分子，：高沸点、热不稳定、大分子，8080 流动相流动相 GCGC：惰性气体，不与组分作用。：惰性气体，不与组分作用。HPLCHPLC：H=A+Cu。与固定相竞争作用。是改进分与固定相竞争作用。是改进分离的重要操作条件。离的重要操作条件。操作温度操作温度 GCGC：高；程序升温。：高；程序升温。HPLCHPLC：常温；恒温。常温；恒温。现在学习的是第2页，共82页W数据记录/处理 废液或收集4.2 HPLC仪器结构仪器结构 进样阀 色谱柱 流动相高压泵检测器现在学习的是第3页，共82页HPLCHPLC最重要部件最重要部件 储液罐储液罐+过滤器过滤器+高压输液泵高压输液泵+压力脉动阻尼器等压力脉动阻尼器等高压输液泵：高压输液泵：流量、压力平稳，可调范围宽。流量、压力平稳，可调范围宽。恒流泵恒流泵或或恒压泵恒压泵 恒压泵恒压泵保留时间重现性差。保留时间重现性差。恒流泵恒流泵机械注射泵机械注射泵+机械往复泵。机械往复泵。应用最多的是应用最多的是机械往复泵机械往复泵。现在学习的是第4页，共82页输液泵输液泵往复式高压恒流泵注射泵现在学习的是第5页，共82页PUMPPUMPPUMP浓度时间梯度洗脱梯度洗脱现在学习的是第6页，共82页邻苯二甲酸二酯的分离流动相：80%乙腈水溶液 流动相：100%乙腈 0-5 min，70%-90%乙腈；5-10 min，90%-100%；10-18min，100%。现在学习的是第7页，共82页防止防止柱外效应柱外效应（进样系统、连接管道及检测器等处）。（进样系统、连接管道及检测器等处）。二、进样系统二、进样系统上样位置进样位置进样环接色谱柱流动相现在学习的是第8页，共82页三、分离系统三、分离系统色谱柱色谱柱柱管柱管+固定相固定相柱管材料：玻璃、柱管材料：玻璃、不锈钢不锈钢。一般柱长一般柱长5 530cm30cm，内径，内径4 45mm5mm。现在学习的是第9页，共82页四、检测系统四、检测系统紫外检测器紫外检测器 荧光检测器荧光检测器 示差折光率检测器示差折光率检测器电导检测器电导检测器UV-Vis检测池检测器光源现在学习的是第10页，共82页检测方法特点检测方法特点现在学习的是第11页，共82页五、附属系统五、附属系统恒温、脱气、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。恒温、脱气、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。现在学习的是第12页，共82页4.3 固定相和流动相固定相和流动相现在学习的是第13页，共82页一、一、HPLC固定相固定相 材料：硅胶、氧化铝、分子筛、高聚物 结构：全多孔、表面多孔、整体、薄壳型 粒度：2100m现在学习的是第14页，共82页化学键合固定相化学键合固定相目前性能最佳、应用最广的固定相；能解决3/4分离问题。特点：传质快：表面无深凹陷；寿命长：化学键合，固定液“无流失”；有利于梯度洗脱；选择性好：键合不同官能团，提高选择性；双重分离机制：分配+吸附，视覆盖率而定；流动相酸、碱度不能过大或存在氧化剂。现在学习的是第15页，共82页键合固定相类型键合固定相类型硅氧碳键型：SiOC硅氮键型：SiN硅碳键型：SiC硅氧硅碳键型：SiOSi C耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广。功能团R：-C4,-C8,-C18,-C6H5,-CN,-NH2-SO3H,-COOH,-NR4Cl现在学习的是第16页，共82页ROHRSiCl3/RSi(OR)3功能团的引入方法功能团的引入方法SiORSOCl2RMgClSiOHSiClSiRH2NCH2CH2NH2NHCH2CH2NH2Si 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油现在学习的是第20页，共82页4.4 HPLC主要类型主要类型现在学习的是第21页，共82页正相正相反相色谱反相色谱流动相和固定相的极性流动相和固定相的极性 正相色谱正相色谱极性：流动相极性：流动相(正己烷、氯仿正己烷、氯仿)固定相固定相(C4、C8、C18、C6H5)洗脱顺序：极性洗脱顺序：极性，t tR R现在学习的是第22页，共82页一、液一、液-固吸附色谱固吸附色谱原理：吸附解吸固定相（吸附剂）：硅胶、氧化铝等。510m硅胶（容量高、机械性能好、不溶胀）。流动相：不同极性，一元或多元。对象：分子中等、油溶样品（石化：官能团、异构体）缺点：非线性吸附峰拖尾。现在学习的是第23页，共82页溶剂强度系数溶剂强度系数硅胶：硅胶：0硅胶硅胶=0770氧化铝氧化铝吸附剂：氧化铝现在学习的是第24页，共82页Ki二、液二、液-液分配色谱液分配色谱原理：类似于萃取。溶质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同分配系数。对象：多种样品。LLPCiorg iaq化学键合固定相流动相：对亲水性固定液，使用疏水流动相，反之亦然。现在学习的是第25页，共82页三、三、离子交换色谱离子交换色谱 基本原理：固定相上反复进行离子交换反应：应用：可离子化物质。IEC现在学习的是第26页，共82页IEC原理原理AAr r、BBr r：树脂相中洗脱剂离子：树脂相中洗脱剂离子A A和样品和样品B B的浓度，的浓度，AA、BB：溶液中的浓度。：溶液中的浓度。K KB/AB/A：选择性系数，：选择性系数，B B对于对于A A型树脂亲和力的大小。型树脂亲和力的大小。rrBAABABK阳离子交换：RSO3H+M+=RSO3M+H+阴离子交换：RNR4OH+X-=RNR4X+OH-一般形式：RAB RB A现在学习的是第27页，共82页 K KB/AB/A电荷越多，水合离子半径越小，电荷越多，水合离子半径越小，K KB/AB/A越大。越大。磺酸型：磺酸型：CsCs+RbRb+K K+NHNH4 4+NaNa+H H+LiLi+BaBa2+2+PbPb2+2+SrSr2+2+CaCa2+2+CdCd2+2+CuCu2+2+，ZnZn2+2+MgMg2+2+季铵盐型：季铵盐型：ClOClO4 4-I I-HS0HS04 4-SCNSCN-NONO2 2-BrBr-CNCN-ClCl-BrOBrO3 3-OHOH-HCOHCO3 3-H H2 2P0P04 4-IOIO3 3-CHCH3 3COOCOO-F F-现在学习的是第28页，共82页离子交换树脂多孔型多孔型聚聚(苯乙烯苯乙烯二乙烯基苯二乙烯基苯)，5 520m20m。表面多孔型表面多孔型惰性核惰性核+微球硅胶微球硅胶层层+交换树脂。交换树脂。薄壳型薄壳型直径约直径约30m30m的固体的固体情性核情性核+1+12m2m树脂层。树脂层。键合型键合型键合薄壳型键合薄壳型薄壳玻珠载体薄壳玻珠载体键合微粒载体型键合微粒载体型多孔微粒硅胶载体。机械性能稳定。多孔微粒硅胶载体。机械性能稳定。小粒度小粒度+高压高压快速分离。快速分离。现在学习的是第29页，共82页官能团现在学习的是第30页，共82页流动相流动相pH、离子强度、离子强度阴离子滞留次序：阴离子滞留次序：柠檬酸离子柠檬酸离子SO42C2O42-I-NO3-CrO42-Br-SCN-Cl-HCOO-CH3C00-OH-F-。柠檬酸离子洗柠檬酸离子洗脱要比用氟离子快。脱要比用氟离子快。阳离子的滞留次序：阳离子的滞留次序：Ba2+Pb2+Ca2+Ni2+Cd2+Cu2+Co2+Zn2+Mg Ag+Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+。差别不如阴离子明显。差别不如阴离子明显。样品电离度增大，保留增大。样品电离度增大，保留增大。现在学习的是第31页，共82页四、四、离子色谱离子色谱 七十年代出现，八十年代迅速发展。无机阴离子混合物。IEC两大缺点：高浓度淋洗液，时间长；检测（缺乏灵敏、快速、在线方法）。（Ion Chromatography,IC）现在学习的是第32页，共82页离子色谱法特点离子色谱法特点异于IEC：电导检测器分离柱 交换容量低 柱效高 细颗粒填料 高压输液泵 抑制柱电导检测器记录仪废液抑制柱分离柱泵进样器洗脱液现在学习的是第33页，共82页本底电导抑制本底电导抑制抑制柱：高容量离子交换剂。抑制柱：高容量离子交换剂。R R+OHOHH H+ClCl-RR+ClCl-+H+H2 2O O消除流动相本底电导消除流动相本底电导R R+一一OHOHM M+ClCl-RR+ClCl-+M+M+OHOH-OH-淌度为淌度为Cl-的的2.6倍倍连续抑制装置图泵OH-再生液MClHClR+-OH-HO-R+MOHH2O现在学习的是第34页，共82页非抑制型非抑制型离子色谱离子色谱 抑制型：分离柱树脂交换容量0.010.05mmol/g谱带展宽 抑制柱再生 非抑制型:分离柱交换容量0.0070.07mmol/g流动相：电导率极低溶液（110-4510-4M苯甲酸盐）。现在学习的是第35页，共82页离子色谱的应用离子色谱的应用流动相：0.003molL-1 NaHCO3/0.0024 molL-1 Na2CO3，138 mL/hr。20分钟七种离子（350 ppm）。现在学习的是第36页，共82页五、五、离子对色谱离子对色谱原理：溶质离子+对(反)离子离子对化合物(疏水性)两相分配；离子对形成机理；离子交换机理；离子相互作用机理。对离子：阴离子：烷基铵（如(H9C4)4N+、H33C16N+(H3C)3）阳离子：烷基磺酸基（如H13C6SO3Na）ion pair chromatography，IPC现在学习的是第37页，共82页反相离子对色谱反相离子对色谱水相水相有机相BABAABK 有机相水相水相BABA-KAB操作简便操作简便（pH、反离子种类、浓度）、反离子种类、浓度）选择性。选择性。发展迅速，应用广泛。发展迅速，应用广泛。组分保留随KAB和B+水相的增大而增大水相BKVVcckABmSms现在学习的是第38页，共82页六、尺寸排阻色谱六、尺寸排阻色谱Size Exclusion Chromatography，SEC体积、空间、分子排阻（斥）色谱、凝胶过滤色谱M.W.tRtR是分子尺寸的函数；相对分子质量差别必须大于10；保留时间短，峰窄；固定相与分子间作用力趋于零，柱寿命长。现在学习的是第39页，共82页SECSEC固定相固定相软质凝胶葡聚糖、琼脂等流动相：水常压半硬质凝胶苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物流动相：非极性有机溶剂硬质凝胶多孔硅胶、多孔玻珠等化学稳定、热稳定、机械强度大较高流速 现在学习的是第40页，共82页七、亲和色谱法七、亲和色谱法（affinity chromatography，AC）亲和色谱法示意图现在学习的是第41页，共82页八、制备型液相色谱八、制备型液相色谱获得高纯物质（mgg）preparative liquid chromatography仪器结构与分析型一样，但泵流量大进样量大制备柱制备柱：内径2050mm，柱长50cm；半制备柱：内径8mm，长度15 30cm。柱后馏分收集器现在学习的是第42页，共82页柱容量柱容量(负荷负荷)组分收集：主峰，可获得良好分离；1.小峰，富集再次分离制备。柱容量：分析柱：不影响柱效时的最大进样量；制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量；超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。提高制备效率限度：n/2或90%k现在学习的是第43页，共82页九、分离类型的选择九、分离类型的选择分子量2000溶于水SEC，水为流动相不溶于水SEC，非水流动相分子量 HPLC（流体低粘度）；峰展宽 SFC GC（流体高粘度）柱温：SFC 105塔板/m)。快速散热，电压升高，电场推动力大CE特点：仪器简单、易自动化分离效率高、速度快耗样少应用范围广现在学习的是第56页，共82页5.2.1 5.2.1 CECE基本原理基本原理现在学习的是第57页，共82页一、电泳一、电泳粒子电荷-q，电场强度-E，离子在电场中的迁移速率-vep；电场力：FE=qE阻力：F=fvep匀速运动：qE=fvep现在学习的是第58页，共82页二、电渗与电渗流二、电渗与电渗流固-液接触，表面带相反电荷双电层。电渗现象：施加电压时，离子溶剂化，引起溶液整体移动。电渗现象中整体移动的液体叫电渗流(electroosmotic flow，简称EOF)。现在学习的是第59页，共82页CE中的EOFE，溶液整体向负极移动，速度v电渗流。电渗淌度eo=r/r相对介电常数。veo=eoE实际分析v电渗流=Leff/teoLeff毛细管有效长度；teo电渗流标记物迁移时间。现在学习的是第60页，共82页电渗流的流形CE，整体移动，平流，塞式流动；LC，层流，抛物线流型。塞流层流现在学习的是第61页，共82页EOF在CE中的作用表观迁移速率vapp：阳离子：v+=eo+ep阴离子：v-=eo-ep中性粒子:0=eo阴、阳离子、中性分子同时分离；电渗流波动重现性；一般离子veo=57 vep，EOF大小、方向分离效率、选择性。控制电渗流非常重要!现在学习的是第62页，共82页影响电渗流的因素影响电渗流的因素电场强度：veo=eoE毛细管材料：表面电荷电解质pH：pH增大，电离，veo离子种类、强度：双电层、粘度、焦耳热。I，veo毛细管改性表面键合离子基团；添加剂：表面活性剂。可改变 veo大小、方向。(阳离子表面活性剂管壁荷正电EOF反转)。有机溶剂（甲醇、乙腈），veo温度：焦耳热。1 2%3%现在学习的是第63页，共82页三、三、区带展宽区带展宽纵向扩散2=2Dt进样的影响：样品长度=毛细管总长1%2%焦耳热温度梯度破坏塞流。防止：减小柱径；强制散热。溶质与管壁间的作用吸附。防止：100-1000倍溶质浓度的两性离子。其他影响因素电分散作用：溶质区带、缓冲溶液区带电导不同。“层流”现象：毛细管两端高度不一。影响分离效率band broadening现在学习的是第64页，共82页四、有关四、有关参数参数迁移时间（保留时间）VLLELLtapeffapeffapeff分离效率，CE中，仅存在纵向扩散，2=2DtDELLneffapeff2)(2 扩散系数小的溶质生物大分子！vap：表观迁移速率；V：电压；Leff：毛细管有效长度；L：总长。22/154.5YtnR实际计算现在学习的是第65页，共82页分离度DELnvvneffap177.044)(177.0177.0eoepeffapeffDELDEL2/)(1212WWttR 影响因素有效淌度差电压强度E 毛细管有效长度4/4)(4vLvvtLWLReff实际测量现在学习的是第66页，共82页五、主要仪器部件五、主要仪器部件高压电源：030 kV，稳定、可调、直流毛细管柱：玻璃、熔融石英、聚四氟乙烯。20300m。检测器 类型 检测限/mol 特点紫外-可见 10-1310-15 二极管阵列，光谱信息荧光 10-1510-17 灵敏度高，样品衍生激光诱导荧光 10-1810-20 灵敏度极高，样品衍生电导 10-1810-19 离子，需专用装置现在学习的是第67页，共82页六、六、CE进样方式进样方式 流体力学方式进样进样端加压 出口端抽真空 电压进样黏度大的试样电歧视现象 扩散进样现在学习的是第68页，共82页5.2.2 5.2.2 CECE分离模式分离模式现在学习的是第69页，共82页1 1、毛细管区带电泳、毛细管区带电泳基本模式，应用最广；迁移速度=电泳和电渗流速度矢量和阳离子：电泳、电渗方向一致，往负极迁移；中性粒子：无电泳，往负极迁移；阴离子：电渗、电泳方向相反 eoep，往负极迁移 eoep，往正极迁移 eo电泳且方向相反，胶束慢速向负极移动；组分在胶束相和溶液(水相)间分配，疏水性，tR越接近于胶束。分离模式：色谱+电泳 胶束拟固定相。现在学习的是第72页，共82页 色谱+电泳流动相驱动力：电渗流 开管毛细管电色谱：壁上键合或涂渍固定相；填充柱毛细管电色谱。4 4、毛细管电色谱、毛细管电色谱capillary electrochromatography，CEC+-+-CEC=HPLC+CZEpacked columnopen-tubular columnmonolithic columnEOFEOFEOF现在学习的是第73页，共82页等电点：两性电解质净电荷为0时的pH值。正极稀H3PO4，负极稀NaOH；H+负极，OH-正极；H+OH-H2O;5 5、毛细管等电聚焦、毛细管等电聚焦capillary isoelectric focusing，CIEF样品聚焦分离浓缩一体电渗流合成两性电解质混合物R+负极，R-正极停于等电点建立pH梯度现在学习的是第74页，共82页前导离子、尾随离子；其他离子位于两者之间；同速前进；不同离子形成不同电场强度(=E)的区带；特点：界面明显，富集、浓缩作用；应用不多。6 6、毛细管等速电泳、毛细管等速电泳capillary isotachophoresis，CITP前导离子尾随离子现在学习的是第75页，共82页5.2.3 CE的应用与进展的应用与进展现在学习的是第76页，共82页一、离子分析一、离子分析4.5min，24种阳离子36.5cm75m ID，35kV。1mmol.L-14-甲基苄氨+15mmol.L-1乳酸(pH4.8)，UV214nm1、K+，2、Ba2+，3、Sr2+，4、Ca2+，5、Mg2+，6、Mn2+，7、Cd2+，8、Co2+，9、Pb2+，10、Ni2+，11、Zn2+，12、La3+，13、Ce3+，14、Pr3+，15、Nd3+，16、Sm3+，17、Gd3+，18、Cu2+，19、Dy3+，20、Ho3+，21、Er3+，22、Tm3+，23、Yb3+，24、Lu3+现在学习的是第77页，共82页阴离子分析问题：电泳、电渗相反，SO42-、Cl-、F-等，vepveo 电渗流改性剂：十六烷基三甲基溴化胺等 3.1min，36种阴离子60cm50m ID，-30kV。铬酸盐+OFM-BT(pH8.0)，UV214nm1、S2O32-，2、Br-，3、Cl-，4、SO42-，5、NO2-，6、NO3-，7、钼酸根，8、叠氮根，9、WO42-，10、FPO32-，11、ClO3-，12、柠檬酸根，13、F-，14、甲酸根，15、磷酸根，16、亚磷酸根，17、次氯酸根，18、戊二酸根，19、邻苯二甲酸根，20、半乳糖酸根，21、碳酸根，22、乙酸根，23、氯乙酸根，24、乙基磺酸根，25、丙酸根，26、丙基磺酸根，27、天冬酸根，28、巴豆酸根，29、丁酸根，30、丁基磺酸根，31、戊酸根，32、苯甲酸根，33、谷氨酸根，34、戊基磺酸根，35、D-葡萄糖酸根，36、D-半乳糖酸根现在学习的是第78页，共82页二、其他应用二、其他应用 氨基酸、蛋白质分析 药物分析 手性化合物分析 核酸分析及DNA排序 单细胞、单分子检测现在学习的是第79页，共82页detectionBufferSampleSample waste三、微流控芯片三、微流控芯片Microfluidic chipLab-on-a-chipMicro total analytical system,-TASBuffer现在学习的是第80页，共82页分离分析法重点分离分析法重点术语，塔板理论，速率理论，总分离效能指标，色谱术语，塔板理论，速率理论，总分离效能指标，色谱分离基本方程式；分离基本方程式；气相色谱：分离条件、固定相、定性（保留值、保留气相色谱：分离条件、固定相、定性（保留值、保留指数）、定量（归一化、内标法）；指数）、定量（归一化、内标法）；液相色谱：化学键合固定相、液相色谱：化学键合固定相、HPLC模式（原理及应模式（原理及应用）。用）。现在学习的是第81页，共82页感谢大家观看现在学习的是第82页，共82页