第三章基因工程载体课件.ppt

第1页，此课件共37页哦定义：在基因工程操作中，把能携带外源定义：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的进入受体细胞的DNA分子叫载体分子叫载体。第2页，此课件共37页哦（1）在宿主细胞内能独立复制，在宿主细胞内能独立复制，ori。（3）多克隆位点：多克隆位点：外源基因插入的外源基因插入的单一单一限制酶位点。限制酶位点。（7）具有较好的安全性，不能任意转移具有较好的安全性，不能任意转移。（2）有选择性标记有选择性标记 Ampr、Tetr、Kanr等等。（4）分子量小，分子量小，可容纳较大的外源基因片段。可容纳较大的外源基因片段。（5）拷贝数多，拷贝数多，方便外源基因在细胞内大量扩增。方便外源基因在细胞内大量扩增。（6）具有对受体细胞的可转移性具有对受体细胞的可转移性。第3页，此课件共37页哦 基因工程中常用的载体有基因工程中常用的载体有5类：类：质粒（质粒（plasmid）单链单链DNA噬菌体噬菌体M13 噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物 柯斯质粒（柯斯质粒（cosmid）动物病毒（动物病毒（virus）第4页，此课件共37页哦一、质粒（一、质粒（plasmid）独立于染色体以外的能独立于染色体以外的能自主复制自主复制的双链闭合环状的双链闭合环状DNA分分子子（Covalently Closed Circular DNA,ccc DNA）。并不是细胞生长所必需的，但可以赋予细胞某些抵御外界环并不是细胞生长所必需的，但可以赋予细胞某些抵御外界环境因素不利影响的能力境因素不利影响的能力，如抗生素抗性、对重金属离子的抗，如抗生素抗性、对重金属离子的抗性、分泌细菌毒素等。性、分泌细菌毒素等。分子量在分子量在1-500kb之间之间广泛存在于细菌。广泛存在于细菌。第5页，此课件共37页哦第6页，此课件共37页哦第7页，此课件共37页哦第8页，此课件共37页哦p p:质粒；质粒；BRBR：质粒两位主要质粒两位主要构建者姓氏的第一个字母构建者姓氏的第一个字母；322322：实验编号实验编号人工构建载体人工构建载体三个亲本质粒：三个亲本质粒：pMB1:出发质粒出发质粒(ColE1)pSF2124:AmprpSC101:TetrpSF2124pMB1pSC101第9页，此课件共37页哦氨苄青霉素和四环素抗性氨苄青霉素和四环素抗性24个单一克隆位点。个单一克隆位点。9个导致个导致Tetr基因失活基因失活3个会导致个会导致Ampr基因失活基因失活第10页，此课件共37页哦氯霉素氯霉素扩增之后，每个细胞可达扩增之后，每个细胞可达10003000copies 安全安全失去了转移蛋白基因失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合）。不能通过接合转移。转移。分子小，克隆能力大分子小，克隆能力大长度长度4363bp，易于纯化，可以携带，易于纯化，可以携带6-8Kb的外源的外源DNA片片段。段。具有较多的单一酶切位点（具有较多的单一酶切位点（24种）种）第11页，此课件共37页哦1987年，年，J.Messing和和J.Vieria采用采用MCS技术在技术在pBR322基础上构基础上构建的建的结构：结构：（1）来自于）来自于pBR322的的Ori（2）氨苄青霉素的抗性基因）氨苄青霉素的抗性基因(ampr)。但核苷酸序列发生了变化但核苷酸序列发生了变化（3）LacZ基因基因 编码编码半乳糖酶的半乳糖酶的肽链肽链（4）MCS区段区段（MCS）区段位于）区段位于lacZ基因中的靠近基因中的靠近5-端的一段多克隆位点。但它并端的一段多克隆位点。但它并不破坏该基因的功能不破坏该基因的功能。第12页，此课件共37页哦与与pBR322相比，相比，pUC质粒载体优点：质粒载体优点：（1）具有更小的分子量和更高的拷贝数）具有更小的分子量和更高的拷贝数 如如pUC8为为2 750bp，pUCl8为为2 686bp，控制质粒复制控制质粒复制rop基因的缺基因的缺失，平均每个细胞即可达失，平均每个细胞即可达500700个拷贝个拷贝（2）适用于组织化学法检测重组体）适用于组织化学法检测重组体 通过通过-互补互补作用，利用作用，利用菌落颜色菌落颜色筛选重组子筛选重组子。而而pBR322pBR322质粒的重组子要进行质粒的重组子要进行两步的选择。两步的选择。（3）具有多克隆位点区段（）具有多克隆位点区段（MCS）适合不同粘性末端的适合不同粘性末端的DNA片段插入，不必连接接头片段插入，不必连接接头 第13页，此课件共37页哦 释放出的蓝色物质可以将释放出的蓝色物质可以将整个菌落染成蓝色，非常整个菌落染成蓝色，非常容易辨别，如果容易辨别，如果 LacZ插插入外源基因被破坏，菌落则入外源基因被破坏，菌落则是白色的是白色的。X-Gal-半乳糖苷酶半乳糖苷酶IPTG诱导物诱导物异丙基异丙基-D-硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷 半乳糖半乳糖 5-溴溴-4-氯氯-靛蓝靛蓝第14页，此课件共37页哦第15页，此课件共37页哦Bacteriophage(phage)第16页，此课件共37页哦一、大肠杆菌的一、大肠杆菌的-噬菌体噬菌体DNA（1）线状双链）线状双链DNA，两端各有一个，两端各有一个12bp的互补单链（的互补单链（粘性末端，粘性末端，cohesive-end site），称），称cos site，粘性末端粘性末端粘连接变成粘连接变成环状环状DNA。（一）（一）-噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性1、由、由外壳包装蛋白外壳包装蛋白和和-DNA组成组成lcos位点是噬菌体包装必需序列。位点是噬菌体包装必需序列。2、-DNA的物理图谱的物理图谱48.5kb第17页，此课件共37页哦第18页，此课件共37页哦1.选用选用噬菌体作为构建克隆载体材料的依据噬菌体作为构建克隆载体材料的依据 是一种温和噬菌体。是一种温和噬菌体。能承载比较大的外源能承载比较大的外源DNA片段片段 DNA分子上有多种限制酶的识别位点分子上有多种限制酶的识别位点2.构建构建噬菌体克隆载体的技术路线噬菌体克隆载体的技术路线 用限制酶切去用限制酶切去DNA上的非必需区上的非必需区 在在DNA上非必需区内插入选择标记基因上非必需区内插入选择标记基因 建立建立DNA分子体外包装系统分子体外包装系统第19页，此课件共37页哦第20页，此课件共37页哦 （1 1）插入式载体）插入式载体只具有一个可供外源只具有一个可供外源DNADNA插入的限制酶位点的插入的限制酶位点的噬菌体。噬菌体。常用：常用：gt10、NM1149等载体等载体.（2 2）置换型载体（取代型载体）置换型载体（取代型载体）具有成对的限制酶位点，在这两个位点之间的具有成对的限制酶位点，在这两个位点之间的DNADNA区段可以被外区段可以被外源插入的源插入的DNADNA片段所取代。片段所取代。常用：常用：EMBL3EMBL3、EMBL4 EMBL4第21页，此课件共37页哦 可在可在体外包装体外包装成噬菌体颗粒，成噬菌体颗粒，高效转染高效转染大肠杆菌大肠杆菌-DNA载体的装载能力为载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒，远远大于质粒的装载量重组的装载量重组。-DNA分子的筛选较为方便分子的筛选较为方便。-DNA载体适合载体适合克隆和扩增外源克隆和扩增外源DNA片段片段，常用于，常用于 构建基因文库构建基因文库第22页，此课件共37页哦第三节、人工染色体克隆载体第三节、人工染色体克隆载体 基本元件：基本元件：含有质粒克隆载体所必需的含有质粒克隆载体所必需的第一受体第一受体（大肠杆菌）的（大肠杆菌）的质粒复制起始点质粒复制起始点；第二受体第二受体（如酵母菌）（如酵母菌）染色体染色体DNA着丝点、端粒和复着丝点、端粒和复制起始点的序列制起始点的序列.合适的合适的选择标记基因。选择标记基因。利用利用染色体的复制元件染色体的复制元件来驱动外源来驱动外源DNA片段复制的片段复制的载体。载体。酵母人工染色体（酵母人工染色体（YAC）细菌人工染色体（细菌人工染色体（BAC）第23页，此课件共37页哦 把酵母染色体与基因复制和表达有关的主要组件都组装把酵母染色体与基因复制和表达有关的主要组件都组装在质粒上，令质粒行使酵母在质粒上，令质粒行使酵母chr的转录功能和复制功能。的转录功能和复制功能。装载量为装载量为350-400kb含有的元件：含有的元件：酵母酵母自主复制序列自主复制序列(ARS)着丝粒序列着丝粒序列(cen)四膜虫四膜虫端粒端粒（tel）质粒选择标记质粒选择标记酵母系统的选择标记酵母系统的选择标记质粒复制起点质粒复制起点第24页，此课件共37页哦 第25页，此课件共37页哦 第26页，此课件共37页哦第27页，此课件共37页哦第28页，此课件共37页哦 TRP 1：色氨酸生物合成基因缺陷型：色氨酸生物合成基因缺陷型URA 3：尿嘧啶生物合成基因缺陷型：尿嘧啶生物合成基因缺陷型LEU 2：亮氨酸合成基因缺陷型：亮氨酸合成基因缺陷型第29页，此课件共37页哦 SuP4是一个是一个赭石突变（赭石突变（UAA）抑制抑制基因。基因。宿主酵母菌的宿主酵母菌的胸腺嘧啶胸腺嘧啶合成基因带有一个合成基因带有一个赭石突变赭石突变 ade2。在在赭石突变宿主赭石突变宿主中，没有外源基因插入时，中，没有外源基因插入时，sup4基因基因抑制赭石突变，则形成抑制赭石突变，则形成正常正常白色菌落白色菌落；有有外源基因插入时外源基因插入时，sup4基因遭破坏，则形成基因遭破坏，则形成红色菌红色菌落落，十分容易挑选出有，十分容易挑选出有DNA插入片段的插入片段的红色菌落，红色菌落，建成建成YAC文库。文库。第30页，此课件共37页哦第31页，此课件共37页哦第32页，此课件共37页哦就很就很难从中分离出来难从中分离出来，第33页，此课件共37页哦 1992年年Shizuya利用利用F因子的复制起点和氯霉素因子的复制起点和氯霉素抗性标记基因，在抗性标记基因，在F质粒质粒（pMBO131）基础上构基础上构建了第一代建了第一代BAC人工染色体。能够克隆和保持大人工染色体。能够克隆和保持大于于100kb的的DNA。用于：克隆大型基因簇结构用于：克隆大型基因簇结构 构建动植物基因文库构建动植物基因文库第34页，此课件共37页哦第35页，此课件共37页哦新一代新一代BAC载体为载体为7.4kb的的环状质粒：环状质粒：F因子的因子的parA，parB，parC基因以保证低拷贝的基因以保证低拷贝的BAC质粒在大肠杆菌分裂时均匀质粒在大肠杆菌分裂时均匀分配到子代细胞分配到子代细胞 oriS基因：来源于大肠杆菌基因：来源于大肠杆菌 F 因子（致育因子）的严谨因子（致育因子）的严谨型控制的复制子型控制的复制子第36页，此课件共37页哦 BAC载体容载能力一般为100-350kb,虽然容量没YAC 大，但BAC 具更多优点：1)以大肠杆菌为寄主,转化率高,构建BAC 文库比YAC 文库更容易；2)BAC 载体以环型超螺旋状态存在,从大肠杆菌中提取质粒较方便,而从酵母中分离DNA 较难；3)BAC 复制子源于F 因子,可稳定遗传,嵌合及重组现象少；4)可通过菌落原位杂交筛选目的基因，方便快捷；5)BAC 载体在多克隆位点两侧具T7 和Sp6 聚合酶启动子，可用于转录获得RNA 探针或直接用于插入片段的末端测序 第37页，此课件共37页哦