菌种的选育保存和复苏.ppt

现在学习的是第1页，共108页一、菌种的来源一、菌种的来源l 根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；菌种保藏部门索取或购买；l 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。从大自然中分离筛选新的微生物菌种。现在学习的是第2页，共108页l 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。所需要的菌种挑选出来。l 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。新进行分离纯化。l 有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。的设备与之配合。现在学习的是第3页，共108页l 从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要和基从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要和基础的步骤。础的步骤。l 到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示一个到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。试样中所包含的所有微生物总数和种类。l 在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种类的在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调整检测方菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之微生物相适应。法，以与各种不同类型的生长和代谢之微生物相适应。l 因此，建立一更为科学的和针对性不强的分离方法是因此，建立一更为科学的和针对性不强的分离方法是必要的。必要的。现在学习的是第4页，共108页(1)(1)认真考虑所需产品的特征和生产过程；认真考虑所需产品的特征和生产过程；(2)(2)制订初步的筛选标准；制订初步的筛选标准；(3)(3)将生态学方法运用到分离和筛选过程。将生态学方法运用到分离和筛选过程。现在学习的是第5页，共108页1 1、“分离什么和从哪里分离出分离什么和从哪里分离出?”?”2 2、必须充分考虑所分离微生物的生产能力、生、必须充分考虑所分离微生物的生产能力、生 长速度、生物群体培养和产品生产工艺及其长速度、生物群体培养和产品生产工艺及其 提纯的难易和费用，工业生产发酵罐中稳定提纯的难易和费用，工业生产发酵罐中稳定 性及遗传操作的难易程度等。性及遗传操作的难易程度等。3 3、选择适宜的培养分离方法和检测方法。、选择适宜的培养分离方法和检测方法。现在学习的是第6页，共108页1 1、罗列出所要分离的微生物类群；、罗列出所要分离的微生物类群；2 2、根据所采集样本的各种生态参数，描述所要分、根据所采集样本的各种生态参数，描述所要分 离的微生物之生态系统或栖息地：离的微生物之生态系统或栖息地：3 3、将若干样本分成若干类型，如植物和植物各、将若干样本分成若干类型，如植物和植物各 部，土壤部，土壤(类型和土层类型和土层)、岩石、水、昆虫和发、岩石、水、昆虫和发 酵食品等；酵食品等；4 4、罗列出所要考察和测量的环境参数，如、罗列出所要考察和测量的环境参数，如pHpH、盐、盐 分、水分、氧化还原电势及温度等；分、水分、氧化还原电势及温度等；现在学习的是第7页，共108页5 5、列出生物系统中有用的自然底物，如森林土壤、列出生物系统中有用的自然底物，如森林土壤 中的几丁质、葡萄表皮的果胶；中的几丁质、葡萄表皮的果胶；6 6、根据上述、根据上述1-51-5项中所获得的数据，设计分离方项中所获得的数据，设计分离方 法，即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然法，即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然 浸出汁和培养条件；浸出汁和培养条件；7 7、用标准方法作对照来评价生态学分离方法；、用标准方法作对照来评价生态学分离方法；8 8、根据待检材料的生态参数需要，修改已知的方法；、根据待检材料的生态参数需要，修改已知的方法；9 9、运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛选、运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛选 意义的微生物类群。意义的微生物类群。现在学习的是第8页，共108页l 定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。l 采样：有针对性地采集样品。采样：有针对性地采集样品。l 增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。培养后，在数量上占优势。l 分离：利用分离技术得到纯种。分离：利用分离技术得到纯种。l 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适度、最适pHpH值、提取工艺等。值、提取工艺等。三、新种分离与筛选的步骤现在学习的是第9页，共108页1 1、采样对象、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。腐败物品，某些水域等。现在学习的是第10页，共108页从自然界筛选现在学习的是第11页，共108页2、采样季节：、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。以温度适中，雨量不多的秋初为好。3、采土方式：、采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地 面面5-15cm处的土约处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或，盛入清洁的牛皮纸袋或 塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的 数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。以便及时分离。现在学习的是第12页，共108页 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。择一定的培养条件来控制。例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。顺利得多。厌氧或好氧、酸碱度的选择、特殊的生理特性、厌氧或好氧、酸碱度的选择、特殊的生理特性、添加特殊的抑制剂添加特殊的抑制剂现在学习的是第13页，共108页 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这步，步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分划线分离法、稀释分离法离法、稀释分离法。现在学习的是第14页，共108页l 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。业生产用菌种。现在学习的是第15页，共108页l 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。用，均需通过两年以上的毒性试验。现在学习的是第16页，共108页l 为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的细菌为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的细菌菌群，特别是分离那些在唯一微环境区域中出现的菌群，特别是分离那些在唯一微环境区域中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。菌群时，必须十分重视样本的采集。l 样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。料瓶等。四、实例自然界中细菌的分离现在学习的是第17页，共108页1 1、采样时应尽可能保持相对无菌；、采样时应尽可能保持相对无菌；2 2、所采集的样本必须具有某种代表性；、所采集的样本必须具有某种代表性；3 3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集 日期、地点以及采集地点的地理、生态参数日期、地点以及采集地点的地理、生态参数 等；等；4 4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为 真正的原地菌群的出现可能是短暂的；真正的原地菌群的出现可能是短暂的；现在学习的是第18页，共108页5 5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于44下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长。会出现消长。现在学习的是第19页，共108页l 森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层顺森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集；序采集；l 水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆筒水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面采集。如果层次要求不严格，可取离地面5 515cm15cm处处的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。l 在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢慢拔出植在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约物根，在大量无菌水中浸渍约20min20min，洗去粘附在根上的土，洗去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分上却为壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分上却为根际土样。根际土样。现在学习的是第20页，共108页l 在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、安全刀在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块，并注意片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块，并注意不要损伤周围边缘。不要损伤周围边缘。l 选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在一片叶上的取样部位。一片叶上的取样部位。l 采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相似。采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相似。将洗净的根装入采样袋中，采集根系时，一般与根际土将洗净的根装入采样袋中，采集根系时，一般与根际土样一起保存。样一起保存。现在学习的是第21页，共108页l 用于细菌检测的水样应收集于用于细菌检测的水样应收集于100m1100m1干净、灭菌的广口干净、灭菌的广口塑料瓶中。塑料瓶中。l 由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水层中采集水样。层中采集水样。l 方法是：握住采样瓶底浸入水中方法是：握住采样瓶底浸入水中30-50cm30-50cm处，然后瓶处，然后瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取出时应迅速应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶。所有水样都并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶。所有水样都应在应在24h24h之内迅速进行检测，或者之内迅速进行检测，或者44下贮存。下贮存。现在学习的是第22页，共108页1 1、加入培养基中的天然提取物种类和用量、环境生物物理学、加入培养基中的天然提取物种类和用量、环境生物物理学参数以及用于平板涂布分离样本的溶剂都会影响实验中所参数以及用于平板涂布分离样本的溶剂都会影响实验中所要分离的细菌的数量和种类。要分离的细菌的数量和种类。2 2、就分离培养基的组成而言，部分培养基中必须含有、就分离培养基的组成而言，部分培养基中必须含有10-10-50%50%的天然提取物。加入培养基中的天然提取物，部的天然提取物。加入培养基中的天然提取物，部分培养基中则应含有多种碳、氮源，如几丁质、纤分培养基中则应含有多种碳、氮源，如几丁质、纤维素或果胶。维素或果胶。现在学习的是第23页，共108页3 3、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂(如放线菌酮和如放线菌酮和制霉素制霉素)，掺加浓度一般为，掺加浓度一般为50g50gm1m1，以抑制真菌以抑制真菌的生长。的生长。4 4、琼脂平板在使用前应置于、琼脂平板在使用前应置于3737培养箱中孵育培养箱中孵育l l、2 2天。天。5 5、培养基的生物物理学参数，如、培养基的生物物理学参数，如pHpH及盐分也应调节到及盐分也应调节到与试样的生态系统参数值相近。与试样的生态系统参数值相近。现在学习的是第24页，共108页l 分离土样中的大部分细菌的分离程序中无需进行富分离土样中的大部分细菌的分离程序中无需进行富集。集。l 但对某些少数细菌则要求特殊的富集或选择技术但对某些少数细菌则要求特殊的富集或选择技术才能很好地被分离培养。才能很好地被分离培养。现在学习的是第25页，共108页l 运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活细菌生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活细菌某一特殊基因组，可以建立起若干富集技术。某一特殊基因组，可以建立起若干富集技术。l 富集可以促进抗性的产生并维持下来。富集可以促进抗性的产生并维持下来。现在学习的是第26页，共108页l 土样中细菌的富集：适度稀释后，取土样中细菌的富集：适度稀释后，取0.1m10.1m1涂布已添加涂布已添加及未添加富集底物及未添加富集底物(如几丁质、纤维素等如几丁质、纤维素等)的土浸出汁平的土浸出汁平板。板。l 植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液适植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液适度培养取样，洗涤，取度培养取样，洗涤，取1ml1ml经适度稀释后涂布平板。经适度稀释后涂布平板。l 水中细菌的分离：水样通过水中细菌的分离：水样通过0.22m0.22m无菌滤膜，取出滤膜无菌滤膜，取出滤膜用用1ml1ml无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下。用样本稀释无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下。用样本稀释液适度稀释液适度稀释,涂布平板倒置培养或滤纸压印分离法。涂布平板倒置培养或滤纸压印分离法。现在学习的是第27页，共108页l 在无菌的、用棉团塞好的广口三角烧瓶中连续培养，定期取在无菌的、用棉团塞好的广口三角烧瓶中连续培养，定期取样涂布适宜分离琼脂平板上；样涂布适宜分离琼脂平板上；l 在不同水体的水样中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋在不同水体的水样中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白质等，同样可以促进水中微生物的增殖。白质等，同样可以促进水中微生物的增殖。l 培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。l 另一富集方法是在培养烧瓶中添加细菌另一富集方法是在培养烧瓶中添加细菌“附着材料附着材料”，如无，如无菌的植物组织或土壤浸出液。菌的植物组织或土壤浸出液。l 通过改变培养温度和培养周期可选择性富集嗜冷性细菌、通过改变培养温度和培养周期可选择性富集嗜冷性细菌、中温菌和嗜高温菌。中温菌和嗜高温菌。现在学习的是第28页，共108页l 涂布的平板经培养后，如生长出菌落，则按涂布不同稀涂布的平板经培养后，如生长出菌落，则按涂布不同稀释度的稀释液所得的单菌菌落和多菌菌落对琼脂平板进释度的稀释液所得的单菌菌落和多菌菌落对琼脂平板进行分类。行分类。l 用无菌牙签将菌落转接到筛选平板上及转接至添加有少用无菌牙签将菌落转接到筛选平板上及转接至添加有少量天然浸出液的适宜保藏琼脂斜面上。量天然浸出液的适宜保藏琼脂斜面上。l 筛选平板经培养后，按生长出菌落的形态学特征如色筛选平板经培养后，按生长出菌落的形态学特征如色素、菌落形态等进行最初分组。素、菌落形态等进行最初分组。l 将认为有希望的菌落用牙签转接到另一模拟分离琼脂平板将认为有希望的菌落用牙签转接到另一模拟分离琼脂平板上进行筛选。上进行筛选。现在学习的是第29页，共108页 在长年累月的生产实践中，在培养工艺条件没有任何在长年累月的生产实践中，在培养工艺条件没有任何可见变更情况下，突然发现某些批次生产水平提高较可见变更情况下，突然发现某些批次生产水平提高较大，这就有可能是个别自然变异朝更好的方向变的细大，这就有可能是个别自然变异朝更好的方向变的细胞，在这种条件下很适应于培养条件，并逐渐显示出胞，在这种条件下很适应于培养条件，并逐渐显示出它的生长优势，这种优势的发展，促使它优良的生产它的生长优势，这种优势的发展，促使它优良的生产性能表露。进行类似新种筛选分离，达到获得新的优性能表露。进行类似新种筛选分离，达到获得新的优良生产菌种的目的。良生产菌种的目的。现在学习的是第30页，共108页工业菌种的育种：工业菌种的育种：是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现目的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。现在学习的是第31页，共108页l 诱变诱变l 基因转移基因转移l 基因重组基因重组现在学习的是第32页，共108页包括下列包括下列3 3个步骤：个步骤：(1)(1)在不影响菌种活力的前提下，有益基因型的在不影响菌种活力的前提下，有益基因型的 引入。引入。(2)(2)希望基因型的选出。希望基因型的选出。(3)(3)改良菌种的评价改良菌种的评价(包括实验规模和工业生产包括实验规模和工业生产 规模规模)。现在学习的是第33页，共108页(1)(1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系待改良性状的本质及与发酵工艺的关系(如批式如批式 或连续发酵试验或连续发酵试验)；(2)(2)对这一特定菌种的遗传和生物化学万面认识的对这一特定菌种的遗传和生物化学万面认识的 明了程度；明了程度；(3)(3)经济费用。经济费用。l 如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，则如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术：多半采用随机诱变、筛选及选育等技术：l 如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。则可选择基因重组等手段进行定向育种。现在学习的是第34页，共108页(1)(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过增加解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过增加 特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力 来提高限速酶的含量；在代谢裔途径中引伸出来提高限速酶的含量；在代谢裔途径中引伸出 新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。(2)(2)增加前体物的浓度。增加前体物的浓度。(3)(3)改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提高菌改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受种对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。力。现在学习的是第35页，共108页(4)(4)抑制或消除产品分解酶。抑制或消除产品分解酶。(5)(5)改进菌种外泌产品的能力。改进菌种外泌产品的能力。(6)(6)消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品 的结构类似物抗性。的结构类似物抗性。现在学习的是第36页，共108页l 引入强转录及翻译信号，可通过在一高效表达载体上引入强转录及翻译信号，可通过在一高效表达载体上克隆靶基因；在靶基因的上游引入强启动子；修改现克隆靶基因；在靶基因的上游引入强启动子；修改现有表达信号，提高基因效力等。有表达信号，提高基因效力等。l 诱导解除基因表达抑制的突变。诱导解除基因表达抑制的突变。现在学习的是第37页，共108页l 通过确定并改变代谢中的耗能部分通过确定并改变代谢中的耗能部分;l 由另一菌株的高效低能代谢途径代谢来实现。由另一菌株的高效低能代谢途径代谢来实现。l 赋予菌种对多种底物，特别是价廉而丰富的底物的赋予菌种对多种底物，特别是价廉而丰富的底物的利用能力，由此可降低操作费用。利用能力，由此可降低操作费用。提高菌株对底物的利用率方法：现在学习的是第38页，共108页l 营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。的变异株。l 与营养缺陷型对应的是野生型。与营养缺陷型对应的是野生型。一、基本概念现在学习的是第39页，共108页l 能满足野生型菌株正常生长的培养基称基本培养基能满足野生型菌株正常生长的培养基称基本培养基(MM)(MM)；l 在基本培养基中加入相应的营养成分的称补充培养在基本培养基中加入相应的营养成分的称补充培养基基(SM)(SM)；l 能满足各种营养缺陷型生长的称完全培养基能满足各种营养缺陷型生长的称完全培养基(CM)(CM)，如，如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。现在学习的是第40页，共108页 营养缺陷型在生产上和科学研究上用途很大。目前营养缺陷型在生产上和科学研究上用途很大。目前生产氨基酸、核苷酸的菌种都是各种类型的缺陷型。生产氨基酸、核苷酸的菌种都是各种类型的缺陷型。要研究代谢途径，育种技术都必须有营养缺陷型的要研究代谢途径，育种技术都必须有营养缺陷型的菌株为材料。菌株为材料。现在学习的是第41页，共108页l 出发菌株的选择出发菌株的选择l 处理菌悬液的制备处理菌悬液的制备l 淘汰野生型淘汰野生型l 检出缺陷型检出缺陷型l 确定生长谱确定生长谱现在学习的是第42页，共108页1 1、自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较、自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较 敏感，容易达到好的效果。敏感，容易达到好的效果。2 2、在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较、在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较 相像，也是良好的出发菌株。相像，也是良好的出发菌株。3 3、每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多、每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多 次诱变能积累较多的提高。次诱变能积累较多的提高。4 4、出发菌株开始时可以同时选、出发菌株开始时可以同时选2 23 3株，在处理株，在处理 比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。现在学习的是第43页，共108页 5 5、要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细、要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细 胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状 大部分是隐性的，特别是高产基因。大部分是隐性的，特别是高产基因。6 6、根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱、根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱 变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处 理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有 的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期 的细胞：有的作用于休止期，就可选用孢子。的细胞：有的作用于休止期，就可选用孢子。现在学习的是第44页，共108页 这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。心，洗涤，过滤。现在学习的是第45页，共108页l物理诱变物理诱变l化学诱变化学诱变 根据有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。现在学习的是第46页，共108页l 抗生素法：野生型能在抗生素法：野生型能在MMMM中生长，而缺陷型不能，中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在于是将诱变处理液在MMMM中培养短时让野生型生长，处中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。一般细菌可以采用青霉素，酵母可采保存了缺陷型。一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。用制霉菌素。l 菌丝过滤法：对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，菌丝过滤法：对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过。发芽而不能滤过。现在学习的是第47页，共108页l 原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长情原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长情况完全不同，缺陷型在况完全不同，缺陷型在CMCM上生长良好，而在上生长良好，而在MMMM上则上则不生长，野生型都能生长。不生长，野生型都能生长。l 具体方法：影印法、点种法、夹层法具体方法：影印法、点种法、夹层法 现在学习的是第48页，共108页1 1、将一较平且直径小于、将一较平且直径小于1cm1cm的金属圆筒蒙上一层灭菌的金属圆筒蒙上一层灭菌 的丝绒，用金属夹夹住，灭菌。的丝绒，用金属夹夹住，灭菌。2 2、将完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻轻、将完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻轻 一压，使之成为印模，标记方位。一压，使之成为印模，标记方位。3 3、将基本培养基平皿和完全培养基平皿在标记的、将基本培养基平皿和完全培养基平皿在标记的 同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。现在学习的是第49页，共108页4 4、将、将CMCM和和MMMM在恒温箱中培养。在恒温箱中培养。5 5、二平皿相同方位进行比较，即可发现在、二平皿相同方位进行比较，即可发现在MMMM平平 皿上长出的菌落少于皿上长出的菌落少于CMCM平板上的。平板上的。MMMM上未长上未长 而相应于而相应于CMCM上长出的那几个菌落就可能是缺上长出的那几个菌落就可能是缺 陷型。陷型。此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有一定此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有一定间隔。间隔。现在学习的是第50页，共108页l 也就是任意法。也就是任意法。l 用接种针或牙签将用接种针或牙签将CMCM上长出的菌落在上长出的菌落在MMMM和和CMCM两副两副平板上接种，依次在相应位置点种，然后一起培养，平板上接种，依次在相应位置点种，然后一起培养，观察其生长情况。观察其生长情况。l 此法结果明确，但工作量大。此法结果明确，但工作量大。现在学习的是第51页，共108页l 先在培养皿上倒一层基本琼脂培养基，凝固后涂上一先在培养皿上倒一层基本琼脂培养基，凝固后涂上一层含菌的层含菌的MMMM，凝固后再倒一薄层，凝固后再倒一薄层MMMM琼脂培养基，培养琼脂培养基，培养24h24h，将出现的菌落标记，然后倒上一层，将出现的菌落标记，然后倒上一层CMCM琼脂培养琼脂培养基，再培养。这时第二批长出的菌落就可能是缺陷基，再培养。这时第二批长出的菌落就可能是缺陷型。型。l 此法缺点是，结果有时不明确，而且将缺陷型菌此法缺点是，结果有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易。落从夹层中挑出并不很容易。现在学习的是第52页，共108页 验证确定是缺陷型后，就需确定其缺陷验证确定是缺陷型后，就需确定其缺陷因子，即生长谱测定。因子，即生长谱测定。现在学习的是第53页，共108页 将缺陷型菌株培养后，收集菌体，制备成细胞悬将缺陷型菌株培养后，收集菌体，制备成细胞悬液，与液，与MMMM培养基培养基(融化并凉至融化并凉至50)50)混合并倾注平皿。混合并倾注平皿。待凝固后，分别在平皿的待凝固后，分别在平皿的5 56 6个区间放上不同的营养个区间放上不同的营养组合的混合物或吸饱此组合营养物的滤纸圆片。培养后组合的混合物或吸饱此组合营养物的滤纸圆片。培养后会在某组合区长出，就可测得所需营养。会在某组合区长出，就可测得所需营养。个平皿测一个平皿测一个菌。个菌。现在学习的是第54页，共108页 以不同组合的营养混合物与融化凉至以不同组合的营养混合物与融化凉至5050的的MMMM培养基混合铺成平皿，然后在这些平皿上划线接培养基混合铺成平皿，然后在这些平皿上划线接种各个缺陷型菌株于各相应位置，培养后根据在种各个缺陷型菌株于各相应位置，培养后根据在这些组合长出可推知其营养因子。在这些组合长出可推知其营养因子。在5 56 6个平皿个平皿上可测上可测2020株菌以上。株菌以上。现在学习的是第55页，共108页 1 1、基因重组育种：、基因重组育种：运用体外运用体外DNADNA各种操作或修改手法获得目的基因，各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达，或者通过细胞间的相互作用，使进行复制和表达，或者通过细胞间的相互作用，使一个细胞的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移一个细胞的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给另给另个细胞的方法。个细胞的方法。现在学习的是第56页，共108页、获得待克隆的、获得待克隆的DNADNA片段（基因）；片段（基因）；、目的基因与载体在体外连接；、目的基因与载体在体外连接；、重组、重组DNADNA分子导入宿主细胞；分子导入宿主细胞；、筛选、鉴定阳性重组子；、筛选、鉴定阳性重组子；、重组子的扩增与或表达。、重组子的扩增与或表达。现在学习的是第57页，共108页 基因重组现在学习的是第58页，共108页 载体载体(vector)(vector)：是携带外源是携带外源DNADNA进入宿主细胞进行扩增和表达的进入宿主细胞进行扩增和表达的DNADNA；一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建的。一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建的。现在学习的是第59页，共108页、能在适当的宿主细胞中复制；、能在适当的宿主细胞中复制；、具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆、具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆 位点）以便外源位点）以便外源DNADNA插入；插入；、具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子；、具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子；、载体分子较小，以便体外基因操作，同时载、载体分子较小，以便体外基因操作，同时载 体体DNADNA与宿主与宿主DNADNA便于分离；便于分离；、对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应、对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应 的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元 件。件。现在学习的是第60页，共108页、对载体的复制和扩增没有严格的限制；、对载体的复制和扩增没有严格的限制；、不存在特异的内切酶体系降解外源、不存在特异的内切酶体系降解外源DNADNA；、在重组、在重组DNADNA增殖过程中，不会对它进行修饰；增殖过程中，不会对它进行修饰；、重组缺陷型，不会产生体内重组；、重组缺陷型，不会产生体内重组；、容易导入重组、容易导入重组DNADNA分子；分子；、符合重组、符合重组DNADNA操作的安全标准。操作的安全标准。现在学习的是第61页，共108页现在学习的是第62页，共108页l 在细菌中实现杂交的种类尚不多，主要是大肠杆菌，在细菌中实现杂交的种类尚不多，主要是大肠杆菌，其他还有鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、淋病奈氏其他还有鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、淋病奈氏球菌等。球菌等。l 大肠杆菌中存着致育因子大肠杆菌中存着致育因子F F，有，有F F因子为因子为F+F+，没有，没有F F因因子称子称F-F-。l F F因子存在于细胞中形式：游离状态因子存在于细胞中形式：游离状态(F+(F+细胞细胞)；整合状；整合状态，即态，即F F因子插入胞核质的一定位置上因子插入胞核质的一定位置上(Hfr(Hfr细胞细胞)。l F F因子有明显的感染性，大肠杆菌的接合，实质上是因子有明显的感染性，大肠杆菌的接合，实质上是F F因子的转移，所以因子的转移，所以F+F+和和HfrHfr称供体菌，而称供体菌，而F-F-称受体称受体菌。菌。现在学习的是第63页，共108页 1 1、酵母繁殖方式、酵母繁殖方式 酵母为单细胞型真菌，一般以出芽方式生殖，在通常情酵母为单细胞型真菌，一般以出芽方式生殖，在通常情况下，繁殖体为双倍体，但经过特定条件的诱导，可使其产况下，繁殖体为双倍体，但经过特定条件的诱导，可使其产生单倍体孢子并可出芽产生单倍体繁殖体。生单倍体孢子并可出芽产生单倍体繁殖体。现在学习的是第64页，共108页l 单倍体细胞具单倍体细胞具及及22两种交配型。两种交配型细胞经两种交配型。两种交配型细胞经其细胞壁上特定的凝聚因子诱导而进行交配，恢复为其细胞壁上特定的凝聚因子诱导而进行交配，恢复为双倍体；同一交配型细胞之间，则因细胞壁上凝集因双倍体；同一交配型细胞之间，则因细胞壁上凝集因子的存在而不能进行交配。子的存在而不能进行交配。l 在生活过程中，酵母细胞还可以形成三倍体、四在生活过程中，酵母细胞还可以形成三倍体、四倍体、多倍体或非整倍体细胞。倍体、多倍体或非整倍体细胞。现在学习的是第65页，共108页 2 2、酵母杂交、酵母杂交 一般而言，杂交育种运用了酵母的单双倍生一般而言，杂交育种运用了酵母的单双倍生活周期，将不同基因型和相对的交配型的单倍体活周期，将不同基因型和相对的交配型的单倍体细胞经诱导杂交而形成二倍体细胞，经筛选便可细胞经诱导杂交而形成二倍体细胞，经筛选便可获得新的遗传性状。获得新的遗传性状。酵母的杂交方法有孢子杂交法、群体交配法、酵母的杂交方法有孢子杂交法、群体交配法、单倍体细胞杂交法和罕见交配法。就啤酒酵母而单倍体细胞杂交法和罕见交配法。就啤酒酵母而言，运用罕见交配法更易获得结果。言，运用罕见交配法更易获得结果。现在学习的是第66页，