干细胞 (3)讲稿.ppt

关于干细胞(3)第一页，讲稿共三十三页哦干细胞干细胞(stem cells)干细胞是具有自我复制和多项分化潜能的干细胞是具有自我复制和多项分化潜能的原始细胞，是机体的起源细胞，是形成人原始细胞，是机体的起源细胞，是形成人体各种组织、器官的祖先细胞。体各种组织、器官的祖先细胞。第二页，讲稿共三十三页哦干细胞的分类干细胞的分类按来源分类按来源分类或按发育阶或按发育阶段分类段分类胚胎干细胞胚胎干细胞成体干细胞成体干细胞按分化潜能分类按分化潜能分类 多能干细胞多能干细胞 全能干细胞全能干细胞专能干细胞专能干细胞 第三页，讲稿共三十三页哦胚胎干细胞胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESCs，简称，简称ES或或EK细胞）细胞）胚胎干细胞是胚胎干细胞是早期胚胎早期胚胎（原肠胚期之前）或（原肠胚期之前）或原始性腺原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体中分离出来的一类细胞，它具有体外培养外培养无限增殖无限增殖、自我更新自我更新和和多向分化多向分化的特的特性。性。第四页，讲稿共三十三页哦7.1 胚胎干细胞胚胎干细胞 胚胎干细胞（胚胎干细胞（ES细胞）是一种细胞）是一种高度未分化高度未分化细胞细胞。它具有发育的。它具有发育的全能性全能性，能分化出成，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。无论在体外还是体内环境，无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被细胞都能被诱导分化为机体诱导分化为机体几乎所有几乎所有的细胞类型。的细胞类型。第五页，讲稿共三十三页哦7.1.1胚胎干细胞的研究概况胚胎干细胞的研究概况1958年，年，Steven通过把小鼠早期胚胎移植到通过把小鼠早期胚胎移植到129小鼠精巢或肾小鼠精巢或肾脏被膜下得到了脏被膜下得到了胚胎瘤细胞胚胎瘤细胞（embrynoic carcinoma cell,ECC）。1981年，英国的年，英国的Evans等用延缓着床的等用延缓着床的胚泡胚泡首次成功地分离了小首次成功地分离了小鼠鼠ES细胞细胞，从而拉开了，从而拉开了ES细胞研究热潮的序幕。细胞研究热潮的序幕。1995年，年，Thomson等从恒河猴的等从恒河猴的囊胚囊胚中分离建立了世界上第一中分离建立了世界上第一株灵长类动物的株灵长类动物的胚胎干细胚胎干细胞。胞。1998年，他们从接受不孕症治疗年，他们从接受不孕症治疗的夫妇所捐献的处于囊胚阶段的早期胚胎中分离出了人的的夫妇所捐献的处于囊胚阶段的早期胚胎中分离出了人的ES细胞。同年，细胞。同年，Gearhart的研究小组从选择性流产所得到的胚胎生的研究小组从选择性流产所得到的胚胎生殖腺中分离出人殖腺中分离出人EG细胞，研究证实这些细胞均具有全能性，掀起细胞，研究证实这些细胞均具有全能性，掀起了了ES细胞研究的高潮。细胞研究的高潮。1999年，年，Science将人类胚胎干细胞研究成果评为当年世界将人类胚胎干细胞研究成果评为当年世界十大科技进展之首十大科技进展之首 第六页，讲稿共三十三页哦7.1.2 胚胎干细胞的生物学特性胚胎干细胞的生物学特性 ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细胞核细胞核大大，有一个或几个核仁，胞核中多为常染色质，胞质，有一个或几个核仁，胞核中多为常染色质，胞质胞胞浆少浆少，结构简单。体外培养时，细胞排列，结构简单。体外培养时，细胞排列紧密紧密，呈，呈集落集落状生长。用状生长。用碱性磷酸酶染色碱性磷酸酶染色，ES细胞呈细胞呈棕红棕红色，而周色，而周围的围的成纤维成纤维细胞呈细胞呈淡黄淡黄色。色。细胞克隆和周围存在明显界限，形成的细胞克隆和周围存在明显界限，形成的克隆细胞彼此界限克隆细胞彼此界限不清不清，细胞表面有折光较强的脂状小滴。细胞克隆形态多，细胞表面有折光较强的脂状小滴。细胞克隆形态多样，多数呈岛状或巢状。样，多数呈岛状或巢状。第七页，讲稿共三十三页哦7.1.3 胚胎干细胞的全能性胚胎干细胞的全能性(1)指指ES细胞在解除分化抑制的条件下能参细胞在解除分化抑制的条件下能参与包括生殖腺在内的各种组织的发育潜力，与包括生殖腺在内的各种组织的发育潜力，即即ES细胞具有发育成完整动物体的能力细胞具有发育成完整动物体的能力。(2)ES细胞发育全能性的标志是细胞发育全能性的标志是ES细胞表细胞表面表达面表达时相专一性胚胎抗原时相专一性胚胎抗原（Stage specific embryonicant，SSEA），），而且可以检查到而且可以检查到OTC4基因的表达，这基因的表达，这两种两种蛋白是发育全能性的标志蛋白是发育全能性的标志。第八页，讲稿共三十三页哦(3)ES细胞的全能性的体现细胞的全能性的体现 可以形成可以形成畸胎瘤畸胎瘤；可形成可形成类胚体类胚体；可可直接分化直接分化为特定种系的细胞；为特定种系的细胞；可形成可形成嵌合体嵌合体。第九页，讲稿共三十三页哦 畸胎瘤：畸胎瘤：由种质细胞或胚胎干细胞衍生而由种质细胞或胚胎干细胞衍生而来的瘤性组织，排列结构错乱，往往含有来的瘤性组织，排列结构错乱，往往含有外、中、内三个胚层的多种组织成分。外、中、内三个胚层的多种组织成分。类胚体类胚体:是由胚胎干细胞在缺乏分化抑制剂是由胚胎干细胞在缺乏分化抑制剂的情况下形成的球状细胞团并相互融合的的情况下形成的球状细胞团并相互融合的混杂集合体。混杂集合体。嵌合体：嵌合体：一种含有两种以上基因型组织的一种含有两种以上基因型组织的机体，可能是基因突变、染色体异常分离机体，可能是基因突变、染色体异常分离或移植的结果。或移植的结果。第十页，讲稿共三十三页哦7.1.4 ES细胞的分化与调控细胞的分化与调控 1.ES细胞的分化细胞的分化 ES细胞在体外细胞在体外极易分化极易分化。ES细胞中细胞中碱性磷酸酶碱性磷酸酶（AKP）及）及端粒酶端粒酶活性活性较高，可用于较高，可用于ES细胞分化与否的鉴定。细胞分化与否的鉴定。把把ES细胞与细胞与饲养层细胞饲养层细胞共培养，可以抑制共培养，可以抑制其分化，维持其稳定的增殖状态。解除共其分化，维持其稳定的增殖状态。解除共培养，则会导致培养，则会导致ES细胞自发分化。细胞自发分化。第十一页，讲稿共三十三页哦2.ES细胞分化的调控细胞分化的调控（1）内源性调控）内源性调控 干细胞干细胞自身自身有许多调控因子可对外界信号有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖和分化，包括调节起反应从而调节其增殖和分化，包括调节细胞不对称分裂的蛋白，控制基因表达的细胞不对称分裂的蛋白，控制基因表达的核因子等核因子等。这种内源性调控主要来自这种内源性调控主要来自ES细胞内细胞内所含蛋所含蛋白白（如结构蛋白等），以及部分（如结构蛋白等），以及部分转录因子转录因子。第十二页，讲稿共三十三页哦（2）外源性调控）外源性调控 间质细胞间质细胞的的分泌因子分泌因子，能维持，能维持ES细胞增殖分化等；细胞增殖分化等；膜蛋白膜蛋白介导的细胞间互作（介导的细胞间互作（信号转导）影响信号转导）影响ES细胞分化。细胞分化。整合素整合素与与细胞外基质细胞外基质影响影响ES细胞的分布和分化方向。细胞的分布和分化方向。第十三页，讲稿共三十三页哦7.1.5 建立胚胎干细胞系建立胚胎干细胞系 1、分离、分离ES 细胞细胞（1）ES细胞的主要来源：胚泡内的细胞的主要来源：胚泡内的内细胞内细胞群群和生殖嵴中的和生殖嵴中的原始生殖细胞原始生殖细胞。第十四页，讲稿共三十三页哦 胚泡胚泡：桑椹胚的细胞在子宫腔内继续分裂，：桑椹胚的细胞在子宫腔内继续分裂，细胞数目不断增多，发育到第细胞数目不断增多，发育到第5天时已有天时已有100多个细胞，这时细胞重新排列成泡状。多个细胞，这时细胞重新排列成泡状。生殖嵴生殖嵴：脊椎动物胚胎后半部，背系膜侧面：脊椎动物胚胎后半部，背系膜侧面中胚层形成的纵行上皮加厚的细胞条。可发中胚层形成的纵行上皮加厚的细胞条。可发育为生殖腺。育为生殖腺。第十五页，讲稿共三十三页哦（2）ES细胞的分离方法：细胞的分离方法：A:免疫学方法免疫学方法 利用利用ES细胞所具细胞所具有的特殊标记，借有的特殊标记，借助荧光细胞分离器助荧光细胞分离器从单细胞悬液分离从单细胞悬液分离ES细胞。细胞。第十六页，讲稿共三十三页哦B:免疫外科学方法免疫外科学方法 利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体与补体结合后所产利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体与补体结合后所产生的对其它细胞的毒性杀伤作用，除去滋养层细胞，保留生的对其它细胞的毒性杀伤作用，除去滋养层细胞，保留ES细胞。细胞。聚集在胚胎的一端，个体较大的细胞，称为内细胞团聚集在胚胎的一端，个体较大的细胞，称为内细胞团（inner cell mass，ICM），属于），属于ES细胞，将来发育细胞，将来发育成胎儿的各种组织，而沿透明带内壁扩展和排列的，成胎儿的各种组织，而沿透明带内壁扩展和排列的，个体较小的细胞，称为滋养层细胞，不能发育成胚体，个体较小的细胞，称为滋养层细胞，不能发育成胚体，它们将来只能发育成胚外结构如，胎膜和胎盘。它们将来只能发育成胚外结构如，胎膜和胎盘。第十七页，讲稿共三十三页哦C：组织培养法：组织培养法 胚胎用外源激素处理后，所分化出的胚泡胚胎用外源激素处理后，所分化出的胚泡进行体外培养，其中的进行体外培养，其中的ES细胞垂直向上生细胞垂直向上生长，呈卵圆柱状，可显微镜下检出另培养。长，呈卵圆柱状，可显微镜下检出另培养。第十八页，讲稿共三十三页哦D：显微外科学法 用显微操作系统直接从胚泡中吸取用显微操作系统直接从胚泡中吸取ES细胞。细胞。第十九页，讲稿共三十三页哦2.ESES细胞的分化抑制培养细胞的分化抑制培养（1 1）、在）、在ESES细胞的培养过程中，一方面要给细胞的培养过程中，一方面要给以足够的营养物质以满足其增殖的需要，以足够的营养物质以满足其增殖的需要，另一方面要抑制其分化，其中前者由基础另一方面要抑制其分化，其中前者由基础培养基来解决，后者则由分化抑制物来完培养基来解决，后者则由分化抑制物来完成。成。第二十页，讲稿共三十三页哦（2）分化抑制物的选择）分化抑制物的选择目前有三种分化抑制物比较常用：目前有三种分化抑制物比较常用：饲养层（饲养层（feeder layer）条件培养基（条件培养基（conditioned medium，CM）白血病抑制因子（白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）第二十一页，讲稿共三十三页哦 饲养层细胞饲养层细胞 feeders 是将选用的细胞经是将选用的细胞经射线照射或经丝裂射线照射或经丝裂霉素霉素C（mitomycin C）处理而阻断其）处理而阻断其有丝分裂所得到的细胞层。常用的有有丝分裂所得到的细胞层。常用的有STO（一种已成系的小鼠成纤维细胞）、（一种已成系的小鼠成纤维细胞）、原代小鼠胎儿成纤维细胞、同源胎儿成纤原代小鼠胎儿成纤维细胞、同源胎儿成纤维细胞和子宫上皮细胞，其中前两种比较维细胞和子宫上皮细胞，其中前两种比较常用。常用。第二十二页，讲稿共三十三页哦 条件培养基条件培养基 条件培养基条件培养基：是将大鼠肝细胞等细胞培养一定时间后，：是将大鼠肝细胞等细胞培养一定时间后，回收细胞培养液，经一系列处理后制为贮存液，使用回收细胞培养液，经一系列处理后制为贮存液，使用时以一定比例加到时以一定比例加到ES细胞培养基中。经常用条件培细胞培养基中。经常用条件培养基取代饲养层来维持养基取代饲养层来维持ES细胞。其优点是使细胞。其优点是使ES细胞细胞直接利用培养细胞分泌到培养液中的生长因子，可消直接利用培养细胞分泌到培养液中的生长因子，可消除饲养层细胞的干扰，免受丝裂霉素除饲养层细胞的干扰，免受丝裂霉素C致癌剂的影响，致癌剂的影响，而且操作比较简单。而且操作比较简单。第二十三页，讲稿共三十三页哦 白血病抑制因子（白血病抑制因子（LIF）存在于各种组织存在于各种组织和细胞中的多功和细胞中的多功能糖蛋白。具有能糖蛋白。具有诱导粒细胞白血诱导粒细胞白血病细胞分化，抑病细胞分化，抑制胚胎干细胞分制胚胎干细胞分化等功能，用于化等功能，用于维持培养中的小维持培养中的小鼠胚胎干细胞处鼠胚胎干细胞处于未分化状态。于未分化状态。第二十四页，讲稿共三十三页哦3、胚胎干细胞的鉴定、胚胎干细胞的鉴定（1）形态学鉴定；（2）碱性磷酸酶活性鉴定；（3）体内分化实验鉴定（4）体外分化实验鉴定（5）核型分析（6）OCT基因活性鉴定第二十五页，讲稿共三十三页哦（1 1）形态学鉴定：）形态学鉴定：典型的典型的ESES细胞体积较小，有一个细胞体积较小，有一个大核，核内有一个或多个明显的核仁，胞质较少。大核，核内有一个或多个明显的核仁，胞质较少。细胞之间界限不清晰，紧密聚集呈鸟巢状克隆。细胞之间界限不清晰，紧密聚集呈鸟巢状克隆。第二十六页，讲稿共三十三页哦（2）碱性磷酸酶活性鉴定碱性磷酸酶染色（固蓝），呈阳性碱性磷酸酶染色（固蓝），呈阳性（深蓝黑色）（深蓝黑色）未分化细胞（未分化细胞（ES细胞）细胞）已分化细胞已分化细胞第二十七页，讲稿共三十三页哦（3 3）体内分化试验：）体内分化试验：将一定量培养的将一定量培养的ESES细胞注入同源动物的皮细胞注入同源动物的皮下，过一段时间后会形成组织瘤，且组织下，过一段时间后会形成组织瘤，且组织瘤内有三个胚层的细胞存在。瘤内有三个胚层的细胞存在。第二十八页，讲稿共三十三页哦（4 4）体外分化试验：）体外分化试验：将所培养的细胞制成悬液在铺有明胶的培将所培养的细胞制成悬液在铺有明胶的培养皿中培养，则贴壁生长的养皿中培养，则贴壁生长的ESES细胞会自发细胞会自发地分化为各种细胞，而悬浮生长的地分化为各种细胞，而悬浮生长的ESES细胞细胞会形成简单类胚体，然后进一步形成囊状会形成简单类胚体，然后进一步形成囊状胚体。胚体。第二十九页，讲稿共三十三页哦(5)核型分析法核型保持正常核型分析法核型保持正常 ES细胞核型保持正常细胞核型保持正常第三十页，讲稿共三十三页哦（6）OCT基因活性鉴定 OCT基因基因:ES细胞中特异性表达，常作为标细胞中特异性表达，常作为标志基因。利用志基因。利用OCT抗血清和间接免疫荧光抗血清和间接免疫荧光法可检测法可检测ES细胞。也可作为鉴定细胞。也可作为鉴定ES细胞分细胞分化与否的依据。化与否的依据。此外，此外，ES细胞发育全能性的标志：细胞发育全能性的标志：ES细胞细胞表面表达表面表达时相专一性胚胎抗原时相专一性胚胎抗原（Stage specific embryonicant，SSEA），），第三十一页，讲稿共三十三页哦4、胚胎干细胞的保持、胚胎干细胞的保持 1常规保持：即通过不断更换培养液，常规保持：即通过不断更换培养液，以传代培养方式维持以传代培养方式维持ES的快速繁殖和抑制的快速繁殖和抑制分化状态。分化状态。2冷冻保持：通过超低温冷冻保存，冷冻保持：通过超低温冷冻保存，使细胞的代谢活动完全停止，而长期保存使细胞的代谢活动完全停止，而长期保存 第三十二页，讲稿共三十三页哦感谢大家观看感谢大家观看第三十三页，讲稿共三十三页哦